粒、重組質粒;7~9分別為IPTG誘導6h的空菌株、空質粒、重組質粒；10~12分別為IPTG誘導 9h的空菌株、空質粒、重組質粒;13~15分別為IPTG誘導24h的空菌株、空質粒、重組質粒。 [0026]圖4是本發明實施例5中通過構建植物超表達載體pCamE-GmPAP36,利用農桿菌介 導轉化技術將其轉入擬南芥，對T 3轉基因擬南芥植株進行目的基因 PCR檢測的結果圖。圖中 1~14為T3轉基因擬南芥植株，除4、10以外，其余均為篩選得到的含有GmPAP36的轉基因陽 性植株，Μ是DNA Marker DL2000，B為空白對照，W為野生型對照，P為質粒陽性對照。
[0027]圖5是本發明實施例5中T3代轉GmPAP36擬南芥實時定量PCR檢測結果圖。WT為野生 型對照;0E-1~0E-6為轉GmPAP36擬南芥不同株系。
[0028]圖6是本發明實施例5中以超表達轉GmPAP36基因0Ε-1、0Ε-3、0Ε-4株系為材料，分 析轉基因擬南芥與野生型對照根系酸性磷酸酶活性的結果圖。其中橫坐標為供試材料，WT 為野生型對照，0E-1、0E-3、0E-4為轉GmPAP36擬南芥株系；縱坐標為酸性磷酸酶活性，以每 個植株每小時催化P-NPP釋放P-NP的數量表示，單位為mmol/L。
[0029] 圖7是本發明實施例5中以超表達轉GmPAP36基因0Ε-1、0Ε-3、0Ε-4株系為材料，分 析轉基因擬南芥與野生型對照根系植酸酶活性的結果圖。其中橫坐標為供試材料，WT為野 生型對照，0E-1、0E-3、0E-4為轉GmPAP36擬南芥株系；縱坐標為植酸酶活性，以每個植株每 小時催化植酸鈉釋放無機磷的數量表示，單位為mm〇l/L。
[0030] 圖8是本發明實施例5中以超表達轉GmPAP36基因0Ε-1、0Ε-3、0Ε-4株系為材料，分 析轉基因擬南芥與野生型對照磷含量的結果圖。其中橫坐標為供試材料，WT為野生型對照， 0E-1、0E-3、0E-4為轉GmPAP36擬南芥株系;縱坐標為植株磷含量，單位為mg/株。
[0031]圖9是本發明實施例5中超表達轉GmPAP36擬南芥株系0E-U0E-4與野生型對照在 植酸磷處理條件下的生長情況圖，其中A為野生型對照，B、C為轉基因擬南芥株系0E-1與0E-4〇
[0032]圖10是本發明實施例5中進一步測定轉GmPAP36擬南芥與野生型對照生物重的結 果圖。
[0033]圖11是本發明實施例5中通過構建植物超表達載體pZYlO l-GmPAP36，利用花粉管 通道轉化技術轉入大豆，對轉基因大豆進行目的基因 PCR檢測的結果圖。圖中1~7為轉基因 大豆陽性植株，Μ是DNA Marker DL2000，B為空白對照，W為野生型對照，P為質粒陽性對照。 [0034]圖12是本發明實施例5中轉GmPAP36大豆實時定量PCR檢測結果圖。其中WT為野生 型對照，0E-3、0E-5、0E-7為轉GmPAP36大豆株系。
[0035] 圖13是本發明實施例5中以超表達轉GmPAP36基因0E-3、0E-5、0E-7大豆株系為材 料，分析轉基因大豆與野生型對照根系植酸酶活性的結果圖。其中WT為野生型對照;0E-3、 0E-5、0E-7為轉GmPAP36大豆株系。橫坐標為大豆不同發育時期，縱坐標為植酸酶活性，以每 株大豆每小時催化植酸鈉釋放無機磷的數量來表示，單位為mmol/L。
[0036] 圖14是本發明實施例5中以超表達轉GmPAP36基因0E-3、0E-5、0E-7大豆株系為材 料，分析轉基因大豆與野生型對照根系酸性磷酸酶活性的結果圖。其中WT為野生型對照； 0E-3、0E-5、0E-7為轉GmPAP36大豆株系。橫坐標為大豆不同發育時期，縱坐標為酸性磷酸酶 活性，以每株大豆每小時催化P-NPP釋放p-NP的數量來表示，單位為mmol/L。
[0037]圖15是本發明實施例5中以超表達轉GmPAP36基因 0E-3、0E-5、0E-7大豆株系為材 料，分析轉基因大豆與野生型對照植株磷含量結果圖。其中WT為野生型對照，0E-3、0E-5、 0E-7為轉GmPAP36大豆株系。橫坐標為大豆不同發育時期，縱坐標為植株磷含量，單位為mg/ 株。
[0038] 圖16是本發明實施例5中以超表達轉GmPAP36基因 0E-3、0E-5、0E-7大豆株系為材 料，分析轉基因大豆與野生型對照單株莢數和單株粒重結果圖。其中WT為野生型對照，(?-3、0E-5、0E-7為轉GmPAP36大豆株系。橫坐標為上述大豆材料的單株莢數及單株粒重，縱坐 標為單株結莢個數或單株粒重克數。
【具體實施方式】
[0039]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0040] 實施例1 GmPAP36基因的分子克隆
[0041 ] 1.大豆幼苗培養與磷素處理:選取飽滿、整齊一致的大豆品種'中黃15 '種子進行 催芽，催芽后選擇出芽一致的材料播種于石英砂，3d后移栽至蛭石。待對生真葉展開后，進 行植酸磷（1.〇1111]1〇1凡)處理，對照米用1(!12?〇4處理，濃度為1.〇1111]1〇1凡。在磷素處理21(1后取 樣，所取樣品迅速在液氮中冷凍，_80°C低溫冰箱保存待用。
