20ml 10 %的甘油重懸菌體；
[0053] (4)在4°C條件下，4000rpm離心10min，棄上清，加入10ml含有10%甘油重懸菌體； [0054] (5)在4°C條件下，4000rpm離心10min，棄上清，緩慢加入2ml含有10%甘油重懸菌 體；
[0055] (6)將制好的感受態分裝(每管50μ1)，液氮冷凍后于_80°C保存備用。
[0056] C:電擊轉化農桿菌
[0057] (1)在冰上將ΙμL的重組質粒pCB302-3-PlCYP82加入50μ1電擊農桿菌感受態中，輕 輕混和均勻；
[0058] (2)將混合物加入電極杯的中央后再把電極杯放入槽孔中；
[0059] (3)調農桿菌電擊參數，電擊混合物；
[0060] (4)加入lOOylLB液體培養基后將混合物吸出，再加入500ylLB液體培養基，28°C， 230rpm 復蘇 2h;
[0061 ] (5)將上述混合物均勻涂在含100mg/L Kan和100mg/L Carb的LB平板上；
[0062] (6)在28 °C黑暗溫箱中倒置培養2-3d;
[0063] (7)挑取單克隆菌株進行PCR檢測。
[0064] D:浸花法擬南芥轉化
[0065] lml:20ml接種農桿菌。28°C，250rpm過夜培養，次日按5ml: 100ml接種，28°C， 250rpm過夜培養，次日上午測0D值，用LB+Kan+Carb作為空白對照，當菌液達到0D600為0.8 左右時，4°C，5000g離心 12min收集菌體。100ml懸浮液（1/2MS，10mM MgCl2，5%蔗糖，500μ1/ L Si lwe 11)懸浮后，導入小燒杯中用于轉化。轉化時將GK377A01擬南芥的花在溶液中浸泡 lmin左右，浸泡結束后，將PCB302-3-P1CYP82放倒并將每個花枝與其他花枝分開，避光保溫 保濕過夜。侵染后得到To代轉PCB302-3-P1CYP82擬南芥種子。
[0066] E:轉PCB302-3-P1CYP82擬南芥的篩選及分子鑒定
[0067] 將2000個To代轉pCB302-3-PlCYP82擬南芥種子消毒滅菌后，點種于MS+Kan(50mg/ L)平板篩選，獲得1〇棵To代轉PCB302-3-P1CYP82擬南芥。
[0068] 從To代轉pCB302-3-PlCYP82擬南芥收獲種子、播種，得到1^代轉pCB302-3-PlCYP82 擬南芥。
[0069] 提取Ti代轉P1CYP82擬南芥的cDNA為模板，利用P1CYP82F2: ATGGATTCCCATGTCCCAAC 和 P1CYP82R2: TCAAAGGCTTTCATAAAGCATCA 為引物對，進行 PCR 擴增； [0070] 電泳結果如圖4所示，M:Trans2K DNA marker;WT為GK377A01擬南芥，1-3為Τι代轉 P1CYP82擬南芥，得到陽性Τ!代轉P1CYP82擬南芥，表明P1CYP82已轉到野生型擬南芥中。1^代 植株進行PCR鑒定表明凡是經過篩選成活的全被檢測為陽性。
[0071] 從1^代轉PCB302-3-P1CYP82擬南芥收獲種子、播種，得到T2代轉PCB302-3-P1CYP82 擬南芥。
[0072] 2.回補P1CYP82擬南芥植株產生ΤΜΤΤ [0073] Α:擬南芥的氣體收集
[0074]為了避免土壤中揮發物的影響，利用ddH20將土洗凈后，將植物放入玻璃瓶中，并 灌滿ddH20以保證植物正常生長。利用頂端開小口的玻璃容器、密閉的鋁質金屬底座以及金 屬夾子組裝成相對封閉的系統，對擬南芥進行氣體收集。按照密閉的原則組裝裝置，使氣體 利用真空栗通過炭柱過濾后進入裝置，含有吸附劑的玻璃管連接于出氣口。進氣的流速 (60〇1111/111；[11)略大于出氣的流速(4001111/111；[11)。
[0075]選擇播種后第28天的T2代轉P1CYP82擬南芥進行氣體采集。鑒于擬南芥植株較小， 揮發物較少，吸附劑在開花前期采用50mg Tenax ΤΑ聚合物，開花后采用50mgPorapaK Q聚 合物。Tenax玻璃管使用前利用5ml重蒸乙醚清洗3次后，在持續的氮氣通過的條件下220°C 加熱2h;PorapaK Q玻璃管則使用前利用lmL超純乙醚清洗3次以上后，在持續的氮氣通過的 條件下132°C加熱2h。氣體收集完畢后，Tenax玻璃管直接用于GC-MS分析，PorapaK Q玻璃管 則需要利用250μ1重蒸乙醚洗脫2次(共500μ1)至安捷倫玻璃瓶中待用。以GK377A01擬南芥 和野生型擬南芥（Columbia型）為對照。分別得到T2代轉P1CYP82擬南芥揮發物樣品、 GK377A01擬南芥揮發物樣品和野生型擬南芥揮發物樣品。
[0076] Β:用GC-MS對過表達P1CYP82基因、野生型和GK377A01擬南芥植株的
[0077] ΤΜΤΤ的釋放量的比較分析
