2是焦曲霉094102的P0C13192基因簇圖。
[0017] 圖3是焦曲霉094102P0C13192基因簇敲除突變株Δ P0C13192與野生型Oph化合物 產量的比較圖。
[0018] 圖4是焦曲霉094102Aul3192基因編碼的蛋白Aul3192與EvVS蛋白的氨基酸序列比 對結果圖。
[0019] 圖5是Aul3192基因 cDNA擴增策略圖。
[0020] 圖6是Aul3192基因異源表達蛋白的表達結果圖。M:蛋白marker;l:含有pET28a載 體的BL21(DE3)在IPTG誘導前的全細胞蛋白圖；2:含有pET28a載體的BL21(DE3)在IPTG誘導 后的全細胞蛋白圖；3:含有pET28a-Aul3192載體的BL21(DE3)在IPTG誘導前的全細胞蛋白 圖；4:含有pET28a-Aul3192載體的BL21(DE3)在IPTG誘導后的全細胞蛋白圖。
[0021] 圖7是AU13192基因異源表達蛋白的純化結果圖。
[0022] 圖8是Aul3192蛋白體外反應產物的GC-MS圖。A:質荷比為272下提取的體外反應產 物GC色譜圖（I:以FPP和IPP為底物的反應產物GC色譜圖；Π :以GPP和IPP為底物的反應產物 GC色譜圖；ΙΠ :以DMAPP和IPP為底物的反應產物GC色譜圖；IV:以IPP為底物的反應產物GC色 譜圖）;B:體外反應產物質譜圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的描述，下述實施例僅用來說明本發 明，并不限制本發明的范圍。
[0024]本發明所提供的二砲化合物variediene合成基因，是從焦曲霉094102 (Aspergillus ustus094102)中克隆得到，命名為Aul3192基因，其基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。Aul3192基因含有8個內含子，其cDNA大小為2127bp，序列如SEQIDN0.2所示。 Aul3192基因編碼的蛋白，命名為Aul3192蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0.3所示。
[0025]從公共數據庫上搜索焦曲霉094102Aul3192蛋白的同源序列進行比對，結果顯示 目標蛋白Aul3192與來自Emericellavariecolor的EvVS(variediene合成酶）（BinQin， Yudai Matsuda,Takahiro Mori,et al.An Unusual Chimeric Diterpene Synthase from Emericella variecolorand Its Functional Conversion into a Sesterterpene Synthase by Domain Swapping.Angew.Chem.Int.Ed.54,1-5(2015))同源性較高（78%)〇 Aul3192蛋白屬于嵌合型萜類合成酶，其N端和C端分別負責萜類環化和異戊烯基轉移功能。 AU13192蛋白含有兩個保守結構域，其中萜類環化酶結構域含有兩個用來識別Mg2+和底物的 特征性保守基序DNVVE和NDYFSFDIE，E-IPPS結構域也含有兩個具有相似功能的特征性保守 基序 DDIED 和 DDYKN(圖 4)。
[0026]實施例1P0C13192基因簇的敲除
[0027]利用同源重組的方法，將焦曲霉094102菌體中的P0C13192基因簇替換成博來霉素 抗性基因，檢測突變株中Oph含量的變化情況。本實施例所用到培養基配方如表1。
[0028]表1:本實施例所用到培養基配方
[0029]
[0031] l、P〇C13192基因簇敲除載體的構建
[0032] (1)通過PCR技術，以pGAPZaA載體為模板擴增得到含有Ptefl和Pem7啟動子的博來 霉素基因序列(Sh ble)。
[0033] 擴增所用到的引物序列：Sh ble-F:CCCACACACCATAGCTTCAAAAT;Sh ble-R: AGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG。
[0034] (2)將擴增得到的片段通過ΤΑ克隆與pMD18-T載體連接，構建pMD18-T-Sh ble載 體，該載體Sh ble兩側有兩個多克隆位點，分別用于添加 P0C13192基因簇上下同源序列。 [0035] (3)連接產物轉化到大腸桿菌T0P10中，通過氨芐青霉素篩選陽性轉化子。液體培 養陽性轉化子，提取質粒PCR驗證，獲取pMD18-T-Sh ble質粒。
