Na2HP〇4緩沖液。溶液B6的pH值為7 · 0。
[0102] 溶液B7的組成：與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM HAc-NaAc緩沖液替換為 50mM NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液。溶液B7 的pH值為7 · 5。
[0103] 溶液B8的組成：與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液替 換為50mM Na2B4〇7_H3B03緩沖液。溶液B8的pH值為7.5。
[0104] 溶液B9的組成：與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液替 換為50mM Na2B4〇7_H3B03緩沖液。溶液B9的pH值為8.0。
[0105] 溶液B10的組成：與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液 替換為50mM Na2B4〇7_H3B03緩沖液。溶液B10的pH值為8.6。
[0106] 溶液B11的組成:與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM Na2B4〇7_H3B03緩沖液替換 為50mM glycine-NaOH緩沖液。溶液Bl 1的pH值為8.6。
[0107] 溶液B12的組成:與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM Na2B4〇7_H3B03緩沖液替換 為50mM glycine-NaOH緩沖液。溶液B12的pH值為9.0。
[0108] 溶液B13的組成:與溶液B1的組成相同，不同的是將50mM Na2B4〇7_H3B03緩沖液替換 為50mM glycine-NaOH緩沖液。溶液B13的pH值為9.4。
[0109] 將反應體系在40°C，溫育30min后，沸水浴5min終止反應，加入0.5mL二硝基水楊酸 溶液(DNS)，然后沸水浴5min，迅速冷卻后測定OD54〇。
[0110]實驗設三次重復。
[0111] 結果如圖3所示。
[0112] 外切-α-1，4-糖苷酶在pH為5.8至9.4之間的條件下均具有外切α-1，4-糖苷酶的活 性，即可以降解支鏈淀粉。
[0113]表明外切-α-1，4_糖苷酶在ρΗ7.0條件下具有最高酶活性，為1260mU/mg蛋白。以此 最高酶活性體系的吸光值作為相對活性100%，其它反應體系的吸光值與此最高酶活性體 系的吸光值的比值作為各自的相對活性。
[0114] 對照組：以對照菌BL21/pET28a獲得的蛋白（記作對照酶液)進行上述實驗，結果不 管在哪個pH條件下，對照酶液都沒有降解支鏈淀粉的活性。
[0115] 實驗設3次重復，結果一致。
[0116] (三)酶熱穩定性
[0117] 用pH7.0的50mM NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液稀釋實施例1的步驟5中的Amy 112純酶液， 用稀釋后的酶液以支鏈淀粉為底物進行酶活測定。將稀釋后的酶液記作稀釋酶液。
[0118] 將稀釋酶液分別在30°C、40°C、50°C、60°C水浴放置30分鐘，測定酶的殘余活性。結 果顯示，酶在30 °C至40 °C穩定，在50 °C處理30分鐘喪失一半活性，但在60 °C下完全喪失了活 性。本發明所述的外切-α-l，4_糖苷酶的酶解溫度為30-50°C，優選為35-45°C。
[0119](四）pH耐受性
[0120] 將稀釋酶液分別在pH 5、5.8、6.2、7.0、7.5、8.0、8·6條件下放置16h后，以支鏈淀 粉為底物測定殘余酶活。結果顯示pH 6.2-8.6條件下仍然具有60%以上的相對酶活。說明 該酶具有良好的pH耐受性。
[0121](五)底物特異性
[0122] 將稀釋酶液分別在相同濃度(質量分數為1%)的不同底物條件下進行酶活測定， 底物分別為支鏈淀粉、可溶性淀粉、直鏈淀粉、普魯蘭糖、纖維素及木聚糖。
[0123] 以支鏈淀粉為底物測得酶活為參比（100%)，以可溶性淀粉為底物所測相對酶活 為76.2 %，而對于直鏈淀粉、普魯蘭糖、纖維素及木聚糖都沒有酶活性。因此，對于天然底 物，該酶對支鏈淀粉酶活比較高。
[0124] 實施例3、以pNPG為底物驗證蛋白功能
[0125]酶活單位定義為lmin內催化產生Ιμ molρΝΡ所需的酶量。
[0126] 如下所述的稀釋酶液是用50mM NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液稀釋實施例1的步驟5中的 Amyl 12純酶液得到的。
[0127] 對照組：體系加入O-O.lmM不同終濃度的pNP(中文名稱為p-硝基苯-α-D-葡萄糖 苷)作為正對照，在40°C、pH7.0條件下加入ImM終止劑Na 2C03，分別測得不同濃度底物條件下 的產物的吸光度A420 ;
