加入含8%DMEM與2%低熔點瓊脂糖等體積 混合物，每孔2mL，置于37 °C、5 %⑶:^細胞培養箱中培養大約24h。之后每孔加入約lmLl %的 結晶紫染液，置于37°C、5%C02細胞培養箱中培養，3h后取出6孔細胞培養板加去離子水洗 凈后甩去凝膠，晾干后觀察空斑數及其大小形態，結果顯示:拯救病毒和野生病毒在BHK-21 細胞上形成蝕斑的數量、大小、形態很相似(圖8)。
[0147] 4拯救病毒小鼠致病性試驗
[0148] 將30只6周齡的雌性BALB/c小鼠，隨機分成3組，每組10只；其中2組作為攻毒組，分 別注射第5代拯救病毒rNJ08和野生毒NJ08，每只小鼠腹腔注射100yL病毒液，總量均為1 X IOUtCIDm。第3組作為對照組，腹腔注射100yL 2%DMEM細胞維持液，并保證每組分開飼養， 觀察臨床癥狀和病理變化，14天后處死所有活的小鼠，收集所有小鼠腦組織樣品(含發病死 亡小鼠），利用免疫組織化學方法檢測病毒在腦組織中的分布，應用Taq-Man Real-time PCR方法對腦組織中的病毒含量進行檢測。
[0149] 4.1臨床癥狀與病理變化
[0150] 親本病毒組小鼠在攻毒后第5天出現了明顯的臨床癥狀，主要表現為精神沉郁、流 淚、蜷縮、被毛粗亂、呼吸急促，并表現出明顯的的精神癥狀，如后肢麻痹癱瘓、震顫、轉圈 等，接種7天后小鼠全部死亡。剖檢后可發現小鼠肺臟出血充血嚴重，慢性死亡的小鼠心臟 可見白色壞死斑，腦組織充血水腫。拯救病毒組第6天有3只小鼠出現臨床癥狀，后肢麻痹癱 瘓，行走不便，但是一直未出現小鼠死亡，能緩慢恢復，剖檢小鼠病變較輕微。與親本病毒 相比，拯救病毒對小鼠的致病性和毒力表現出顯著性差異。對照組小鼠全部健活(圖9)。
[0151] 4.2免疫組化檢測病毒
[0152] 采集死亡小鼠及存活小鼠的腦組織，并去其腦膜，置于4%多聚甲醛溶液中固定 24h，然后制作組織切片，滴加抗EMCV VP1單克隆抗體(1:100稀釋），進行免疫組化試驗分析 病毒在腦組織中分布情況，結果顯示:拯救病毒和親本病毒存在于腦組織中（圖10)，說明拯 救病毒和親本病毒都能在腦組織中復制。
[0153] 4.3Real_time PCR檢測EMCV
[0154] 每組隨機挑選5只小鼠，取其相同質量的腦組織樣品，按照TRIzol說明書進行操 作，具體步驟見1.2.2。以0118〇(1(1')18為反轉錄引物，上述提取的基因組1?^作為模板，按照 M-MLV反轉錄酶(Promega)說明書操作反轉錄反應，反應體系為:5XBuffer 4yL，dNTPs 0.5 41^，01丨8〇(1(1')181以1^，病毒總1?祖14以1^-]\11^0.5以1^。先將體系中前四項樣品混勻，并短暫 離心使管壁液體聚集管底，然后70°C水浴作用5~10min;立刻取出樣品置于冰上作用2min， 再加入M-MLV 0.5ul，輕彈混勻后，短暫離心，37 °C水浴lh，即可獲得cDNA，-20 °C保存備用。 SYBR GreenI實時PCR反應體系為：取上述的cDNA 2yL，上下游各1.5yL，2XPowerSYBR Green I PCR MasterMix 10yL，ddH20 5yL。置于ABI 7300real-time PCR儀中進行反應，程 序為:預變性溫度95 °C 2min，變性溫度95 °C 15s，退火溫度60 °C lmin，進行40個循環。同時設 定陰性對照。結果顯示，拯救病毒在小鼠體內的復制能力明顯弱于親本病毒(圖11)。
