[0065] (5)用2倍體積的乙酸乙酯萃取1次，用旋轉蒸發儀旋干后用15mL甲醇（色譜級）溶 解。
[0066] (6)取lmL甲醇溶液，經0.22μπι濾膜過濾后置于色譜瓶中，即為HPLC樣品。
[0067] (7)將樣品進行冊^：-1^檢測：進樣1(^1^，流速1111171^11，全波長檢測，人 111￡? = 230- 240nm，流動相為甲醇：水=85:15 (v/v)，沖洗30min，time = 8_30min。
[0068] (8)根據標準曲線計算oph產量：y = 3E+07x_76040 [R2 = 0.995](Waters) ;y = 65482x+17.89[R2 = 0.998](Agilent) 〇
[0069] 通過野生型焦曲霉094102與P0C13192缺失突變株AP〇C13192oph產量比較，表明 P0C13192的缺失降低了 Oph產量(圖3)。
[0070] 為進一步驗證說明P0C13192對oph產量的影響，下面對P0C13192基因簇的核心基 因 AU13192進行異源表達，體外驗證該基因功能。
[0071] 實施例2Aul3192基因克隆
[0072] 1、焦曲霉094102菌株的DNA提取
[0073] (1)將焦曲霉094102菌液涂布于GMM平板上，28°C培養3d左右。
[0074] (2)從GMM培養平板上挑取適量的孢子，懸浮于lmL ddH20至渾濁，渦旋儀震蕩使混 勾。12000rpm離心2min，收集孢子，倒掉上清。
[0075] (3)加入Bufferl 0.4mL，混勻。Bufferl:50mM Tris-Hcl，10mM EDTA，100yg RNaseA，pH 8·0〇
[0076] (4)加入Buffer2 0 · 4mL，混勻后65 °C 孵育20min，冷卻至室溫。Buffer2 : 200mM NaoH,l%SDS〇
[0077] (5)加入Buf f er3 0 · 6mL，混勾后12000rpm離心1 Omin，轉移上清至新的1 · 5mL離心 管。Buffer3:3M醋酸鉀，pH 5.5。
[0078] (6)加入1/8倍體積的3M NaAc(pH5 · 2)和0 · 6~0 · 8倍體積的異丙醇，4°C冰箱放置 30min〇
[0079] (7)12000rpm 離心 20min，倒掉上清。
[0080] (8)用70%乙醇0.6mL洗兩次，12000rpm離心2min，倒掉上清。
[0081] (9)干燥后溶于無菌水10yL，-40°C保存備用。
[0082] 2、Aul3192 基因 cDNA 的擴增
[0083] Aul3192基因有9個外顯子(E1~E9)，采用Over-lap PCR的方法將9個外顯子拼接 起來獲取Aul3192基因 cDNA。設計引物使每個相鄰片段之間有18-22bp的重疊區，其中E2、E7 片段較小，將其序列設計到相鄰片段的引物中擴增出來(圖5)。
[0084] (1)以焦曲霉094102基因組為模板，利用各個片段的引物（表2)分別擴增獲取 Aul3192基因的9個外顯子片段El、E3、E4、E5、E6、E8、E9。反應體系為：lμL美國NewEngland Biolabs公司的Pfu高保真DNA聚合酶，32yL滅菌去離子水，10yL Pfu高保真DNA聚合酶自帶 的5父陬131^6廣正向、反向引物各2.5以1^(1(^]\〇，焦曲霉094102基因組模板24匕
[0085] 表2擴增Aul3192基因外顯子的引物
[0086]
[0088] (2)分別取lyL E1、E3片段為模板，以E1F、E3R為引物，在Pfu高保真DNA聚合酶作用 下擴增得到E1:E3。
[0089] (3)分別取lyL E4、E5片段為模板，以E4F、E5R為引物，在Pfu高保真DNA聚合酶作用 下擴增得到E4:E5。
[0090] (4)別取lyL E6、E8、E9片段為模板，以E6F、E9R為引物，在Pfu高保真DNA聚合酶作 用下擴增得到E6:E9。
[0091] (5)別取lyL El:E3、E4:E5、E6:E9片段為模板，以ElF、E9R為引物，在Pfu高保真DNA 聚合酶作用下擴增得到Aul3192基因 cDNA。
[0092] PCR擴增條件為：95 °C預變性3min; 95 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸60s，35個 循環;72°C充分延伸lOmin。
[0093] 3、目的DNA回收
[0094] PCR產物電泳后，使用德國OMEGA公司的Gel Extraction Kit(lOO)(貨號：D2500-01)，從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段。具體操作步驟如下：