[0036] (4)以焦曲霉094102基因組為模板，在P0C13192基因簇上游擴增出1226bp的序列， 加入適當的酶切位點。
[0037] 擴增所用到的引物序列：？0(：131921^沖:6厶厶1'1'(7^厶(：1'1^厶厶厶1^厶606厶66厶^(3〇1?1) ; P0C13192L-R：TCTAGAATACCCACGGACCCAAC(XbaI)〇
[0038] (5)將擴增得到的P0C13192基因簇上游片段與pMD18-T-Sh ble載體連接，構建 pMD18-T-13192L-Sh ble載體。
[0039] (6)連接產物轉化到大腸桿菌T0P10中，通過博來霉素篩選陽性轉化子。液體培養 陽性轉化子，提取質粒PCR驗證，獲取pMD 18-T-13192L-Sh b 1 e質粒。
[0040] (7)以焦曲霉094102基因組為模板，在P0C13192基因簇下游擴增出1077bp的序列， 加入適當的酶切位點。
[0041] 擴增所用到的引物序列：卩0(：131921?-卩：(：(^^^^66厶6〇厶6〇厶1'(：1'1^6厶1766(5匕^) ; P0C13192R-R:AAGCTTATTCTGGGACAGGAACTAG(HindIII)。
[0042] (8)將擴增得到的P0C13192基因簇下游片段與pMD18-T-13192L-Sh ble載體連接， 構建pMD18-T-13192L-Sh ble-13192R。
[0043] (9)連接產物轉化到大腸桿菌TOPI0中，通過博來霉素篩選陽性轉化子。液體培養 陽性轉化子，提取質粒PCR驗證，獲取pMD18-T-13192L-Sh ble-13192R載體。該載體即用于 P0C13192基因族的敲除。
[0044] 2、原生質體的轉化
[0045] (1)將焦曲霉094102菌株涂于GMM平板，28 °C培養3-4d。
[0046] (2)收集孢子于10mL 0.1%Tween-80(-般需要收集4個平板的孢子），用血球計數 板計數。
[0047] (3)接種約 109個孢子于500mL LMM中，28°C、280rpm培養約9h。
[0048] (4)用miracloth濾布過濾LMM培養物，4°C、8000rpm離心15min收集萌發的孢子，用 50mL Mycelium wash solution洗一次。
[0049] (5)將抱子沉淀移至含有1 %Driselase的Osmotic medium中，28°C、80rpm培養4h， 每隔l/2h用顯微鏡觀察原生質體形成狀況。
[0050] (6)用miracloth濾布過濾原生質體，加入2倍體積的STC buffer，4°C、6000rpm離 心8min收集原生質體。
[0051 ] (7)將原生質體重懸于STC buffer中，使其終濃度達到108-109個原生質體/mL。
[0052] (8)冰上保存原生質體，取出一部分稀釋10倍進行原生質體計數，其他的盡快進行 PEG4000介導的原生質體轉化實驗。
[0053] (9)用STC buffer稀釋待轉化的敲除質粒(pMD18-T-13192L-Sh ble-13192R)，使 其終濃度達到l〇yg/l〇〇yL。
[0054] (10)將100yL含有敲除質粒的STC buffer加入到100yL原生質體中，充分混勻后冰 浴50min〇
[0055] (11)加入 1.25mL PEG solution，輕柔混勻后室溫放置20min。
[0056] (12)加入5mL STC buffer，混勾后4°C、3750rpm離心 10min，棄上清。
[0057] (13)輕柔加入STC buffer并定容至600yL。
[0058] (14)取200yL轉化后的混合物涂布于SMM(Zeo+)平板上，28°C培養3-5天。
[0059] (15)將長出的轉化子進行PCR驗證，陽性轉化子即為P0C13192缺失突變株Δ P0C13192。
[0060] 3、0ph 的檢測
[0061 ] (1)接種野生型焦曲霉094102或AP0C13192孢子于真菌2號培養基，28°C培養3d。
[0062] (2)接種菌液于固體發酵培養基，20°C培養18d。
[0063] (3)取20g發酵產物，加入30mL 80%丙酮后用破碎機破碎。
[0064] (4)超聲破碎20min后，8000rpm離心10min，取上清。