[0042] 2.實時定量PCR分析所用材料處理:選取飽滿、整齊一致的磷高效大豆'中黃15 '和 磷低效大豆'牛毛黃'種子播種于蛭石，7d后選取植株根系樣品進行分析，并記為0d;隨后進 行2個不同磷素處理(適磷條件為1.0mm〇l/L的KH2P〇4,低磷條件為1.0mmol/L植酸磷），并在 磷處理后的14(1、28(1、42(1、56(1、70(1及77(1分別取樣，所取樣品進行液氮冷凍，-80°(：低溫冰箱 保存待用。
[0043] 3.大豆總RNA提取：大豆植株總RNA(適磷、植酸磷處理）提取參照TRNzol Total RNA Reagent操作指南進行。
[0044] 4. cDNA反轉錄合成：大豆植株總RNA經反轉錄后獲得cDNA，合成過程參照 PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作指南進行。
[0045] 5.PCR擴增所用引物的設計:利用前期構建的大豆SSH文庫(張俊紅.低磷脅迫大豆 SSH文庫構建與分析.河北農業大學碩士論文，2010)，獲得低磷誘導表達的紫色酸性磷酸酶 基因 EST(SEQ ID N0:3)，利用該EST為種子序列，在NCBI網站檢索大豆EST數據庫，根據檢索 結果找到高度同源的cDNA序列，將高度同源cDNA序列利用DNAStar軟件中的SeqMan進行拼 接組裝，以組裝序列為檢索序列，再次BLAST檢索大豆EST數據庫并進行序列組裝，直至沒有 新的EST檢出，該EST序列即新生序列；尋找新生序列的開放閱讀框(0RF)，并設計特異性引 物GmPAP36-Fl、GmPAP36-Rl，進行PCR擴增以檢驗序列的真實性。其中GmPAPSe-FUGmPAPSe-Rl 引物序列如下 ：
[0046] GmPAP36-Fl:5 '-ATGGGTGTTGTGGAGGGTCTCTTAG-3 '
[0047] GmPAP36-Rl:5 '-TTAATGTGAAACATGAGCAGTGGAATCATC-3，
[0048] 6 . GmPAP36基因開放閱讀框（0RF)的分子克隆：利用設計好的引物GmPAP36-F1、 GmPAP36-Rl，以植酸磷處理的'中黃15 ' cDNA為模板進行PCR擴增，克隆GmPAP36基因的開放 閱讀框序列。PCR反應體系及程序如下：
[0049] PCR反應體系： '中黃 15'cI)NA 1.0 μι 1 〇、PCR bu(Kb_ (含 Mg2- ) 2.0 μL 2.5 niM dNTPs 2.,0 pL
[0050] 以 DNA 聚合酶（2.5 UVL ) 0.3 μL GmPAP36-F\ ( 5 μΜ ) i.0 μL GmmP36-Rl ( 5 μΜ ) 1.0 μι ddH20 12.7 μL
[0051] PCR反應程序： 95 C ΙΟ min 95 C 1 min r ? 58 °C 1.5 min
[0052] 72 ? i min go lo step 2 35 cycles 72 °C 10 min
[0053] PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，并連接于pMD18-T載體，反應 體系如下： PCR產物 4pL pMD18-T Vector ( 50 ng ) 1 μL^
[0054] l〇x連接緩沖液 1 μL T4DNA連接酶 1 pL· ddH20 3 μL
[0055] 將上述混合液混勻后，16°C連接12h。
[0056] 7.利用上述連接產物轉化大腸桿菌菌株ToplO感受態細胞，挑取陽性克隆，進行質 粒提取，經酶切檢測和測序分析，獲得GmPAP36基因的開放閱讀框序列，長度為140 lbp，序列 如SEQ ID從)：2所示（圖1)。
[0057] 實施例2 GmPAP36基因在不同大豆品種中的表達分析
[0058] 以GmPAP36為目標基因，大豆組成型表達Actinl 1基因為內參對照，設計實時定量 PCR引物GmPAP36-F2和GmPAP36-R2,采用SYBRKGl，een I熒光染料法進行實時定量PCR，通 過比較Ct進行GmPAP36基因表達量分析。
[0059] GmPAP36-F2:5 '-ATGACAGAACCACAGCCAAAGTAT-3 '
[0060] GmPAP36-R2:5 '-CAGCAACTCCATCTTGATTTCG-3 '
[0061] GmPAP36基因在不同大豆品種根系中的相對表達量=2 Met，
[0062] ^^中 Δ ACt -(CtGmPAP36_CtActinll )|358??-(Ct GmPAP36_Ct Actinll)????
[0063] 植酸磷處理下GmPAP36基因在'中黃15'（磷高效大豆品種）與'牛毛黃'（磷低效大 豆品種)根系中的差異表達結果見圖2。
[0064]由圖2可見，植酸磷處理30d~77d，GmPAP36基因在'中黃15'根系的表達量顯著或 極顯著高于'牛毛黃'中的表達量（除70d二者差異不顯著外），且在植酸磷處理42d時， GmPAP36在'中黃15'根系的表達量為'牛毛黃'根系中表達量的3.6倍。此時正值大豆結莢期 和鼓粒期，磷的供應充足與否直接影響著大豆產量與品質，而GmPAP36在該時期能夠高效表 達，以分解利用根際周圍的植酸磷，滿足大豆生殖生長所需。
[0065] 實施例3 GmPAP36基因的原核表達
[0066] 1.分析GmPAP36和原核表達載體pET-32a( + )的序列，設計引物GmPAP36