DNA Polymerase貝勾自 Stratagene公司，TRIzol Reagent、SuperscriptTMIII Reverse Transcriptase、Lipof ectamine?2〇OOReagent購自 Invitrogen公司；T4DNA連接酶，PacI、 NheI、XhoI、SpeI、EcoRI等限制性內切酶均購自NEB公司；DNA快速純化/回收試劑盒購自北 京鼎國昌盛生物技術有限公司；Plasmid Miniprep kit購自BI0MIGA公司；DL15000DNA marker、DL5000DNA maker、DL2000DNA marker及pMD19-T載體均購自TaKaRa;EMCV VP1 單克 隆抗體4E2由本實驗室制備；羊抗鼠 IgG-HRP、羊抗鼠 IgG-FITC抗體購自博士得生物工程公 司。其他試劑均為分析純級產品。pEasy-simple Blunt cloning vector、DH5a感受態細胞 購自北京全式金技術有限公司。CMV-β載體由本實驗室保存。二乙烯亞胺購自sigma公司；人 淋巴細胞分離液購自上海艾研生物科技公司；新生犢牛血清購自北京民海生物公司;RMPI-1640培養基購自Sigma公司；ISA206、ISA15A佐劑購自法國Sepic公司；羊抗鼠 IgG-HRP抗體 購自博士得生物工程公司。
[0060] 2重組病毒構建
[00611 2.1引物設計與合成
[0062] 根據EMCV NJ08株全基因組序列（GenBank HM641897)，設計11條引物，分別用來擴 增覆蓋整個基因組的4個片段;其中包含一對酶切鑒定引物EcoRI-F/EcoRI-R，用于RT-PCR 擴增，酶切擴增產物鑒定C片段中引入的EcoR頂每切位點(第6243位的T變成A，突變后與突變 前密碼子均編碼同一氨基酸(Arg)，為同義突變），識別序列為GAATTC，作為感染性克隆的遺 傳標記，以便與親代病毒相區別。以上引物都由上海英駿生物技術有限公司合成，并按照其 弓丨物的量用ddH 20稀釋到一定濃度。具體引物序列見表1。
[0063] 表1 EMCV NJ08基因組全長cDNA的擴增及鑒定用引物
[0064]
Luuw」°柑體卜劃線表不限制丨生內切鰣識別序列；拈虧表不相奴的內切?;
[0066] 巧女字表示EMCV NJ08基因組對應的核苷酸位置(GenBank收錄號:ΗΜ641897)
[0067] 2.2病毒總1?熟的提取
[0068] 將EMCV NJ08株接種ΒΗΚ-21，待80%的細胞出現病變時收獲病毒。將細胞毒反復凍 融3次，按照TRIzol說明書提取EMCV的總RNA。所用的耗材需經過DEPC水以及高壓滅菌處理。 實驗操作時必須帶上一次性醫用口罩和乳膠手套，盡量保持在低溫環境中進行。具體步驟 如下：
[0069] (1)將收獲的細胞病毒液(反復凍融三次)室溫4000rpm離心5min，取離心后的病毒 上清液200yL置于1.5ml的EP管，并與800yL TRIzol試劑渦懸混勻，室溫靜置5min
[0070] (2)加入200yL的氯仿，用手反復震蕩30s;室溫靜置5min;4°C12000rmp/min離心 15min
[0071] (3)此時混合液分為三層，取最上層的水相層于新的1.5ml EP管中（切勿吸到白色 沉淀）；加入等體積的異丙醇，并混勾，室溫靜置1〇111；[11，4<€120001'11^|/1]1；[11離心101]1；[11
[0072] (4)小心棄去上清，并倒扣于吸水紙上保證上清棄除干凈，然后加入lmL75%乙醇， 4°C7500rmp/min 離心 5min
[0073] (5)將上清棄除干凈，EP管蓋敞開，使沉淀物晾干（室溫5-10min);最后加入10yL DEPC水冰上溶解5min，所得溶液即為RNA，置于-70 °C保存備用。
[0074] 2.3RT-PCR擴增目的基因片段
[0075]將上述提取的病毒總RNA作為模板，以六1?』11?』21?、以及0?1為特異性下游引物，按 照SuperscriptTMIII Reverse Transcriptase反轉錄酶的說明書，構建反應體系可獲得高 濃度的六1、82、(：片段的〇0嫩。分別以六?/^，8疋/8此8#/8 21?，0?/0?2為引物，相應的〇0嫩為 模板進行PCR反應，獲得六^:^:^丄四個片段:擴增產物經^^瓊脂糖凝膠電泳鑒定煻明交回 收目的條帶；然后利fflMVBsR為引物，將回收純化后的BdPB 2片段進行融合反應，獲得B片 段。
[0076] 使用SuperscriptTMIII Reverse Transcriptase進行反轉錄合成cDNA:模板RNA 12yL，特異性下游引物lyL，10mM dNTPs lyL，體系混勻后，置于65°C水浴作用5min，然后立 刻冰浴 3min;參照使用說明書補加 4yL 5XFirst_strand buffer、lyL0.1M DTT、lyL Superscript? III Reverse Transcriptase，將上述兩體系混合均勾，短暫離心使管壁上 的液體全部聚集于EP管底。55°C水浴溫育lh，然后70°C水浴15min。最后獲得相應片段的 cDNA，保存于-20°C備用。
