a (ilu Ser Thr 435 Trp Phe Gly Val Asn Pro Asn Tyr Scr Asp He Asn Val Ala Lys 450 Gin Glu Gin Leu Glu Asp Ser lie Leu I]is Tyr Tyr Lys Lys Met 465 lie Ala Leu Arg Lys Ser Thr Asp Val Leu Met Tyr Gly Gin Tvr 480 Asp Leu Va! Phe Pro CtIu His Lys Glu Val 1'yr Ala lyr rhr Arg 495 Thr Leu Gly Glu Glu Lys Tyr Val lie Leu Va! Asn Met Phe Gly 510 Thr Glu Ala Glu Thr Asp Ltju Arg Ser Leu Asp Leu Ser Glu Asn 525 Ser Pro Leu Val Leu Ala Asn Tyr Thr A!a Asn Gly Ser Leu Asp 540 Ser Leu Arg Pro Tyr Glu Ala Arg Val Tyr Arg Leu Ala 553 <210>2 <211 >1662 <212>DNA <213〉嗜堿芽孢桿菌（fee///"s sA) <220> <223>外切-a -1，4-糖苷酶 <400>2 atggatagaa aatq.qtgqaa agaggcaata .gcttatcaag tqtatG-cacg aagctttatg' 60 gat:tGgaa.c.g gtgatgggat t'ggt.ga.tc::tg caaggggt.ga tccaaaagct tg.atta.catt 120 aaaggtctag gaattgatgt gatc：tggatc tgtccaatgt acagtteacc gaatgatg :at. 180 aaagggtatg atattagtga ttac：Gaagat attatggaag aottcgggaa tatggat.gat. 2 4Q tttgatcaac tgttaa.aaga agttcataat cgtgatatga aget.gatt.at tgatttagta 3Q0 atcaaecata cgtGtgatga gGatcctt.gg tttatcgaat cacgc:tea.t-Q cgtcgataat 360 ccaa.aacgtg attggtatat ttggcgtg.at eeaagtgeag acgcfaagtga gcctaataao 4 2Q tgggagtcaa tttttaacgg acccgcgtgg gaatttgatg agaagacaaa gcagtactac 480 atgeatattt totetacaaa· acagc.cagat ttaaattggg aaaaGggtga tgitegegcg 5 4 0. g：cgG.t:gtata acatgatgaa ttggtggatg gataaggg-aa t:t：gacggttt G：c.gcgttgat 60 0. getatttege atatcaagaa aatc-gacggg ctgccrgatc ttcotaaccc aaaaggactt 660 gattatgteo ettettrt-ga tgg-aeatatg aat-cgcccgg gQ-atccataa gttccttcaa 7 2 0' gaa^tgaaaa atgaaacggt agctaaatac gatgtgatga ccgttgggga agegaaeggt 7·B〇. gtaaagct:tg atca:ag:c：aqa .tgattgggta ggagaaqate gc.ggtgcatt taatatgatc· 840 ttc.ca.atttg agGatcragg tc.tt.t:gggga. aagga.a.aegg gcgglgagct ,c.g:atcttat：t 9 00 tcGttaea.a.g aa_aca_GtgaG_ taagtggGaa _a_aa*.g.ggtta.g aa.ggcGg.cgg gtggaatgea S60 ttattccttg aaaaccatga ccagccccgg agtgtatcga cttggggaaa tgataaagag 1C20 tattggtctg agagtgcaaa ggcgcttgga acgatgtttt tcttcatgca aggoacgcca 1080 tttgttt.atc aaggtcaaga gateggeatg a-cgaatgtac: aatttgatac gattgaagag 114 0. tatgatgatg tctcgat.gaa aa,a.cttctat eggattgaaa .cagctaaggg c.cgttctcat 1200· gaagagataa tggagattat ctgggageaa g.gccgegata attagagaac gcG.gatgcaa 12 60
