ACTTTGGTGCCCTTTTTAGG；3RACE primer1:GGCATGACATTTGGGCTGCAAGTGC； 3RACE primer2:GTTAGGAGTGGCTTTGCCTAAAGAA，引物由北京華大基因公司合成。通過巢氏 PCR獲得基因全長。
[0030] 立馬豆種子，公眾可從中國農業科學院植物保護研究所獲得。
[0031] 以立馬豆的cDNA為模板，通過RACE擴增，得到1713bp的PCR產物（圖1)(含70bp的5 ' UTR和56bp的3'UTR序列）。目的片段利用TA克隆的方法連接到T-easy載體(購自北京全式金 公司）后，構建成P1CYP82測序載體，經過測序(序列見SEQ ID N01)，該1713bp的PCR產物含 有的基因編碼區位于第71-1657位，將該基因命名為P1CYP82,該基因編碼的蛋白命名為 P1CYP82;該蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID N02,共528個氨基酸。經過序列比對， 卩1〇￥?82與擬南芥&丨3825180基因核苷酸的相似性為43%。
[0032] P1CYP82測序載體為將序列表中的序列1插入T-easy載體得到的載體。
[0033] 實施例3.P1CYP82在合成TMTT和DMNT中的應用
[0034] 1.載體構建
[0035] 以T-P1CYP82測序載體為模板，利用高保真酶TranStartFastPfu DNA Polymerase 及引物P1CYP82F1 ( 5 ' -GATCGGACTACTAGCAGCTGTAATACGACT-3 '）/PlCYP82Rl (5 ' -GGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCG-3'），得到1713bp的帶有A末端的目的片段(具有序列表中序 列1的核苷酸）。將上述帶有A末端的目的片段參照全式金生物有限公司pEASY-El Expression Kit說明書與載體pEASY-El連接，得到的連接產物轉入普通大腸桿菌后涂于含 Amp (50mg/ml)的LB平板上過夜培養。
[0036] 挑取單克隆利用T7F(5'-TAATACGACTCACTATA-3'）及目的基因下游引物P1CYP82R1 進行檢測，得到陽性克隆。將陽性克隆提取質粒送去測序，該質粒為將序列表中序列1自5' 末端第71-1657位核苷酸利用TA克隆的方法插入載體pESC-TRP的BamH I和Nhel酶切位點間 得到的載體，命名為pESC-TRP-P 1CYP8 2。
[0037]將PESC-TRP-P1CYP82轉化DH5a感受態細胞，轉化過程見天根生化科技(北京)有限 公司DH5a感受態細胞說明書，將DH5a/pESC-TRP-PlCYP82利用目的基因特異引物進行PCR檢 測，證明pESC-TRP-P 1CYP82已轉入大腸桿菌中（圖2)。
[0038] 2.P1CYP82蛋白的誘導表達
[0039] 采用Clontech公司提供的LiAc/ssDNA/PEG法制備釀酒酵母感受態細胞并進行重 組質粒的轉化。將構建的PESC-TRP-P1CYP82質粒轉化表達宿主菌WAT21，獲得的酵母轉化子 經菌液PCR檢驗，20ul反應體系為:Easy Taq DNA聚合酶0.2ul、10倍buffer 2ul，d NTP混合 物1.6111(2.5111111〇1/1)、？10￥?82基因的上下游引物各0.5111(10.011111〇1/1)，經玻璃珠破壁處 理的模板適量，用ddH 20補足至20ul。反應程序為：94°C預變性10min，94°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸1.5min，32個循環，最后72°C延伸lOmin。選取PCR檢驗為陽性的菌落進行下 一步試驗。以轉入pESC-TRP空載體的釀酒酵母作為對照。將酵母陽性克隆接種到5mL含2% 葡萄糖的SC-TRP液體培養基中，于300C，300r/min過夜培養，10mL體積擴大培養至OD600達到 0.8,3次重復，培養物于4°(：110(^離心51^11，細胞沉淀用等體積(1(1!1 20洗滌3次后換用含2% 半乳糖的SC-TRP液體培養基重懸，所得菌體制成微粒體用于進行酶活檢測。