[0128] 實驗組：以5mM濃度pNPG為底物，在40°C，pH7.0條件下加入適量的稀釋酶液反應 lOmin，再加入ImM終止劑Na2C03，然后測定A42〇;
[0129] 實驗設三次重復，結果一致。
[0130] 結果顯示在40°C、pH7.0條件下，以5mM濃度pNPG為底物所測酶活為288.89mU/mg。
[0131]以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。 <110〉湖北大學 <120〉一種外切-α -1,4-糖苷酶與其編碼基因和應用 <160>4 <210>1 <211>553 <212>PRT <213〉嗜堿芽孢桿菌（fee/7/"s印） <220〉 <221 >外切-α -1，4-糖苷酶 <400〉1 Met Asp Arg Lys Trp Trp Lys Giu Ala lie Ala Tyr Gin Val Tyr 15 Pro Arg Ser Phe Met Asp Ser Asn Gly Asp Gly lie Gly Asp Leu 30 Gin Gly Val lie Gin Lys Leu Asp Tyr lie Lys Gly Leu Gly lie 45 Asp Val He Trp He Cys Pro Met Tyr Arg Ser Pro Asn Asp Asp 60
[0132] Asn Gly Tyr Asp He Ser Asp Tyr Gin Asp He Met Glu Asp Phe 75 Gly Asn Met Asp Asp Phe Asp Gin Leu Leu Lys Glu Val His Asn 9Q Arg Asp Mel Lys Leu He He Asp Leu \^al He Asn His Thr Ser 105 Asp Glu His Pro Trp Phe He Glu Ser Arg Ser Ser Val Asp Asn 120 Pro Lys Arg Asp Trp Tyr He Trp Arg Asp Pro Ser Ala Asp Gly 135 Ser Glu Pro Asn Asn Trp Glu Ser fie Phe Asn Giy Pro Ala Trp 150 Glu Phe Asp Glu Lys Thr Lys Gin Tyr Tyr Met His lie Phe Ser 165 Thr Lys Gin Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Gly Asp Val Arg Ala ] 80 Ala Leu Tyr Asn Met Met Asn Trp Trp Met Asp Lys Giy He Asp 195 Gly Phe Arg Val Asp Ala lie Ser His He Lys Lys lie Asp Gly 210 Leu Pro Asp Leu Pro Asn Pro Lys Gly Leu Asp Tyr Val Pro Ser 225 Phe Asp Gly His Met Asn Arg Pro Gly He His Lys Phe Leu Gin 240 Glu Met Lys Asn Glu Thr Val Ala Lys Tyr Asp Val Met Thr Vai 255 Gly Glu Aia Asn Gly Val Lys Leu Asp Gin Ala Asp Asp Trp Val 270 Gly Giu Asp Arg Gly Ala Phe Asn Met lie Phe Gin Phe Glu His 285 Leu Gly Leu Trp Giy Lys Glu Thr Giy Gly Glu Leu Asp Leu lie 300 Ser Leu Lys Glu Thr Leu Thr Lys Trp Gin Lys Gly Leu Glu Gly 315 Arg Gly Trp Asn Ala Leu Phe Leu Glu Asn His Asp Gin Pro Arg 330
[0133] Ser Val Ser Thr Trp Gly Asn Asp Lys Giu Tyr Trp Ser Glu Ser 345 Ala Lys Ala Leu Cily Thr iVlet Phe I)he Phe Met Gin Cily Thr Pro 360 Phe Va! Tyr Gin Cily Gin Glu lie Gly Mel Thr Asn Vai C31n Phe 375 Asp Thr lie Glu Glu Tyr Asp Asp Val Ser Met Lys Asn FMie Tyr 390 Arg lie Giu Thr Ala Lys GlyArg Ser His Glu Glu lie Met Glu 405 lie lie Trp Glu Gin Cily Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gin 420 Trp Asp Asp Ser Lys Asn Ala Gly Phe Ser Thr Al