[0077] 以上述反轉錄得到的cDNA為模板，參照Pfu Ultra? II Fusion HS DNA Polymerase產品說明書進行PCR擴增反應，體系為25yL:上、下游引物各lyL，10 XPfuUltra Ilreaction Buffer 2.5yL，2.5mM dNTP mixture 2.5yL，模板cDNA2yL，ddH2〇 15.5yL，Pfu Ultra? II Fusion HS DNA Polymerase 15·5μΙ^ΡΟ?反應條件為：預變性溫度95°C，2min; 變性溫度為95 °C，Tm°C退火20s，延伸溫度72 °C 30s/kb，終延伸72 °C 5min。
[0078] PCR反應退火溫度及延伸時間與擴增片段的長度以及引物的Tm值有關，以下為擴 增每個片段所選擇的退火溫度及延伸時間(表2)。
[0079] 表2每個片段對應的退火溫度和延伸時間
[0080]
[0081 ]反應結束后，取適量PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0082] 81與出片段融合反應的體系為：BiF 0.5yL，B2R O.SyUBi 0.6yL，B2 1.4yL，2.5mM dNTPs 2.5yLa〇XPfuUltranreaction Buffer 2.5yL,Pfu Ultra? II Fusion HS DNA Polymerase 0.5yL。反應條件為：預變性溫度95°C2min;變性溫度95°C20s，退火溫度58°C 20s，延伸溫度72°C3.5min進行35個循環;終延伸72°C5min。取適量PCR產物經1.0%瓊脂糖 凝膠電泳鑒定，若為目的條帶則將剩余樣品全部回收純化。
[0083] 以四個片段的特異性下游引物反轉錄獲得cDNA片段，然后以其為模板進行PCR反 應得到預期大小的四個片段，分別為六、8 132、(：片段，其中也和出片段通過融合?0?過程擴增 獲得B片段，獲得3個片段大小分別約為1120bp、5 lllbp、1556bp，用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行 分析，擴增條帶與預期相符(見圖2)。擴增片段經DNA快速純化/回收，克隆至pEasy-Simple Blunt載體中測序正確。
[0084] 2.4PCR產物回收與純化
[0085] 參照DNA快速回收/純化試劑盒的說明方法將擴增獲得的目的片段純化，具體操作 如下：
[0086] (1)在紫外燈下，用刀片切取含目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，盡量棄去多余的瓊 脂糖凝膠，置于空EP管，按照1:3重量比（即100mg凝膠塊加入300yL溶液A)加溶液A。
[0087] (2) 55-60 °C水浴1 Omin左右，使凝膠塊完全溶化，其間需振蕩2-3次以便加速溶化。
[0088] (3)加入50yL溶液B，振蕩混勻，檢驗溶液A是否夠量。
[0089] (4)將上述混合液轉移至離心柱中，靜置2min，12000rmp/min離心30s，如果一次加 不完，可分兩次離心。
[0090] (5)棄去收集管中的液體，加入500yL溶液C(使用前需向溶液C中加入100ml無水乙 醇)于離心柱中，12000rmp/min離心30s，再棄去收集管中的液體，重復該步驟。
[0091 ] (6)12000rmp/min空離lmin，甩干剩余的液體以除去殘余酒精;將離心柱置于新的 EP管中，室溫敞開EP管蓋5-10min，使酒精完全揮發。
[0092] (7)加入20-60yL已預熱的溶液D或雙蒸水（50°C左右），室溫靜置2min;12000rmp/ min離心2min，EP管底溶液即為所需的DNA，使用紫外分光光度計測定其濃度，置于-20°C保 存備用。
[0093] 2.5EMCV中間載體的構建 [0094] 2.5.1目的基因片段與載體的連接
[0095]反應體系為5yL。將回收的各目的片段分別與pEasy-simple Blunt克隆載體進行 連接，體系為:PCR產物4yL，pEasy_simple Blunt cloning vector lyL。手指輕彈混勾后， 按照說明書推薦的最佳反應溫度25°C連接作用30min。連接產物即可用或置于-20°C保存 備用。
[0096] 2.5.2轉化感受態細胞
[0097] (1)在無菌操作臺中，用移液器吸取5yL連接產物至50yL Transl-Tl感受態細胞中 (保證體積比1:1)，手指輕彈管壁混勻，置于冰浴中30min。
[0098] (2)放入42 °C水浴中熱激45s，迅速置于冰上2min。
[0099] (3)加入800yL不含抗生素的LB液體培養基，置于37°C，200rmp/min的搖床中溫育 45min〇
[0100] (4)12000rpm離心lmin，移去部分上清液，余留大約100yL液體將沉淀物重懸，并均 勻涂布于含有卡那/氨芐青霉素抗性的LB平板上，倒置于37°C恒溫箱中培養過夜。
[0101] 2.5.3陽性重組子的鑒定
[0102] (1)待平板上長出合適大小的單菌落，用小槍頭挑取4-6個單菌落分別接種于含卡 那/氨