min。
[0121] (9)將吸附柱轉移到另一干凈1.5mL塑料離心管中，在吸附膜的中央處懸空加入 50-100yL Buffer E后室溫靜置lmin，室溫12000Xg離心lmin洗脫克隆子的質粒。
[0122] 將獲得的質粒用美國New England Biolabs公司的高保真限制性內切酶Hindlll 和Notl雙酶切（2yL Cutsmart buffer，0.5yL HindIII，0.5yL NotI，lyL質粒DNA，16yL ddH20,37°C處理2h)后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定克隆子攜帶的外源DNA片段是否 是目的DNA片段。取lmL含有目的DNA片段的克隆子菌液送交北京擎科新業生物技術有限公 司測序，測序結果證實該克隆子的確含有目的DNA片段，目的DNA片段沒有出現突變。將該陽 性克隆子的重組質粒命名為廣-Blunt-Aul3192。
[0123] 實施例3Aul3192蛋白的表達和純化
[0124] 1、含AU13192基因大腸桿菌表達載體的構建
[0125] 用限制性內切酶HindIII和N〇11從含有目的基因的重組質粒-B1 unt-Aul3192中切下目的片段，同時用Hindlll和Notl雙酶切pET28a載體，瓊脂糖凝膠電泳分離 后，用OMEGA膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和pET28a載體的大片段。利用T4DNA連接 酶將Aul3192基因正向插入到pET28a載體中，將連接產物轉化大腸桿菌TOP 10感受態細胞， 經克隆子快速檢驗和質粒酶切驗證鑒定后，獲得大腸桿菌重組表達載體pET28a-Aul3192。
[0126] 將構建好的pET28a-Aul3192載體經熱激轉化法轉入大腸桿菌BL21(DE3)，進一步 驗證Au 13192基因的功能。
[0127] 2、Aul3192基因的表達
[0128] 將重組質粒pET28a-Aul3192及pET28a質粒通過熱激轉化法分別轉入表達宿主菌 大腸桿菌BL21(DE3)中，用武漢麥克萊博生物科技有限公司的質粒小量提取試劑盒對轉化 子進行質粒抽提，經限制性內切酶Hindlll和Notl酶切驗證鑒定，成功獲得分別含重組質粒 pET28a-Aul3192及pET28a質粒的大腸桿菌表達菌株。
[0129] 分別挑取含重組質粒pET28a-Aul3192及pET28a質粒的大腸桿菌BL21(DE3)單菌落 接種至含卡那霉素抗性(50yg/mL)的5mL LB培養基，于37°C、220r/min過夜培養。按1 %的接 種量將新鮮菌液接種至含卡那霉素抗性（50yg/mL)的5mL LB培養基中，繼續培養2-3h至 0D6QQ達到0.4-0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1 mM，于37°C下誘導培養約3-5h(誘導前分別取 出lmL菌液作為對照）。分別取出誘導前和誘導后的菌液200yL，加入5 X SDS-PAGE樣品緩沖 液煮沸30min，室溫12000 X g離心10min，各取10yL上清液進行SDS-PAGE檢測，結果（圖6)表 明目的蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達。
[0130] 3、Aul3192蛋白的純化
[0131] 取5mL過夜培養的含重組質粒pET28a-Aul3192的大腸桿菌BL21(DE3)菌液按1%的 接種量接種至含卡那霉素抗性(50yg/mL)的500mL LB培養基中，于37°C條件下220r/min培 養至0D6QQ達到0.4-0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1 mM，于37°C下誘導培養約3-5h。然后室溫 5000r/min離心5min收集誘導表達后的大腸桿菌菌體，用無菌ddH2〇懸浮菌體，室溫5000r/ min離心5min后去除上清（重復兩次，徹底清洗細胞）。之后用HEPES緩沖液懸浮菌體，室溫 5000r/min離心后去除上清。將10mL HEPES緩沖液加入菌體細胞中，充分混勻后將細胞懸液 置冰水浴中超聲（參數：超聲2s，間歇5s，功率300W)處理30min。然后4°C、13000rpm離心 60min，取上清液用0.45μηι濾膜過濾后進行蛋白純化。純化方法如下：
[0132] (1)取適量鎳珠基質上柱，使基質里的無水乙醇在重力作用下充分流出。
[0133] (2)用20mL無菌ddH20沖洗柱子。
[0134] (3)用20mL HEPES緩沖液平衡柱子。
