檢測到特異性ELISA抗體，S/N值大于2.1，表明免疫組 EMCV特異性抗體檢測為陽性。從接種不同抗原劑量免疫組中可看出，ELISA抗體效價具有明 顯的抗原劑量依賴性關系，最高可達1:400，10 7和106免疫組與104免疫組相比顯著性差異(P 〈0.05)。接種相同佐劑不同抗原的免疫組ELISA抗體效價沒有顯著差異(P>0.05)，與對照組 相比差異極顯著(P〈〇. 05)(圖12)。加強免疫后各免疫組ELISA抗體水平顯著提高，與對照組 相比差異性顯著;接種同一種佐劑不同抗原組以及同一種抗原不同佐劑組之間ELISA抗體 水平沒有顯著性差異(P〈〇.〇5)(圖13)。說明兩種滅活病毒都能引起機體產生良好的免疫反 應。
[0184] 6.4中和抗體的測定
[0185] 將小鼠血清置于56°C水浴滅活30min，每3-5min搖晃幾次，確保補體徹底滅活。然 后12000rpm離心10min，取上清并過濾，用含2 %胎牛血清的DMEM培養液將其稀釋成1: 2、1: 4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128;同時也將EMCV NJ08病毒稀釋為200TCID5〇/100yL。最后將上 述不同稀釋度的血清和已稀釋的病毒等體積混合，用渦旋儀混勻后，于37°C作用lh。將其接 種于已長滿BHK-21細胞單層的96孔細胞板，每孔100yL，每個血清稀釋度重復4孔，同時設立 只接種EMCV NJ08的陽性對照孔、正常細胞陰性對照孔和陰性血清對照孔。37°C繼續培養 48h，觀察并記錄CPE情況，按照Reed-Muench法計算中和抗體滴度，并使用Spass軟件分析比 較各組之間是否存差異。
[0186] 結果見圖14,表明接種不同劑量rNJ08滅活疫苗組中和抗體也具有劑量依賴性關 系，其中，1〇7和1〇 6免疫組與1〇4免疫組相比差異性顯著（P〈〇. 05)。不同佐劑相同劑量的 rNJ08與NJ08滅活疫苗組中和抗體效價均值在1:16以上，且各組之間差異性不顯著（P> 0.05)，與對照組相比差異極顯著(P〈0.05)。其中ISA206佐劑免疫組誘導中和抗體水平高于 ISA15A佐劑免疫組，說明ISA206佐劑效果更好。
[0187] 6.5淋巴細胞增殖轉化試驗
[0188] 將小鼠研究采血后斷頸處理，置于含75%乙醇中消毒，在無菌超凈臺中取其脾臟， 放入裝有無菌濾網的平皿中，加入適量的PBS溶液。用高壓處理的彎針頭將脾臟擠壓、研磨 均勻。先將5mL的人淋巴細胞分離液加入10mL的離心管中，再緩慢加入等體積的脾臟勻漿液 體，保證淋巴分離液與脾臟勻漿液分層清晰。1500rpm水平離心15min，用注射器吸取中間云 霧狀的白色淋巴細胞層，置于新的離心管中，加入適量紅細胞裂解液，1500rpm離心10min。 棄上清，加入適量的含10 %FBS的1640營養液，用巴氏吸管輕柔吹打，重懸淋巴細胞， lOOOrpm離心10min。棄上清，加入lmL含10%FBS的1640營養液，然后進行細胞計數。將淋巴 細胞濃度調為5X10 6個/mL，加入96孔細胞板中，每孔100yL，每個樣品鋪12孔，靜置4h使細 胞沉淀底部;然后分別加入l〇〇TCID 5Q的滅活病毒液(NJ08)100yL、加入終濃度為10yg/mL的 C〇A作為陽性對照以及100μΙ含10 % FBS的1640營養液作為陰性對照，各重復4孔。37 °C靜置 培養66小時后，每孔加入100yL DMS0，搖晃使結晶溶解完全，測定OD57〇nm值。計算SI值，即病 毒刺激孔的平均0D值與陰性對照0D值之間的比值，并分析各組間的差異性。
