至100mL三角瓶中，25 °C 條件下生長Id，向三角瓶中添加2mL 0.5mmol/L的NaOH以終止酶促反應，隨后于820nm波長 下測定溶液吸光值;植酸酶的活性以每株大豆每小時催化植酸鈉釋放無機磷的數量來表 不。
[0116] 以超表達轉GmPAP36基因0E-3、0E-5、0E-7大豆株系為材料，分析轉基因大豆與野 生型對照根系植酸酶活性，結果見圖13,在植酸磷處理條件下，轉基因株系0E-3、0E-7根系 植酸酶活性(極)顯著高于野生型對照，說明GmPAP36能夠正常編碼，并顯著地提高了轉基因 大豆根系的植酸酶活性。
[0117] 6.轉基因陽性植株表型觀察及生物重與磷含量測定
[0118] 分別觀察上述轉基因材料和野生型對照植株在植酸磷處理下的生長情況，并收獲 擬南芥植株，進行生物重的測定;轉基因植株和野生型對照的磷含量測定采用出50 4-出02消 煮，釩鉬黃比色法。
[0119] 以超表達轉GmPAP36基因0Ε-1、0Ε-3、0Ε-4株系為材料，分析轉基因擬南芥與野生 型對照植株磷含量，結果見圖8。在植酸磷處理條件下，轉基因株系0E-U0E-4植株磷含量極 顯著高于野生型對照，說明由于GmPAP36的轉入，使得轉基因擬南芥能夠分解利用根際周圍 的植酸磷，提高了植株體內的磷素含量。
[0120] 超表達轉GmPAP36擬南芥株系0E-U0E-4與野生型對照在植酸磷處理條件下的生 長情況見圖9。結果發現，植酸磷處理下，與野生型相比，轉GmPAP36擬南芥植株表現出葉片 較大、葉柄較長、生長勢強等特點，而野生型對照則表現出葉片較小、葉柄較短、生長勢弱的 缺磷癥狀，表明轉基因擬南芥由于可以分解利用根際周圍的植酸磷，因而受低磷影響較小， 缺磷癥狀表現較輕。
[0121] 進一步測定轉GmPAP36擬南芥與野生型對照生物重，結果見圖10，由圖可見，植酸 磷處理條件下，轉GmPAP36擬南芥生物重與野生型相比提高了39.3%，且二者差異極顯著， 說明轉基因擬南芥由于可以分解利用根際周圍的植酸磷、受低磷影響較小，故而具有較高 的生物重，而野生型對照由于受低磷影響較大，生物重較低，因此GmPAP36具有提高轉基因 擬南芥根際周圍植酸磷利用效率的功能。
[0122] 以超表達轉GmPAP36基因0E-3、0E-5、0E-7大豆株系為材料，分析轉基因大豆與野 生型對照植株磷含量，結果見圖15。在植酸磷處理條件下，轉基因株系0E-3、0E-5、0E-7植株 磷含量(極)顯著高于野生型對照，說明由于GmPAP36的轉入，使得轉基因大豆能夠分解利用 根際周圍的植酸磷，提高了植株體內的磷素含量，因此GmPAP36具有分解利用轉基因大豆根 際周圍植酸磷的作用。
[0123] 7.轉基因大豆陽性植株產量相關性狀的測定
[0124] 分別測定上述轉基因大豆陽性材料和野生型對照植株在植酸磷處理下的單株莢 數和單株粒重，測定方法參照國家大豆品種區域試驗調查項目及標準。
[0125] 以超表達轉GmPAP36基因0E-3、0E-5、0E-7大豆株系為材料，分析轉基因大豆與野 生型對照單株莢數和粒重，結果見圖16。在植酸磷處理條件下，與野生型對照相比，轉基因 株系0E-3、0E-5、0E-7單株莢數分別增加 25.0%、19.7%、32.9%，單株粒重分別增加 15.1%、14.4%、17.7%，且達到顯著或極顯著水平，說明由于GmPAP36能夠分解利用大豆根 際周圍的植酸磷，提高了植株體內的磷素含量，使得轉基因大豆受低磷環境影響較小，增加 了轉基因大豆在植酸磷條件下的產量相關性狀。
[0126] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
[0127] 參考文獻
[0128] [ 1 ]戴開結，何方，官會林，沈有信，張光明.植物與低磷環境研究進展一一誘導、適 應與對策[J].生態學雜志，2006,25(12) :1580-1585.
