節青霉素(濃度為l〇〇mg/ml)抗性的lml LB的離心管中，于37°C 200rpm/min的搖床作 用5h左右。
[0103] (2)分別用移液槍吸取lyL菌液作為模板，利用M13正向引物和片段的特異性下游 引物進行菌液PCR反應，體系為25yL。
[0104] (3 )PCR擴增條件為:95 °C預變性5min; 95 °C變性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸（時間 根據片段大小調整)進行30個循環;最后72°C延伸5min。
[0105] (4)取適量的PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，利用凝膠成像儀拍照，觀察特 異性條帶大小。
[0106] (5)如果出現較亮的特異性條帶，初步驗證該菌液含有陽性重組質粒。
[0107] 2.5.4重組質粒的小量提取
[0108]取上述含有陽性重組質粒的菌液20~30yL菌液，接種于含有卡那或氨芐青霉素 (濃度為1 〇〇mg/m 1)的5m 1 LB，置于37 °C 20Orpm/miη轉速的搖床繼續培養12-16h，按照 PlasmidMiniPrep Kit試劑盒的方法提取質粒，分別命名為pEasy-A、pEasy-B、pEasy-C，并 送公司測序。具體步驟如下：
[0109] (1)將5ml菌液分兩次離心，10000rmp/min，棄掉上清液。
[0110] (2)加入250yL Buffer A(使用前需加入RNaseA)，將沉淀于EP管底部的菌體用移 液槍反復吹打重懸。
[0111] (3)加入250yL Buffer B，將EP管反復輕柔地顛倒10次左右使其混合均勻，然后室 溫靜置5min，直至溶液粘稠而澄清。
[0112] (4)再加入350yL Buffer N，立即將混合液多次上下反轉，使溶液混合均勻，此時 會出現白色絮狀沉淀。
[0113] (5)將EP管置于高速離心機中，13000rmp/min室溫離心10min，直至上清中不含白 色沉淀，如有少量沉淀漂浮于其中，可再次離心。
[0114] ( 6 )將離心后的上清液小心轉移至帶有收集管的D N A柱中，避免吸起沉淀， 13000rmp/min室溫離心lmin，棄去收集管中的液體，離心柱重新放回收集管中。
[0115] (7)向柱中加入500yL Buffer KB，13000rmp/min室溫離心lmin，棄去濾液，將離心 柱放回收集管中。
[0116] (8)加入500yL DNA Wash buffer，13000rmp/min室溫離心lmin，棄去濾液，將離心 柱放回收集管中，重復步驟8。
[0117] (9)13000rmp/min室溫開蓋離心5min，徹底清除乙醇
[0118] (10)將離心柱置于一個新的1.5ml EP管中，向DNA柱膜中間加入50~100yL的 ddH2〇或Elution Buffer(經50°C預熱），室溫靜置2min，13000rmp/min離心lmin，再將洗脫 液加入離心柱中，13000rmp/min離心lmin，即可得更高濃度的質粒，經紫外分光光度計測定 其濃度，并于_20°C保存備用。
[0119] 2.6病毒全長cDNA克隆的構建與基因測序結果
[0120] 按照圖1的策略構建全長cDNA克隆。首先，pEasy-C質粒用PacI和Spel雙酶切，構建 連接體系利用T4連接酶將片段C克隆至用同樣酶切處理的的載體CMV-β，22 °C連接5h，轉化 Transl-Tl感受態細胞，獲得的陽性質粒命名為pCMV-C，經測序正確后保存該質粒及菌液。
[0121] 然后pEasy-B質粒經PacI和Xhol雙酶切，將酶切純化后的B片段與PacI和Xhol雙酶 切后的PCMV-C載體連接，獲得陽性質粒命名為pCMV-BC，測序正確后保存質粒和菌液。采用 同樣的方式將A片段連入pCMV-BC載體中，最后獲得含EMCV NJ08株基因組全長的cDNA克隆， 命名為PCMV-NJ08,經酶切鑒定正確后采用紫外分光光度計測定濃度，并保存于-20°C備用。
[0122] 全長質粒pCMV-NJ08經Xho I和Nhe I雙酶切鑒定，酶切產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳分 析證明獲得含了EMCV NJ08株基因組全長cDNA的克隆pCMV-NJ08,大小約為11.2kb。全長質 粒測序結果（圖3)表明5,非編碼區（5'UTR)的Poly(C)可讀長度為10nt，基因組3'末端的 Poly(A)為15個腺嘌呤核苷酸，與EMCV NJ08登陸GenBank序列比對見表3。
[0123] 表3全長cDNA與EMCV NJ08基因組序列比對
[0124]
[0125] a表示核苷酸位置及序列參考EMCV NJ08毒株(GenBank收錄號:HM641897).
[0126] |3表示沉默突變產生一個EcoRI限制性內切酶作為遺傳標記，鑒定拯救病毒（圖1).