[0078] 用GC(Agilent公司6890Ν，色譜柱參數：長50m X內徑0 · 32mmX薄膜厚度0 · 52μπι的 非極性色譜柱；電離參數:70eV，220°C ;氣相色譜爐溫度保持在30°C 1分鐘，然后編程在5°C/ min升溫至150°C，接著10°C/min升溫至150°C)對T2代轉P1CYP82擬南芥揮發物樣品、 GK377A01擬南芥揮發物樣品和野生型擬南芥揮發物樣品進行檢測，對人工合成的ΤΜΤΤ標準 樣品也按該方法來處理，建立標準曲線。
[0079] 結果如圖5所示，其中，5Α為Τ2代過表達P1CYP82擬南芥揮發物在24.01min的GC峰 圖；5B為野生型擬南芥揮發物的GC峰圖；5C為GK377A01擬南芥揮發物樣品GC峰圖；5D為ΤΜΤΤ 標樣在24. Olmin的GC峰圖。對人工合成的ΤΜΤΤ標準樣品進行對比后顯示揮發物結果為ΤΜΤΤ (圖5)。通過定量分析，發現轉P1CYP82擬南芥揮發物中ΤΜΤΤ的含量明顯增多（圖6)。
[0080] 實施例6. P1CYP82在吸引小菜蛾絨繭蜂雌蟲中的應用
[0081] 用Υ型嗅覺儀檢測上述花期各植株揮發物對小菜蛾絨繭蜂雌蟲行為的影響，具體 如下：
[0082] 小菜蛾絨繭蜂在光照培養箱中用二化螟飼養，挑選小菜蛾絨繭蜂雌蟲進行行為研 究。Υ形嗅覺儀主臂20cm，兩側臂15cm，側臂間夾角60°。通過LS-2800型氣栗推動空氣進入系 統，氣流經活性炭、蒸餾水凈化加濕后通過玻璃轉子流量計進入Y形管兩側，流速控制在 0.5L/min。測試時，把P1CYP82轉基因擬南芥植株放到一個玻璃罐中，作為氣味源，放入某一 側臂，以GK377A01擬南芥作為對照放入另一側臂。從基管端部接入寄生蜂，每頭寄生蜂觀察 5min，如寄生蜂爬過側壁1/3處并停留lmin以上記為對該物質有反應，否則記為無反應。測 試溫度為(25 ± 2) °C。重復3次，每次測試30頭寄生蜂。
[0083]結果如圖7所示，為Y型嗅覺儀檢測轉P1CYP82的擬南芥揮發物對小菜蛾絨繭蜂雌 蟲的行為反應的影響，結果顯示，經卡方測驗轉基因株系與野生型對照植株差異極其顯著 (x2 = 36.54，P〈0.01)。說明T2代轉P1CYP82揮發物擬南芥樣品對小菜蛾盤絨繭蜂具有顯著的 吸引作用。
【主權項】
1. 一個參與DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因蛋白，其具有如SEQ ID N02所示的氨基 酸序列。2. 權利要求1所述的蛋白的編碼基因。3. 根據權利要求2所述的編碼基因，具有如SEQ ID N01所示核苷酸序列或SEQ ID N01 中第71-1657的核苷酸序列。4. 含有權利要求2或3所述的編碼基因的重組載體或轉基因細胞系或重組菌。5. 權利要求4所述的重組載體，為將權利要求2或3所述的編碼基因插入到表達載體中， 得到表達所述蛋白的重組載體。6. 根據權利要求5所述的重組載體，所述編碼基因具有SEQ ID N01所述的序列，該序列 插入真核表達載體PYES2的限制性內切酶BamH I和Nhel位點。7. 權利要求4所述的重組菌，為將權利要求6或7所述的重組載體導入目的菌得到的重 組菌，所述目的菌具體為酵母菌株WAT21。8. 根據權利要求1所述的蛋白或權利要求2或3所述編碼基因或權利要求4-7任一重組 載體或重組菌在生物合成DMNT和TMTT以及吸引小菜蛾絨繭蜂雌蟲中的應用。9. 根據權利要求8所述的應用，為將表達的CYP450基因蛋白加入到以（E)-橙花叔醇和 (E，E)_香葉基芳樟醇為底物的體外酶促反應體系中，得到DMNT和TMTT。
【專利摘要】本發明涉及一個參與DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因及其編碼產物與應用，屬于植物分子生物領域，本發明提供的蛋白如SEQ？ID？NO2所示的氨基酸序列。本發明的實驗證明，本發明得到立馬豆PlCYP82的cDNA核酸序列及PlCYP82編碼蛋白序列；在酵母WAT21細胞中表達的PlCYP82蛋白具有催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香葉基芳樟醇的活性；采用浸花法獲得轉PlCYP82基因擬南芥，結果表明轉PlCYP82的擬南芥植株可顯著吸引小菜蛾絨繭蜂雌蟲。
【IPC分類】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/53, C12N15/81, C12N1/19, C12N9/02
【公開號】CN105647880
【申請號】
【發明人】王桂榮, 李峰奇, 楊婷, 劉楊
【申請人】中國農業科學院植物保護研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月4日