-F3和 GmPAP36-R3(GmPAP36-F3:5 '-GGATCCGACAGCGATGTCTTTGC-3 '，GmPAP36-R3:5 '-GAGCTCTGAAACATGAGCAGTGGAA-3'），以擴增含有合適酶切位點的GmPAP36序列，將該序列與 pMD-T載體連接，形成中間重組子pMD-GmPAP36，并測序以確定其序列正確性。利用BamHI與 SacI分別酶切pMD-GmPAP36和原核表達載體pET-32a( + )，回收目的片段，酶切反應體系如 下： Si/cl ..1 μ L
[0067] BamH\ 1 μL 1〇χΚ BuiTcr 2 t.iL ^ 質粒 5 μL
[0068] Η?0 ? ? ,liL
[0069] 2.將回收的pET-32a( + )表達載體與GmPAP36酶切片段進行連接，反應體系如下： 片段 5 pET-32a(+)載體. ? μL
[0070] T4DNA 連接酶 IpL l〇x連接緩沖液 IpL 細20 2 "L
[0071] 混勻后16Γ連接12~16h。
[0072] 3.融合重組蛋白的誘導表達:將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經 PCR和酶切檢測，鑒定陽性克隆，將陽性克隆的質粒轉化大腸桿菌BL21菌株，挑取陽性克隆， 經質粒提取、酶切檢測，測序鑒定，得到含有GmPAP36基因正確編碼序列的BL21陽性克隆。 [0073] 4. SDS-PAGE蛋白電泳分析：利用0.8mmol/L IPTG誘導表達轉有原核表達載體的 BL21菌株，分別收集誘導前、誘導后的菌液。將收集的菌液離心后，倒出液體，分別加入200μ L上樣緩沖液，振蕩混勻后，置于沸水中lOmin，瞬時離心；分別配置12%的分離膠，5%的濃 縮膠，待其室溫聚合完畢后，拔出梳子。取30yL菌液樣品上樣;濃縮膠部分以80V恒壓，分離 膠部分以120V恒壓電泳。電泳結束后，將電泳膠從電泳板上剝下，先用蒸餾水沖洗干凈，然 后用染色液室溫染色2h，置于脫色液中直至出現清晰的條帶（圖3)。
[0074]對重組質粒轉化的BL21受體菌株進行誘導表達試驗，結果表明，經終濃度為0.8mM 的IPTG誘導，重組質粒在大約61.2KDa的位置上出現了特異條帶，與預期的表達目標蛋白大 小一致。
[0075] 實施例4 GmPAP36植物超表達載體構建 [0076] 1.植物超表達載體pCamE_GmPAP36的構建
[0077] (1)分析GmPAP36和植物表達載體pCamE的酶切位點，設計含有合適酶切位點的引 物 GmPAP36-F4 和61^八卩36-1?4(611^八？36-卩4:5'-1'(^八6八八了666了6176了66八6661'0'-3'，611^八？36-R4:5 '-CCCGGGTTAATGTGAAACATGAGCAGTGG-3 '）；利用上述引物PCR擴增GmPAP36 目的片段;經 連接，轉化，選取單克隆及測序后，得到pMD-GmPAP36中間重組子，擴增體系和程序如下： [0078] PCR擴增反應體系： cDNA 1.0 μL 6ιηΡΑΡ3?-￥4 1.0 μL GmPAP36-R4 1.0 μL.