[0189]結果見圖15，表明接種不同劑量rNJ08滅活疫苗組刺激指數具有劑量依賴關系，但 各組之間差異性不顯著(P>〇.〇5);接種相同劑量不同佐劑的rNJ08與NJ08滅活疫苗組之間 刺激指數均在3.0左右，且各組之間差異性不顯著(P>0.05)。但與對照組相比，差異性顯著 (Ρ〈0·05)。
[0190] 6.6病理學觀察
[0191] 死亡小鼠剖檢時主要觀察心臟及腦組織是否有壞死、水腫等病變;統計各組小鼠 發病死亡狀況。病死小鼠及存活小鼠剖檢時采集心臟、腦組織固定放于4%多聚甲醛緩沖溶 液中，固定24h后按常規方法進行組織切片的制作，用于組織病理學觀察。結果如圖18、19所 示，發病小鼠的腦組織出現淋巴細胞浸潤、小膠質細胞增生等典型的非化膿性腦炎癥狀;發 病小鼠心肌纖維出現壞死、空泡化，淋巴細胞滲出性炎癥;耐過小鼠組織沒有病變跡象。各 佐劑疫組發病死亡小鼠的病理變化程度相似，不同死亡時間小鼠的組織病程度變略有不 同，急性死亡小鼠觀察不到明顯的組織病理變化。
[0192] 目前，滅活疫苗因具有安全性高、容易獲得且具有一定的免疫效果的特點。Gomez 等人成功研制出首例EMCV滅活疫苗，對妊娠母豬、仔豬和育肥豬進行攻毒保護試驗，結果表 明都具有很好的保護效果。Ma t s umo r i等人利用研制的活疫苗免疫小鼠可使小鼠免受EMC V 的感染，獲得100%的保護效果。這說明滅活疫苗具有較好的免疫和保護效果。滅活疫苗的 制備第一步是以最低濃度的滅活劑、最短時間將病毒滅活，保持最佳的抗原性，也是最關 鍵的環節。佐劑可以提高抗物質的抗原性，從而增強機體的免疫應答反應，對滅活疫苗具有 重要作用。
[0193] 本研究采用ΒΕΙ烷化劑類滅活劑，通過破壞病毒核酸使其不能復制，喪失侵染宿主 的能力，同時又不會損壞病毒衣殼蛋白，而保持良好的免疫原性，能夠激發機體的免疫應答 反應。ΒΕΙ對宿主有毒害作用，可用終濃度為2%硫代硫酸鈉處理，使其失活，減弱疫苗的副 作用。本實驗選用了 ISA15A雙相油佐劑和ISA206乳佐劑配制疫苗。試驗結果表明從抗體水 平角度分析，滅活的rNJ08和NJ08都能有效地引起機體體液免疫反應并產生相應的ELISA抗 體和中和抗體;這也表明了兩種滅活疫苗具有良好的免疫原性，能夠引起機體產生體液免 疫和細胞免疫；ISA15A和ISA206兩種佐劑效果良好，未出現不良反應，安全性高，對增強兩 種滅活病毒的免疫原性發揮重要作用，其中ISA206佐劑效果略優于ISA15A佐劑。由于本研 究中使用的重組病毒rNJ08與親本病毒NJ08在基因組序列上仍然有細微的差別，在體外的 生長特性相似，但是rNJ08對小鼠的致病性卻很弱，這表明該病毒制備成滅活疫苗具有安全 性更高的優勢。
[0194] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受實施例的限 制，其它任何未背離本發明的精神實質與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為 等效替換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一株低毒力重組豬源腦屯、肌炎病毒，是通過W下步驟構建得到的： (1) 提取豬源腦屯、肌炎病毒株總RNA，RT-PCT擴增目的基因片段，擴增用引物如下^W豬源腦屯、肌炎病毒總RNA作為模板，^43、8誠、821?