[0127] 2.7全長cDNA克隆的轉染及病毒拯救
[0128] 將BHK-21細胞接種六孔細胞板，置于37°C、5%C02的溫箱中過夜培養;待細胞板中 的BHK-21單層細胞長至80 %左右，按照Lipof ectamine?2000轉染試劑說明書進行操作。具 體步驟如下：
[0129] (1)取出六細胞孔板，小心吸出細胞上清，并用不含血清的DMEM培養液洗滌1~2 次，放回溫箱。
[0130] (2)利用EP管構建兩個體系:a將2yg重組質粒pCMV-NJ08加入到含有500yL的EP管 中；b將3.5yL脂質體加入含有500yL DMEM培養液的EP管中，用移液槍輕柔吹打混勻，室溫靜 置 5min
[0131] (3)將步驟2中的兩個反應體系混勻，室溫靜置20min。
[0132] (4)取出細胞板，棄去細胞上清，加入上述質粒和脂質體的混合液，置于37°C、5% C02的溫箱中培養5h。
[0133] (5)棄去轉染液，換成含2 %胎牛血清的無抗生素 DMEM培養液繼續培養。
[0134] (6)每隔一段時間對其觀察，待出現細胞病變(CPE)且細胞大部分脫落時便可以收 取病毒，作為第一代病毒，命名為rNJ08，于-70°C保存備用。
[0135] 3拯救病毒鑒定
[0136] 3.1拯救病毒滴度測定
[0137] 取長有BHK-21單層細胞的96孔細胞板，用含2%胎牛血清的DMEM培養液(維持液） 對rNJ08進行10倍梯度稀釋，選取稀釋度為10- 4-10-12的病毒液接種BHK-21細胞;每個稀釋 度重復接種4孔，每孔接種100yL;同時設立陰性對照，加入100yL維持液置于37°C、5 %C02的 溫箱中繼續培養。48h左右觀察細胞病變，按照Reed-Muench法計算病毒TCID 50。
[0138] 將重組質粒pCMV-NJ08轉染BHK21細胞后培養24h，即可觀察到明顯的CPE，與親本 病毒感染產生的CPE無差異，主要表現為細胞圓縮、細胞崩解成碎片直至脫落（圖4)。將轉染 后產生拯救病毒的細胞培養液反復凍融三次，作為第一代，拯救病毒命名為rNJ08。將拯救 病毒接種BHK-21細胞，連續傳代。對第3、5、10代拯救病毒的TCID 5Q進行測定，結果為107·66~ 108· 5TCID5Q/mL，與野生病毒滴度相似。
[0139] 3.2拯救病毒遺傳標記的鑒定
[0140] 將單一的酶切位點EcoRI通過PCR方法引入至cDNA中，因此可用酶切方法區分親本 病毒與拯救病毒。拯救病毒在BHK-21上傳至第3代，細胞培養液反復凍融三次后提取總RNA， 以EcoRI-F/EcoRI-R為引物(表1)利用RT-PCR方法同時擴增拯救病毒和親本病毒基因組 5921~6777bp區域。取經割膠回收純化后的PCR產物，用EcoRI酶切初步確定該遺傳標記；用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物及酶切產物進行分析，結果顯示:野生毒的RT-PCR產 物經EcoRI單酶切不能產生兩條條帶，只得到唯一條帶;而拯救病毒的RT-PCR產物經酶切后 產生了 535bp和322bp兩個片段（圖5)。將RT-PCR產物純化后克隆至pMD19T載體中進行測序 分析，表明僅6243位點(A)與親本病毒(T)不一樣。將拯救病毒在BHK-21細胞上傳至15代后， 分別對第5、10、15代拯救病毒進行遺傳標記的鑒定，結果表明遺傳標記能夠穩定存在。
[0141] 3.3間接免疫熒光試驗
[0142] 間接免疫熒光可用來檢測位于BHK-21細胞中病毒表達的抗原蛋白。按常規方法操 作，即：取生長成良好的細胞單層的96孔細胞板，接種拯救病毒或親本病毒100yL，同時設陰 性對照，加入l〇〇yL含2 %胎牛血清的DMEM營養液，繼續培養12h，棄去細胞上清，用4°C預冷 的丙酮甲醛(體積比1:1)混合物-20 °C固定15min，PBS洗滌3次，操作需輕柔，防止細胞脫落。 加入100yL 1:100稀釋的EMCV VP1單克隆抗體(4E2)，37°C作用lh;PBS沖洗3次。加入50yL 1:100稀釋的FITC熒光標記羊抗鼠 IgG，37°C避光作用45分鐘。PBS洗滌3次，每次5分鐘;晾干 后于熒光顯微鏡下觀察，結果顯示：拯救病毒rNJ08和親本病毒分別接種BHK-21單層細胞 12h后，感染細胞呈現可見的特異性熒光，而細胞對照組則未見特應性熒光（圖6)。
[0143] 3.4病毒生長曲線
[0144] 將10代拯救病毒rNJ08與親本病毒NJ08均按102'5TCID 5Q的病毒量分別接種BHK-21 單層細胞，加入2%DMEM維持液繼續培養。每隔4小時取樣，直至接種后28h。利用Reed-Muench法測定不同時間點收集病毒的TCID 5Q，每個病毒的每個時間點進行3次重復測定，根 據測定結果繪制病毒在BHK-21細胞上的生長曲線，結果見圖7,表明rNJ08與NJ08在BHK-21 細胞上的增值曲線趨勢相似，拯救病毒滴度略低于野生病毒。
[0145] 3.5病毒蝕斑試驗
[0146] 將細胞瓶中的細胞經傳代接種于6孔細胞板中，并于37°C、5%C02的溫箱中過夜培 養，待6孔細胞板中BHK-21細胞長成80 %左右細胞單層時，棄去細胞培養板中的營養液，用 高壓過的ros洗三次，洗去殘留的營養液，拯救病毒組和親本病毒組均接種100TCID 5Q的病 毒。設立陰性對照，每孔均為lmL，置于37°C、5%⑶2細胞培養箱中培養lh。然后棄去病毒液 后，用PBS洗3次，以洗去未吸附進入細胞的病毒。