[0155] 5疫苗制備
[0156] 5.1病毒增殖
[0157] 將多瓶生長狀態良好的BHK-21單層細胞用D-Hank's溶液洗滌2-3次;棄去洗液，加 入100yL EMCV rNJ08(第10代）或NJ08病毒液，37°C作用lh，棄去細胞上清，加入10mL2% DMEM維持液，放回37 °C細胞培養箱繼續培養，待80 %左右的細胞出現細胞病變即可收獲，將 細胞液反復凍融2-3次，4000rpm/min離心5min，收集細胞上清，并測定細胞上清病毒含量， 于-70°C保存備用。
[0158] 5.2病毒滴度測定
[0159] 用含2%胎牛血清的DMEM(維持液)將上述保存的rNJ08或NJ08病毒液進行10倍梯 度稀釋，選取稀釋度為10_4-10_ 12的病毒液接種96孔細胞板;每個稀釋度重復接種4孔，每孔 接種100yL;同時設立陰性對照。將96孔細胞板密封好，37 °C作用lh后，將接種物小心棄去， 再加入l〇〇yL維持液置于37°C、5%C02的溫箱中繼續培養。48h左右觀察細胞病變，按照 Reed-Muench 法計算病毒 TCIDso。結果為:rNJ08TCID5〇 為 10-8· 12/mL，NJ08TCID5Q 為 10-9· °/mL。
[0160] 5.3病毒滅活條件
[0161] 滅活條件，BEI濃度為0.002mol/L、28°C作用24h可將病毒完全滅活。
[0162] 5.4疫苗配制
[0163] 3.4.1不同佐劑滅活疫苗:將滅活的冰幾8和町08使用154154和15六206佐劑分別配 制成滅活疫苗。使用ISA15A和ISA206兩種佐劑分別將滅活的NJ08和rNJ08配制成抗原濃度 均為 107TCID5〇/ml 的四種滅活疫苗（即 rNJ08/15A、rNJ08/206、NJ08/15A、NJ08/206)，疫苗物 理性質符合要求。兩種佐劑與病毒抗原量用量比例如下：
[0164] 第一種：ISA15A佐劑與抗原量為1:4,即ISA 15A佐劑7.5ml，滅活抗原25ml，用生理 鹽水補齊至50mL。
[0165] 第二種：ISA206佐劑與抗原量比例為1:1，即ISA 206佐劑25ml，滅活抗原25ml。 ISA206疫苗外觀呈乳白色，均質乳劑，4°C保存2個月無分層及破乳現象，滴入水中呈油滴狀 不易擴散;ISA15A為水佐劑，呈淡粉紅色的均質懸液。4 °C保存時間較長，滴入水中可與水混 溶。
[0166] 3.4.2不同抗原含量疫苗配制：將冰卯8配制成每毫升含毒量為107' ()、106'()、105'()、 IO^TCIDm，加入等量ISA 206佐劑，混合均勻即可，4種疫苗命名為高劑量、中劑量、低劑量、 超低劑量疫苗，疫苗物理性質符合要求。
[0167] 6.疫苗免疫保護試驗
[0168] 6.1不同佐劑滅活疫苗小鼠免疫保護試驗
[0169] 將7 5只6周齡ICR小鼠隨機分成5組，每組15只。第1、2組分別皮下注射由I SA 15A佐 劑配制的滅活疫苗rNJ08/15A和NJ08/15A(抗原濃度均為107TCID50/0.2ml)，第3、4組分別 皮下注射由ISA206佐劑配制的rNJ08/206和NJ08/206(抗原濃度均為10 7TCID50/0.2ml)。第 5組皮下注射2%DMEM作為陰性對照。采用皮下多點注射，0.2ml/只，免疫兩次，間隔3周;首 免后3周，對小鼠尾尖采血，測定ELISA抗體水平。加強免疫后3周，每組隨機選取5只小鼠進 行眼球采血，測定ELISA抗體以及中和抗體效價；同時將其脾臟取出，分離淋巴細胞進行淋 巴細胞增殖轉化試驗測定細胞免疫水平。各組剩余的10只小鼠進行攻毒保護試驗，每只小 鼠攻毒劑量為〇.lml(NJ08株，10 6TCID50/mL，腹腔注射），均隔離飼養觀察，每天記錄小鼠發 病及死亡情況。攻毒后21天進行剖殺，觀察記錄病理變化。