[0129] [2]谷俊濤，李金才，韓勝芳，肖凱.異源表達白羽扇豆酸性磷酸酶基因對白三葉草 磷吸收的影響[J] ·草業學報，2007，16(4):69-75 ·
[0130] [ 3 ]李喜煥，常文鎖，張彩英.提高植物磷營養效率(候選)基因研究進展[J].植物 遺傳資源學報，2012,13(1 ):83-97.
[0131] [4]喬亞科，李桂蘭.作物耐低磷機制及耐低磷育種研究進展[J].河北科技師范學 院學報，2007,21(1) :67-73.
[0132] [ 5]吳平· http://www.cls .zju.edu.cn/wulab/poster .PDF ,2010.
[0133] [6]肖凱，谷俊濤，Harrison M，Wang Z Y.MtPAPl表達特性及異源表達對擬南芥有 機態磷吸收的影響[J].植物生理與分子生物學學報，2006，32( 1):99-106.
[0134] [7]Baek D,Kim M C,Chun H J,Kang S,Park H C,Shin G,Park J,Shen M,Hong H,Kim ff Y,Kim D H,Lee S Y,Bressan R A,Bohnert H J,Yun D J.Regulation of miR399f transcriptionby AtMYB2 affects phosphate starvation responses in Arabidopsis[J],Plant Physiol.,2013,161(1):362-373.
[0135] [8]Bilyeu K D,Zeng P Y,Coello P,Zhang Z Y J,Krishnan Η B,Bailey A, Beuselinck P R,Polacco J C.Quantitative conversion of phytate to inorganic phosphorus in soybean seeds expressing a bacterial phytase[J].Plant Physiol., 2008,146:468-477.
[0136] [9]Bozzo G G,Raghothama K G,Plaxton ff C . Pur i f i ca t i on and characterization of two secreted purple acid phosphatase isozymes from phosphate-starved tomato(Lycopersicon esculentum)cell cultures[J] .Eur.J.Biochem.,2002,269(24):6278-6286.
[0137] [ 10]Brinch-Pedersen H,Sorensen L D,Holm P B.Engineering crop plants: getting a handle on phosphate[J].Trends Plant Sci.,2002,7:118-125.
[0138] [11]George T S,Richardson A E.Potential and limitations to improving crops for enhanced phosphorus utilization[J].Plant Ecophysiology,2008,7:247-270.
[0139] [12]Kong Y B,Li X H,Ma J,Li ff L,Yan G J,Zhang C Y.GmPAP4,a novel purple acid phosphatase gene isolated from soybean(Glycine max),enhanced extracellular phytate utilization in Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell Rep., 2014，D0I 10.1007/s00299-014-1588-5.
[0140] [13]Kuang R B,Chan K H,Yeung E，Lim B L.Molecular and biochemical characterization of AtPAP15，a purple acid phosphatase with phytase activity, in Arabidopsis[J].Plant Physiol.,2009,151:199-209.
[0141] [ 14 ] LeBansky B R，Mckn i gh t T，Gr i f f ing L R · Pur i f i ca t i on and characterization of a secreted purple phosphatase from soybean suspension culture[J].Plant Physiol.,1992,99:391-395.
[0142] [15]Li C C,Gui S H,Yang T,ffalk T,ffang X R,Liao H.Identification of soybean purple acid phosphatase genes and their expression responses to phosphorus availability and symbiosis[J].Ann.Bot.,2012,109:275-285.
[0143] [16]Li G L,Yang S H,Li M G,Qiao Y K,ffang J H.Functional analysis of an Aspergillus ficuum phytase gene in Saccharomyces cerevisiae and its root-specific，secretory expression in transgenic soybean plants[J] .Biotechnol.Lett.，2009,31:1297-1303.
[0144] [17]Liang C，Tian J，Lam H M，Yan X L，Liao H.Biochemical and molecular characterization of PvPAP3,a novel purple acid phosphatase isolated from common bean enhancing extracellular ATP utilization[J].Plant Physiol·，2010， 152(2):854-864.
[0145] [18]Liao H，Wong F L，Phang T H，Cheung M Y，Li W Y F，Shao G H，Yan X L， Lam H M.GmPAP3,a novel purple acid