后加入2毫升質量分數為10 %的SDS， 55°C放置5min，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次;取最后一次的上清溶液，加入2倍體積乙 醇，回收DNA，分別用70%和無水乙醇洗;沉淀溶于0.5毫升TE緩沖液(pH8.0，10mM Tris，ImM EDTA)，加入lOmg/mL RNase 3yL，37°C保溫1小時，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次;上清 溶液加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70 %和無水乙醇洗，真空干燥，用去離子水溶解。 [0057]嗜堿芽孢桿菌Baci 1 lus sp. 703的信息參照文獻:盧爭輝，何家亨，張桂敏，一株堿 性淀粉酶產生菌的分離及酶學特性分析，安徽農業科學，2013，41 (7): 2857-2859.該菌株可 以為公眾所獲得。
[0058] (2)人工合成SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列的DNA片段。該合成過程在金斯瑞生 物科技有限公司完成。
[0059] 2、利用引物PCR擴增
[0060] 根據SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列設計引物對如下：
[0061 ]正向引物：5' -CGCGGATCCATGGATAGAAAATGGTGGAAAGAGGC-37，如SEQ ID N0· 3所示；
[0062] 反向引物：5' -GCGTCGACTTATGCTAATCGGTACACTCTCGCCTC-37，如SEQ ID N0·4所示；
[0063] 正向引物的下劃線部分為BamH I的酶切位點，反向引物的下劃線部分為Sal I酶 切位點。
[0064] 引物的合成在金斯瑞生物科技有限公司完成。
[0065] 以嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.703的總DNA或人工合成的SEQ ID N0.2所示的核苷 酸序列的DNA片段為模板，用設計的引物對進行PCR擴增。
[0066] PCR反應體系： ΓΠΠΑ7?
[0068] PCR反應條件：94°C預變性5min，然后94°C變性3〇8,55°(：退火1111丨113〇8,72°(：延伸 2min，30個循環，最后72°C延伸lOmin。
[0069] PCR產物用質量分數為0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產量和特異性，并用DNA純化 試劑盒(超薄離心柱型，天根公司生產)純化。將純化的PCR產物進行測序，結果表明PCR產物 的序列包括SEQ ID從).2所示1-1662位，并將其命名為&11^1120嫩片段。
[0070] 3、重組表達載體的構建
[0071] 1)將上述測序正確的PCR產物或人工合成的片段用BamH I和Sal I雙酶切，瓊脂糖 電泳回收酶切產物。
[0072] 2)將質粒pET28a(Cat.N0 69864-3，Novogen)用BamH I和Sal I雙酶切，瓊脂糖電 泳回收酶切產物。
[0073] 3)將步驟1)的酶切產物和步驟2)的酶切產物進行連接，連接產物電擊轉化大腸桿 菌DH5a后涂布于含有50yg/mL卡那霉素的LB平板，37°C過夜培養，將得到的轉化子用上述的 正向引物和反向引物進行菌落PCR，篩選到含有amyll2基因的重組菌，提取重組菌的質粒， 進行測序驗證，結果表明，在pET28a的BamH I和Sal I酶切位點之間插入了amyll2DNA片段， 該片段包括SEQ ID NO.2的自Y端起第1至1662位的核苷酸，插入方向正確，將該重組質粒 命名為pET28a_amy 112。
[0074] 4、工程菌的制備
[0075] 將質粒pET28a-amy 112電擊轉化大腸桿菌BL21 (DE3) (Cat · NO CD801，全式金公司） 后涂布于含有50yg/mL卡那霉素的LB平板，37 °C過夜培養，得到含有質粒pET28a-amyl 12的 工程菌，記作 BL21 /pET28a-amy 112。
[0076] 用pET28a代替pET28a-amy 112，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，步驟同上，得到含有 pET28a的重組菌，作為對照菌。將轉入pET28a的陽性重組菌記作BL21/pET28a。
[0077] 5、中性外切-α-l，4-糖苷酶的制備和純化
[0078] His60 Ni Superflow resin純化柱購自 TaKaRa公司，產品目錄號為635660。
[0079] GE HiTrap Desalting、GE HiTrap Q FF純化柱購自GE Healthcare公司，產品目 錄號分別為 17-1408-01、17-5053-01。
[0080] 將上述步驟4制備的陽性重組菌BL21/pET28a-amyll2培養于含有50yg/mL卡那霉 素的LB培養基中，37 °C培養3h; 0D6Q() = 0.7時，加入IPTG至其在LB培養基中的終濃度0.8mM， 轉至18°C繼續培養16h。