[0095] (1)使用三羥甲基氨基甲烷-乙酸(簡稱為TAE)緩沖液制作1.0%的瓊脂糖凝膠，對 目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。
[0096] (2)在紫外燈下切下含有目的DNA片段的凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體(此時 應盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率）。
[0097] (3)切碎膠塊(膠塊切碎后可以加快膠塊融化時間，提高DNA回收率）。
[0098] (4)稱量膠塊重量，計算膠塊體積。按每100mg瓊脂糖凝膠400yL的比例加入 Binding buffer，50-60°C處理約10min(每隔2min混勾一次，直至膠塊完全融化）。
[0099] (5)將融化的膠溶液轉移到收集管的吸附柱內，室溫10000 X g離心lmin，棄濾液。
[0100] (6)加入500yL XP2(Binding buffer)至吸附柱中，室溫 10000 X g離心lmin，倒掉 收集管中的濾液，將吸附柱放回到收集管中。
[0101] (7)加入700yL SPW(Wash buffer)至吸附柱中，室溫10000Xg離lmin，倒掉收集管 中的濾液，將吸附柱放回到收集管中。
[0102] (8)加入300yL SPW(Wash buffer)至吸附柱中，室溫10000 Xg離心lmin，倒掉收集 管中的濾液，將吸附柱放回到收集管中。
[0103] (9)室溫 10000Xg 開蓋離心 2min。
[0104] (10)將吸附柱放入另一干凈的1.5mL塑料離心管中，在吸附柱模的中央處加入30-50yL Elution buffer或無菌水，室溫放置2_5min后室溫10000Xg離心lmin。
[0105] (11)回收產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢驗。
[0106] 4、目的DNA的克隆
[0107]回收的目的DNA于16°C與pEASY-Blunt載體連接2-4h，連接產物轉化大腸桿菌TOP 10感受態細胞，過夜培養后采用快速檢驗的方法初步篩選陽性克隆子，方法如下：
[0108] (1)用無菌牙簽在轉化平板上挑取約20個單克隆子，在含有氨芐抗性（10〇yg/mL) 的LA平板上劃線，于37 °C培養8h。
[0109] (2)在 1.5mL塑料離心管中加入30yL STE溶液（20mM Tris-HCl，25mM EDTA，75mM NaCl)，用牙簽將擴大培養后的單克隆子分別挑取到上述塑料離心管中渦旋處理約2min，使 其充分混勻。
[0110] (3)加入等體積氯仿:酚:異戊醇(V: V: v = 24:25:1)，輕搖混勻后，室溫10000 X g離 心5min〇
[0111] (4)上清液用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步確定克隆子含有的質粒是否插入外 源片段。
[0112]用武漢麥克萊博生物科技有限公司的質粒小量提取試劑盒對含有外源片段的克 隆子進行質粒抽提，具體操作如下：
[0113] (1)將單克隆子接入含氨芐抗性（100yg/mL)的5mL LB培養基中，于37°C條件下， 220r/min過夜培養后轉移2mL菌液至2mL塑料離心管中，于室溫12000 X g離心lmin，棄上清。
[0114] (2)加入250yL Bufferl，于漩渦振蕩器上劇烈震蕩，使菌體充分重懸。
[0115] (3)加入250yL Buffer2,溫和顛倒離心管5-6次，直到體系變清亮為止。
[0116] (4)加入350yL Buffer3,溫和顛倒離心管3-5次以充分混勻。
[0117] (5)室溫12000 Xg離心10min，將上清液小心轉入收集管的吸附柱中，室溫12000 X g離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放回收集管。
[0118] (6)加入500yL Buffer D，室溫12000 Xg離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附 柱放回收集管。
[0119] (7)加入600yL Buffer W，室溫12000 Xg離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附 柱放回收集管。
[0120] (8)再次加入300yL Buffer W，室溫 12000Xg離心l