[0170] 結果為:對照組小鼠在攻毒后3~5天均出現明顯臨床癥狀，主要表現為精神沉郁、 被毛粗亂、弓背及后肢麻痹等神經癥狀。各組攻毒保護率統計結果見圖16,佐劑ISA206組小 鼠存活率達到了 100%，ISA15A組存活率為80%，說明ISA206佐劑效果更好，而空白對照死 亡率為100%。
[0171] 6.2不同抗原含量疫苗小鼠免疫保護試驗
[0172] 將75只6周齡ICR小鼠隨機分成5組，每組15只。第1~4組分別皮下多點注射等體積 的由 ISA15A佐劑配制的梯度抗原濃度（107TCID50/0 · 2ml、106TCID50/0 · 2ml、105TCID50/ 0.2ml、104TCID50/0.2ml)的rNJ08滅活疫苗。第5組皮下注射2%DMEM作為陰性對照(0.2ml/ 只）。首免后3周，對小鼠尾尖采血，測定ELISA抗體水平，同時進行加強免疫，免疫劑量和方 法同首免。加強免疫后3周，每組隨機選取5只小鼠進行眼球采血，測定其ELISA抗體以及中 和抗體效價；同時將其脾臟取出，分離淋巴細胞進行淋巴細胞增殖轉化試驗測定細胞免疫 水平。各組剩余的10只小鼠進行攻毒保護試驗，每只小鼠攻毒劑量為O.lml (NJ08株， 106TCID50/mL，腹腔注射），均隔離飼養觀察，每天記錄小鼠發病及死亡情況。攻毒后21天進 行剖殺，觀察記錄病理變化。
[0173] 結果發現，攻毒后3~5天對照組及接種較低劑量組小鼠出現明顯臨床癥狀，癥狀 同3.5所述。不同抗原含量（即高劑量、中劑量、低劑量、超低劑量)疫苗小鼠保護率分別為 100%、100%、80%、40%，而空白對照死亡率為100%，結果見圖17。
[0174] 6.3ELISA抗體水平的測定
[0175] 參照一般操作方法，具體步驟如下：
[0176] (1)將純化的EMCV VP1重組蛋白（由本實驗室保存）用抗原包被液稀釋成2.0yg/ mL，每孔100yL，37°C作用2h，然后4°C過夜。
[0177] (2)棄去抗原包被液，每孔加入200yL的5 %脫脂乳，37 °C封閉2h。
[0178] (3)棄去脫脂乳，PBS清洗2~3次，每次5min，將其拍干。
[0179] (4)將小鼠血清從1:100進行2倍梯度稀釋，每孔lOOyL血清稀釋液，同時設立陰性 對照，37°C孵育lh。
[0180] (5)棄血清，PBS清洗2~3次，每次5min，將其拍干，每孔加入羊抗小鼠 IgG-HRP (PBST稀釋成 1:10000)，37°C孵育30min。
[0181] (6)棄去液體，PBS洗滌2~3次，將其拍干使每孔水分完全棄除，每孔加入100yL TMB顯色液，室溫顯色5-10min。
[0182] (7)加入50yL的2M H2S〇4終止反應，測定其ODASOnnuP/N值^2.1的最高稀釋度為該 血清的抗體滴度。并通過Spass軟件分析比較各組之間是否存在差異。
[0183] 首免后3周，各免疫組都能