[0040] 在含有PESC-TRP-P1CYP82表達蛋白微粒體的緩沖體系加入NADPH和底物(E)-橙花 叔醇和(E，E)-香葉基芳樟醇進行催化反應，緩沖體系包括50mM的Tric-HCl (PH 7.4)、ImM的 EDTA、0.6M的山梨醇、20%的甘油，111^熟0?!1和4(^1底物化)-橙花叔醇和化3)-香葉基芳樟 醇，另外在PH范圍7.4-8.0的緩沖體系中均有相同的功能。催化反應溫度20-40度之間，15分 鐘以上。反應完全后用正己烷萃取催化產物，進行GC-MS分析。取ΙμL樣品進樣，利用氣質聯 用系統GC-MS (ΗΡ6890/ΗΡ5973，Hewlett-Packard公司），色譜柱HP-5MS (60m X 250μπι X 0 · 25μ m;Hewlett_Packard公司），GC_MS儀器進行分析。升溫程序為:40°C保持lmin，以5min5°C的 增量升到250 1€(1°(：/1^11)，最后250°(：保持171^11(^檢測范圍為40-550，溫度為170°(：。結果 發現以（E)-橙花叔醇和(E，E)_香葉基芳樟醇為底物，包含有P1CYP82基因重組表達載體 PESC-TRP-P1CYP82催化組與空載體對照以及其他基因表達載體反應產物相比有新物質產 生（圖3)，氣質譜圖如圖3,與DMNT和TMTT質譜圖相一致，產物鑒定為DMNT和TMTT。說明 CYP450基因編碼的蛋白在DMNT和TMTT合成代謝途徑中能催化(E)-橙花叔醇和(E，E)_香葉 基芳樟醇生成DMNT和TMTT(圖3)。
[0041 ] 實施例5.P1CYP82在擬南芥揮發TMTT中的應用 [0042] 1.轉P1CYP82回補擬南芥at3g25180突變體的獲得
[0043] 1)表達載體的構建
[0044] 對目的基因引物P1CYP82F2 : ATGGATTCCCATGTCCCAAC和P1CYP82R2 : TCAAAGGCTTTCATAAAGCATCA增加 Spe I和Sst I酶切位點，以立馬豆cDNA為模板，利用高保真 酶進行擴增。PCR反應體系為5XTans FastPfu Buffer 10yl，dNTP(2.5mmol · Ι-Ι'δμL， TansFastPfu DNAPolymerase ΙμL,Forward primer(lOymol · L_1)lyKReverse primer(10 μπιο? · 1-1)141'0財1以1，用(1(1!12〇補足至5(^1。？0?的反應條件為951€21^11 ;951€2〇8,6〇1€ 2〇8,72°(：158,40個循環 ；721€5111丨11;4°(：保存。
[0045] 1%瓊脂糖凝膠電泳，結果為得到1587bp的PCR擴增產物，切膠回收，得到回收片 段。將PCB302-3過表達載體質粒與回收片段同時利用Spe I和Sst I進行4h雙酶切，該載體 含有CaMV35S啟動子，可驅動目的基因的過量表達。連接載體的酶切體系為10XNEB Buffer45yl，100XBSA 0.5yl，PlCYP82質粒或回收片段2yg，Spe Ilyl，Sst Ι?μL，用ddH20 補足至50μ1。純化回收酶切產物。T4連接酶4°C過夜連接，連接體系為pCB302-3片段3μ1，目 的基因酶切片段2μ1，10 X Buffer ΙμL，T4DNA LigaseO · 5μ1，用ddH20補足至10μ1。連接產物 轉化大腸桿菌后，得到轉化子。提取轉化子的質粒，用引物P1CYP82F/R進行PCR檢測、酶切鑒 定，測序結果表明該質粒為將序列表中序列1自5'末端第71-1657位核苷酸插入pCB302-3的 Spe I和Sst頂每切位點得到的質粒，將該質粒命名為PCB302-3-P1CYP82。
[0046] 2)農桿菌介導的擬南芥轉化(浸花法）
[0047] A:擬南芥at3g25180突變體
[0048] 擬南芥at3g25180的T-DNA插入突變體，編號為GABIKat(GK)377A0lUNASC (uropean Arabidopsis Stock Centre)購買獲得。該突變體的回補實驗可用于證實TMTT通 路上P450候選基因的功能，詳細請參考Lee S，Badieyan S，Bevan D R，et al.Herbivore-induced and floral homoterpene volatiles are biosynthesized by a single P450enzyme(CYP82G1)in Arabidopsis.Proceedings of the National Academy of Sciences ,2010,107(49) :21205-21210·選擇純合的GK377A01突變體用于基因回補實驗。
[0049] B:農桿菌電擊感受態的制備
[0050] (1)挑取農桿菌AGL1單菌落接種到lml的LB液體培養基中，短暫渦旋使細胞充分懸 浮，將懸浮液接種到l〇ml含梭芐霉素400mg/L的LB液體培養基中，28°C，250rpm震蕩培養過 夜；
[0051 ] (2)將10ml已培養的菌液接種到100ml含400mg/L羧芐霉素的LB液體培養基中，28 °C，250rpm震蕩培養，在0D值為0.5左右時，進行操作；
[0052] (3)將在冰上靜置30min后菌液的，在4°C條件下，4000rpm離心10min，去上清，加入