[0081 ] 在3800rpm、15min條件下離心收集菌體，懸浮于PBS溶液（20mM Tris-HCl，pH7.4， 0 · 5M NaCl)中，于冰浴中超聲破碎(60w，lOmin;超聲Is，停止2s)，之后12000rpm離心10min 除去細胞碎片，取上清液;將上清液過His60 Ni Superflow resin純化柱，用5mL超純水沖 洗，再用l〇mL溶液A(50mM NaH2P〇4-Na2HP〇4，pH7.0，25mM咪唑）漂洗，最后用5mL溶液B(50mM NaH2P〇4_Na2HP〇4，pH7 · Ο，500mM咪唑）洗脫，收集洗脫液。然后將洗脫液用脫鹽柱GE HiTrap Desal t ing進行脫鹽處理，用溶液C( 50mM Tr is-HCl，pH 7.0)進行洗脫，得到的洗脫液再過 陰離子交換柱GE HiTrap Q FF，先用溶液D(20mM Tris-HCl，pH7.9)洗脫雜蛋白，再用溶液E (20mM Tris-HC1，0.5M NaCl，pH7.9)洗脫目的蛋白，得到Amyll2純酶液。
[0082]將步驟4制備的對照菌采用相同的步驟進行培養和純化，得到的溶液作為對照酶 液。
[0083] SDS-PAGE電泳顯示純化的Amyll2蛋白的分子量約為64kDa，符合理論推斷的 64kDa。結果如圖1所示，圖1中，泳道Μ表示蛋白分子量標準（100，75，50，35，25kDa);泳道1表 示大腸桿菌此21八^283-31117112破菌后的上清液;泳道2表示附-1'^柱純化后的41117112蛋 白；泳道3表示GE Desalting脫鹽柱純化后的Amyll2蛋白；泳道4表示陰離子交換柱GE HiTrap Q FF純化后的Amyll2蛋白。可以看出已經獲得了Amyll2蛋白。同時進行了對照組的 實驗，但對照菌并沒有得到目的蛋白。
[0084]實施例2、以支鏈淀粉為底物驗證蛋白功能
[0085] 酶活單位定義為lmin內催化產生Ιμπιο?葡萄糖所需的酶量。
[0086] ( - )最適溫度
[0087] 用ρΗ7.0的50mM NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液稀釋實施例1的步驟5中的Amy 112純酶液， 用稀釋后的酶液進行酶活測定。將稀釋后的酶液記作稀釋酶液。
[0088] 溶液A組成：由50mM，pH7. ONaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液和支鏈淀粉溶液組成;支鏈淀粉 在溶液A中的濃度為lg/100mL。
[0089] 實驗組:活性測定反應體系為0.5mL，由0.45mL溶液A和0.05mL稀釋酶液;反應體系 的pH值為7.0;反應體系在特定溫度范圍（30-50 °C )內溫育30min后，沸水浴5min終止反應， 加入0.5mL二硝基水楊酸溶液(DNS)，然后沸水浴5min，迅速冷卻后測定OD 54〇。
[0090] 結果如圖2所示。圖2表明，外切-α-1，4-糖苷酶具有外切酶活性。在40°C條件下，外 切-α-1，4-糖苷酶具有最高的酶活性，為1260mU/mg蛋白；將此溫度下的酶活反應體系的吸 光值作為相對活性100%，其他溫度下酶活反應體系的吸光值與此最高酶活體系的吸光值 的比值作為相對活性。在30-45°C條件下均具有50%以上的活性。
[0091] 對照組：以對照菌BL21/pET28a獲得的蛋白（記作對照酶液)進行上述實驗，結果不 管在哪個溫度條件下，對照酶液都沒有降解支鏈淀粉的活性。
[0092]實驗設3次重復，結果一致。
[0093] (二)最適 pH
[0094] 如下各組中的稀釋酶液均是用各組中的緩沖液稀釋實施例1的步驟5中的Amy 112 純酶液得到的。
[0095] 實驗組：活性測定反應體系為0.5mL，分別由0.45mL溶液B (B1、B2、B3、B4、B5、B6、 B7、B8或B9)和0.05mL稀釋酶液組成；
[0096]溶液B1 的組成：50mM HAc-NaAc緩沖液和支鏈淀粉(Amylopetcin from maize)組 成;支鏈淀粉在溶液B1中的濃度為lg/100mL;溶液B1的pH值為5.0。
[0097] 溶液B2的組成:與溶液B1的組成相同，不同的是溶液B2的pH值為5.8。
[0098] 溶液B3的組成：與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM HAc-NaAc緩沖液替換為 50mM NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液。溶液B3的pH值為5·8。
[0099] 溶液B4的組成：與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM HAc-NaAc緩沖液替換為 50mM NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液。溶液Μ的pH值為6 · 2。
[0100] 溶液B5的組成：與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM HAc-NaAc緩沖液替換為 50mM NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液。溶液B5的pH值為6·6。
[0101] 溶液B6的組成：與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM HAc-NaAc緩沖液替換為 50mM NaH2P〇4-