、^及0?1為特異性下游引物，構建 反應體系獲得的A、Bi、B2、C片段的CDNA，分別W AF/AR，BiF/BiR，B2F/B2R，CF/CR2為引物，相應 的CDNA為模板進行PCR反應，獲得A、Bi、B2、C四個片段，然后利用B1F/B2R為引物，將Bi和B2片 段進行融合反應，獲得B片段； (2) 將A、B、C片段分別與祀asy-simple Blunt克隆載體進行連接，轉化感受態細胞，培 養，提取陽性重組質粒，分別得到重組質粒祀asy-A、p化sy-B和祀as廠C; (3) 利用雙酶切的方法將C、B、A片段依次克隆至載體中，構建病毒全長CDNA克隆， 得重組質粒PCMV-NJ08; (4) 將重組質粒PCMV-NJ08轉染BHK-21細胞，經過培養得到豬源腦屯、肌炎病毒株感染性 克隆rNJ08。2. 根據權利要求1所述的低毒力豬源腦屯、肌炎病毒，其特征在于rNJ08接種BHK-21細 胞，連續傳代，第3、5、10代捶救病毒的TCIDso為10 7'6?~IO8'5 TCI化o/mL。3. 根據權利要求1所述的低毒力豬源腦屯、肌炎病毒，其特征在于步驟(3)中利用雙酶切 的方法將C、B、A片段依次克隆至載體中步驟如下： pEasy-C質粒用化Cl和SpeI雙酶切，構建連接體系利用T4連接酶將片段C克隆至用同樣 酶切處理的的載體CMV-0，22°C連接化，轉化Trans I-Tl感受態細胞，獲得的陽性質粒命名為 pCMV-C;然后pEasy-B質粒經化Cl和趾Ol雙酶切，將酶切純化后的B片段與化C巧日趾Ol雙酶 切后的pCMV-C載體連接，獲得陽性質粒命名為pCMV-BC;pEasy-A質粒用化C巧日化el雙酶切， 酶切純化后的A片段與化C巧日NheI雙酶切后的pCMV-BC載體連接，將A片段連入pCMV-BC載體 中，獲得陽性質粒命名為PCMV-NJ08。4. 權利要求1所述的低毒力豬源腦屯、肌炎病毒，其特征在于第6243位的T變成A，作為感 染性克隆的遺傳標記。5. 根據權利要求1-4中任一項所述的低毒力豬源腦屯、肌炎病毒，其特征在于豬源腦屯、 肌炎病毒為豬腦屯、肌炎病毒NJ08株。6. -種權利要求1-4中任一項所述的低毒力豬源腦屯、肌炎病毒在病毒捶救、病毒致弱 機理及利用該病毒的CDNA感染性克隆為載體插入不同病毒保護抗原基因、構建不同病毒 的嵌合病毒來表達外源蛋白W及由此開發出單價、雙價或多價疫苗中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于將滅活的低毒力豬源腦屯、肌炎病毒使用 ISA15A和ISA206佐劑分別配制成滅活疫苗。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于ISAl5A佐劑與抗原體積比為1:4，ISA206佐 劑與抗原體積比為1:1。9. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于使用BEI濃度0.002mol/L、28°C作用24 h進 行滅活。
【專利摘要】本發明屬于微生物動物疫苗技術領域，尤其涉及一株低毒力豬源腦心肌炎病毒,將豬腦心肌炎病毒毒株的全長cDNA置于CMV啟動子控制下，采用DNA轉染系統拯救病毒，獲得重組病毒，方法簡便易行，成功建立該病毒cDNA感染性克隆，拯救獲得病毒，體外復制特性與原始病毒相似，但對小鼠致病性明顯減弱，為該病毒致病機制及疫苗研制奠定了重要基礎；本申請得到的低毒力豬源腦心肌炎病毒經滅活后制備成疫苗，保護率高達90%，是一種安全且保護率高的滅活疫苗。
【IPC分類】A61P31/14, C12N7/01, A61K39/125
【公開號】CN105647877
【申請號】
【發明人】白娟, 方譜縣, 姜平
【申請人】南京農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月2日