[0079] 2.5 mM dN'TPs 2.0 μL lOxPCR反應緩沖液 2.0 μL LA DNA 聚合酶 0.3 μι· ddH20 12.7 μL
[0080] PCR擴增程序： 95'€ 10 min 95 C 1 min 60 C ] .5 min
[0081] 72 "C 1 min go lo step 2 30 cycles 72°C 10 min
[0082] (2)采用Xbal和Sma頂每切pMD-GmPAP36和pCamE載體，反應體系如下： Xha\ 1 μL. Sma\ 1 hL 1〇χ? BuiTcr 2 uL
[0083] BSA 2 (_iL 質粒 8 μL Η,Ο 6μL
[0084] (3)酶切完成后，經電泳檢測，將片段大小正確的目的條帶，分別進行膠回收;利用 紫外分光光度計測定其濃度，使回收的載體片段與目的片段摩爾比為1:3~1:10。將目的片 段與載體片段進行連接，反應體系如下： A^片段 0.2 pmol pCamE 0.03 pmol
[0085] T_4DNA 連接酶（3 U/.uL) 1.0 μL l〇x連接緩沖液 Ι.ΟμΙ ddH20 補足至ΙΟ μΙ
[0086] 混勻后，16Γ連接12~16h。
[0087] (4)將連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，菌液PCR和酶切鑒定陽性克隆，并 進行測序分析，測序正確的重組子即為構建成功的pCamE-GmPAP36載體。
[0088] 2 ·超表達載體pZY101-GmPAP36的構建
[0089] 利用已經構建完成的pCamE-GmPAP36超表達載體，采用EcoRI和Hindin酶切載體 上的啟動子、GmPAP36及終止子，并連接到ρΖΥΙΟΙ表達載體。
[0090] 酶切體系為： EcoR\ .1 pL Hituim 1 rL
[0091 ] 1 ΟχM Buffer 2 μΙ 質粒 8 pL. Β?ο 8 pL
[0092] 酶切完成后，經電泳檢測，將片段大小正確的目的條帶，分別進行膠回收，利用紫 外分光光度計測定其濃度，使回收的載體片段與目的片段摩爾比在1: 3~1: 8。將目的片段 與載體片段進行，反應體系如下： 片段 0.2 pmol ρΖΥΙΟΙ 0,03 pmol
[0093] T4 DNA 連接酶（3 U/pL) 1.0 μL 1〇Χ連接緩沖液 1.0 補足至10μΕ
[0094] 混勻后，16°C連接12~16h。將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經PCR和酶 切鑒定陽性克隆，并進行測序分析，測序正確的重組子即為構建的pZY101_GmPAP36表達載 體。
[0095] 實施例5 GmPAP36基因生物學功能分析
[0096] 1.擬南芥與大豆遺傳轉化:采用浸花法(Floral dip)將攜帶有pCamE-GmPAP36的 農桿菌轉入Columbia型擬南芥；采用花粉管通道法將pZY101-GmPAP36載體轉入大豆品種 '冀 NF58'。
[0097] 2.轉基因陽性植株DNA分子鑒定:根據表達載體序列和GmPAP36開放閱讀框序列設 計跨載體引物GmPAP36-F5和GmPAP36-R5(GmPAP36-F5:5 ' -CTAACAGAACTCGCCGTAAAGACT-3 '， GmPAP36-R5:5 ' -AACATTGGAAACACGCTCAGAT-3 '），PCR鑒定轉基因陽性植株。陽性植株自交， 植株成熟后，分單株收獲種子，干燥后的種子在_20°C保存待用（圖4和圖11)。
[0098] 3.轉基因陽性植株實時定量PCR分析:選取轉基因株系和野生型對照種子，播種在 蛭石中，提取植株總RNA、反轉錄cDNA，利用引物GmPAP36-F6和GmPAP36-R6，采用實時定量 PCR技術分析目的基因在轉基因植株中的表達量。實時定量PCR分析所用引物序列如下：