[0135] (4)將含有目標蛋白的上清液加入柱子中，收集流穿液，進行SDS-PAGE檢測。
[0136] (5)分別以含25mM、50mM、75mM、100mM和250mM咪唑的洗脫液（用HEPES緩沖液稀釋 的咪唑溶液)進行洗脫，收集流出液，進行SDS-PAGE檢測。
[0137] SDS-PAGE檢測結果顯示用含75mM咪唑的洗脫液進行洗脫時，獲得較純的蛋白（圖 7)。用lOkDa的超濾濃縮管濃縮該較純的蛋白溶液至2.5mL后，用GE Healthcare的ro-ΙΟ脫 鹽柱(貨號為17-0851-01)對濃縮后的蛋白溶液進行脫鹽處理，具體操作如下：
[0138] (1)用10mL平衡緩沖液平衡柱子，棄廢液，重復4次。
[0139] (2)加入2.5mL蛋白液至完全浸入柱子，棄廢液。
[0140] (3)加入3.5mL洗脫液并收集流出液(該流出液即為完成脫鹽處理的蛋白溶液)-80 °C保藏備用。
[0141] 實施例4Aul3192蛋白的功能分析
[0142] 為了確定Aul3192蛋白的功能，以美國Sigma-Aldrich公司的DMAPP(二甲基烯丙基 焦磷酸）、GPP(香葉基焦磷酸）、FPP(法尼基焦磷酸)為底物，分別添加 IPP(異戊烯焦磷酸)來 設計體外反應。反應體系（200μL):50μΜ DMAPP(或GPP、FPP)，50yM IPP，20mM HEPES(pH 7.4)、2mM DTT(二硫蘇糖醇）、5mM MgCl2和lOOyg Aul3192蛋白，30°C反應3h。反應結束后， 用等體積正己烷萃取3次，用氮吹儀將有機溶劑吹干，50yL正己烷溶解后進行GC-MS(氣相色 譜-質譜)檢測。升溫程序:60 °C恒溫2miη，再以30 °C/min的速度升溫到150 °C，再以10 °C /miη 的速度升溫到180°C，再以2°C/min的速度升溫到210°C，保持210°C5min。
[0143] 以DMAPP、GPP和FPP為底物，分別添加 IPP，在保留時間為12.7min時都檢測到了分 子量為272的物質，該物質通過質譜圖分析為二砲化合物variediene(m/z = 55、67、91、105、 119、133、147、203、230、257、272等）（圖8)。
[0144] 以上結果表明Aul3192蛋白能用DMAPP、GPP和FPP為底物，分別添加 IPP時合成二萜 化合物variediene。由此可知Aul3192蛋白同時具有催化底物鏈長延伸和結構環化的功能， 能夠以DMAPP從頭合成variedienec^
【主權項】
1. 一種二祗化合物variediene合成酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所 示;所述的二祗化合物var i ed i ene的結構如下所示：2. 編碼權利要求1所述二祗化合物variediene合成酶的基因，其特征在于:其基因序列 如沈Q ID NO. 1所示。3. 根據權利要求2所述的基因，其特征在于:其CDNA序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一種表達權利要求1所述的二祗化合物variediene合成酶的載體，其特征在于:為含 有權利要求2或3所述基因的真核或原核表達載體。5. -種表達權利要求1所述的二祗化合物variediene合成酶的宿主細胞，其特征在于： 含有權利要求4所述的載體。6. 權利要求1所述的合成酶或權利要求2或3所述的基因在合成variediene中的應用。7. 權利要求1所述的合成酶或權利要求2或3所述的基因在制備祗類化合物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種二萜化合物variediene合成基因<i>Au13192</i>及其應用，屬于基因工程領域。該二萜化合物合成基因來源于焦曲霉094102，其基因、cDNA序列如SEQ？ID？NO.1、2所示，其編碼的Au13192蛋白的序列如SEQ？ID？NO.3所示。Au13192蛋白具有催化底物鏈長延伸和結構環化的功能，該蛋白能催化DMAPP、GPP和FPP與IPP反應生成variediene。本發明發現了<i>Au13192</i>基因在焦曲霉094102體內對蛇孢假殼素類化合物產量有顯著影響，其可用于輔助制備Oph化合物。本發明為Oph化合物的生物合成提供了新的資源，為提高該類化合物的生物產量提供一種可能性。
【IPC分類】C12N15/52, C12P15/00, C12N9/00
【公開號】CN105647879
【申請號】
【發明人】洪葵, 殷如, 柴沆鎮, 董治統, 鄧子新
【申請人】武漢大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月16日