[0134] tgggat'gact cgaaaaatgc tggtttctct acagccgagt caacttggtt tggcgtgaat 132 0. cctaattaca gtgacatcaa tgtagcaaag Gaggagcagc tagaggactc G:atttta:c;at .138 0 tacta.caaaa· agatgattgc acttcgGaaa tcaaeaga.cg ttttaatgta tggtcagtat .14.4 0 gatetagttt· tcGctg.agca ta.aagaagta tatgettata cgcggacact cggggaggag 1500 .aaatatgtga tGGttcjtgaa ca:tgtttggt. acagaggr.tg aaa；cggactt. arigaagcnta 1560. gacttatcacj aaaactctcc gctcgtactt gcgaattata c.agGaaaG：qq ttcg;c.tcgat. 162.0 tctcttcgtc cttatgaggc gagagtgtaG cgattageat- aa 1662 <210>3 <211>35 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 <221〉正向引物 <400>3 cgeggatcca tg^atagaaa 'a't'ggtggaaa. gaqgc 35 <210>4 <211>35 <212>DNA <213〉人X序列 <220> <221〉反向引物 <400>4 gcgtcgactt atgctaatog gtacactc't：e gcctc 3:5
【主權項】
1. 一種外切-α-1，4-糖苷酶，其特征在于，該蛋白質具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序 列；或該蛋白質具有在SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列基礎上缺失、置換、插入或添加一個 至幾個氨基酸的衍生序列并且該蛋白質具有外切淀粉酶活性。2. -種外切-α-1，4_糖苷酶的編碼基因，其特征在于，該基因編碼： (a)具有SEQ ID NO.1所不的氣基酸序列的蛋白質；或(b)具有衍生自缺失、置換、插入 或添加一個至幾個氨基酸的SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列并具有外切淀粉酶活性的蛋白 質。3. 根據權利要求2所述一種外切-α_1，4-糖苷酶的編碼基因，其特征在于，所述基因為 (i)、（ii)或（iii)的 DNA 分子： (i) 具有SEQ ID勵.2所示的核苷酸序列的0嫩分子； (ii) 在嚴格條件下與（i)所述的核苷酸序列雜交且編碼具有外切淀粉酶活性的所述蛋 白的DNA分子； (i i i)與（i)或（i i)所述的核苷酸序列具有90 %以上同源性的核苷酸序列的DNA分子。4. 根據權利要求3所述一種外切-α-1，4-糖苷酶的編碼基因，其特征在于，所述嚴格條 件為鈉濃度為50-30011^的溶液中，反應溫度為50-68°(：。5. -種重組載體，其特征在于，包括權利要求2至4任一項所述的外切-α-l，4-糖苷酶的 編碼基因。6. -種轉化體，其特征在于，包括權利要求5所述的重組載體。7. -種引物對，其特征在于，用于擴增權利要求2-4任一項所述的外切-α_1，4-糖苷酶 的編碼基因全長及其任意片段。8. -種權利要求1所述的外切-α-l，4-糖苷酶在水解α-l，4糖苷鍵中的應用。9. 一種利用權利要求1所述的外切-α-l，4-糖苷酶進行酶解的方法，其特征在于，包括 以下步驟:以可溶性淀粉、支鏈淀粉或Ρ-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷為底物，在中性pH條件， 利用外切-α-l，4_糖苷酶對可溶性淀粉、支鏈淀粉或p-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷進行酶 解。10. -種生產外切-a -1，4 -糖苷酶的方法，該方法包括培養權利要求6所述的轉化體并 由培養產物中收集外切-α-l，4_糖苷酶。
【專利摘要】本發明涉及一種外切-α-1,4-糖苷酶，該蛋白質具有SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列；或該蛋白質具有在SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列基礎上缺失、置換、插入或添加一個至幾個氨基酸的衍生序列并且該蛋白質具有外切淀粉酶活性。本發明所述的外切-α-1,4-糖苷酶具有高酶活、pH耐受性好等優點，可以廣泛應用于α-1,4-糖苷鍵的酶解，尤其對于支鏈淀粉的底物特異性比較好。
【IPC分類】C12N9/26, C12P19/20, C12N15/11, C12N15/56
【公開號】CN105647887
【申請號】
【發明人】張桂敏, 汪聲晨, 蔣思婧, 馬延和
【申請人】湖北大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月15日