[0099] GmPAP36-F6:5 '-GGTCCCGATGTGCCATATACA-3 '
[0100] GmPAP36-R6:5 '-CCATGGTTGATAAGCAACACTCC-3 '
[0101] T3代轉GmPAP36擬南芥實時定量PCR檢測結果見圖5。首先提取T3轉基因擬南芥總 RNA，反轉錄為cDNA，進行實時定量PCR分析，結果發現野生型對照中沒有GmPAP36的表達，以 轉基因株系0E-1為參照，可見0E-3、0E-4株系中的GmPAP36表達量極顯著高于其它株系，故 選擇0Ε-1、0Ε-3、0Ε-4株系繼續進行后續研究。
[0102] 轉GmPAP36大豆實時定量PCR檢測結果見圖12。首先提取轉基因大豆RNA，反轉錄為 cDNA，進行實時定量PCR分析，結果發現3個轉基因株系中的GmPAP36表達量在植株生長苗期 和開花期均極顯著高于野生型對照，說明GmPAP36能夠在轉基因大豆中正常轉錄表達。
[0103 ] 4.轉基因擬南芥陽性植株的酶活測定
[0104] (1)根系酸性磷酸酶活性測定
[0105] 轉基因擬南芥和野生型對照生長20d，移至2.0mL離心管（含lmmol/Lp-NPP，p-NPP 為測定酸性磷酸酶活性的標準底物），24°C生長ld，取500yL 0.5mM NaOH終止反應，在410nm 波長下測定其吸光值;酸性磷酸酶活性為每個植株每小時催化P-ΝΡΡ釋放P-NP的數量(P-NP 為P-ΝΡΡ被分解后的產物）。
[0106] 以超表達轉GmPAP36基因0Ε-1、0Ε-3、0Ε-4株系為材料，分析轉基因擬南芥與野生 型對照根系酸性磷酸酶活性，結果見圖6,在低磷處理條件下，3個轉基因株系根系酸性磷酸 酶活性均極顯著高于野生型對照，說明GmPAP36能夠在蛋白水平正常表達，使轉基因擬南芥 根系的酸性磷酸酶活性極顯著提高。
[0107] (2)根系植酸酶活性測定
[0108] 轉基因擬南芥和野生型對照生長20d后，移至2.0mL離心管(含lmmol/L植酸鈉，植 酸鈉為測定植酸酶活性的標準底物），24°C生長2d，測定其植酸酶活性;植酸酶活性為每個 植株每小時催化植酸鈉釋放無機磷的數量(無機磷為植酸鈉被分解后的產物）。
[0109] 以超表達轉GmPAP36基因0Ε-1、0Ε-3、0Ε-4株系為材料，分析轉基因擬南芥與野生 型對照根系植酸酶活性，結果見圖7,在植酸磷處理條件下，轉基因株系0Ε-1、0Ε-4根系植酸 酶活性極顯著高于野生型對照，說明GmPAP36能夠正常編碼，并極顯著地提高了轉基因擬南 芥根系的植酸酶活性。
[0110] 5.轉基因大豆陽性植株的酶活測定
[0111] (1)酸性磷酸酶酶活性測定
[0112] 將轉GmPAP36大豆與野生型對照種子催芽后，移入石英砂中進行培養，待植株長出 根系后移入水培裝置，采用Hoagland營養液進行培養，28d后，將植株移至三角瓶（含P-NPP)，25°C條件下生長Id后，向三角瓶中加入2mL 0.5mmol/L的NaOH終止酶促反應，并于 410nm波長下測定溶液的吸光值;酸性磷酸酶活性以每株大豆每小時催化P-ΝΡΡ釋放P-NP的 數量來表示。
[0113] 以超表達轉GmPAP36基因0E-3、0E-5、0E-7大豆株系為材料，分析轉基因大豆與野 生型對照根系酸性磷酸酶活性，結果見圖14,在低磷處理條件下，轉基因株系0E-3、0E-5、 0E-7根系酸性磷酸酶活性在植株開花期顯著高于野生型對照，說明GmPAP36能夠正常編碼， 并顯著地提高了轉基因大豆開花期根系的酸性磷酸酶活性。
[0114] (2)植酸酶活性測定
[0115] 將轉GmPAP36大豆與野生型對照種子催芽后，移入石英砂中進行培養，待植株長出 根系后移入水培裝置，采用Hoagland營養液培養，28d后，將植株移