>[0090] Na2HP04-Na0H緩沖液：配置50mM磷酸氫二鈉溶液，用氫氧化鈉分別調節至pH 10. 5 ~12. 0〇
[0091] 最適反應溫度和溫度穩定性,參見圖4。
[0092] 幾丁質酶最適溫度測定：將幾丁質酶用最適pH值緩沖液稀釋合適倍數后，于不同 溫度40~70°C下測定幾丁質酶酶活力。以最大酶活力為100%，分別計算各溫度下的相對 酶活力。溫度穩定性測定：將酶液用50mM的最適pH緩沖液稀釋合適倍數后，置于不同溫度 的水浴鍋中保溫30min，立即冰水浴冷卻30min，以標準方法測定殘余酶活力，以未經處理 的酶液酶活力作為對照。
[0093] 幾丁質酶PbChi70在ρΗ5· 5檸檬酸緩沖液中活性最高，以最高酶活力作為100%， 計算其它緩沖液及pH值下的相對酶活力，結果見圖3(A)。以未經處理的酶液酶活力作為 100%，計算丁質酶PbChi70在各不同緩沖液及pH值下處理30min后的相對酶活力，結果見 圖3 (B)。結果表明PbChi70在較寬的pH4. 0~9. 5范圍內穩定，殘余酶活力能保持在80% 以上。
[0094] 幾丁質酶PbChi70在55°C反應溫度下活性最高，以該酶活力作為100%，計算其它 溫度下的相對酶活力，結果見圖4(A)。將未經處理的酶液酶活力作為100%，計算幾丁質酶 PbChi70在不同溫度下處理30min后的相對酶活，結果見圖4(B)。結果表明PbChi70具有 良好的溫度穩定性，在55°C下保溫30min仍殘余79%酶活力。
[0095] 實施例4內切幾丁質酶的水解特性
[0096] 用50mM pH 5. 5的磷酸鹽緩沖液配置1 % (w/v)的膠體幾丁質和再生幾 丁質作為水解底物，加入幾丁質酶PbChi70 (lU/mL)，50°C水浴水解4h，定時取樣，采 用薄層層析（TLC，Kieselgel 60)法定性檢測水解產物。TLC分析時，展層液為：正 丁醇：水：乙酸=2:1:1;顯色方法參考 Kopparapu 等（Kopparapu et al. A novel thermostable chitinase (PJC)from pomegranate(Punica granatum)juice. Food Chemistry, 127:1569-1575)的方法。顯色溶液I的配置：5mL 50%濃度的氫氧化鉀與20mL 無水乙醇混勻，取此溶液0. 5mL與0. 5mL乙酰丙酮和正丁醇的混合溶液即：乙酰丙酮0. 5mL 和正丁醇10mL混合而成的混合溶液，氫氧化鉀和乙醇的混合溶液以及乙酰丙酮和正丁醇 的混合溶液都需現配現用。溶液II的配置：lg對甲氨基苯甲醛溶于30mL無水乙醇中，再加 30mL濃鹽酸。顯色時，先將溶液I均勻噴灑在TLC平板表面，105°C加熱5min，然后再將溶 液II均勻噴灑在TLC平板表面，最后90°C烘烤5min顯色。
[0097] 圖5結果表明，該酶水解膠體幾丁質和再生幾丁質的終產物（4h)以單糖和幾丁二 糖為主。而在初始階段0~30min，主要產生幾丁二糖、幾丁三糖和少量的幾丁四糖，隨后三 糖或四糖被繼續降解為單糖及二糖。
[0098] 圖6為幾丁質酶水解不同聚合度幾丁寡糖的產物分析圖。結果表明幾丁質酶 PbChi70能夠水解幾丁三糖、四糖和五糖，但不能水解幾丁二糖。水解特性表明本發明的幾 丁質酶屬于內切型幾丁質酶。
[0099] 實施例5幾丁質酶在制備幾丁二糖中的應用
[0100] 在500mL反應體系即50mM pH 5. 5檸檬酸緩沖液中，加入預先制備的終濃度3%膠 體幾丁質，及純化后的終濃度5U/mL幾丁質酶PbChi70, 50°C下150rpm震蕩水解24h。沸水 浴lOmin將酶滅活，冷卻后過濾收集濾液。采用實施例4中的TLC法及HPLC法分析測定水 解液中產物的組成及幾丁二糖的純度。
[0101] HPLC 測定條件為：HPLC-ELSD 檢測系統（Agilent 1260Series，Agilent Technologies，USA)，Sugar-D 層析柱 4· 61 X 250mm(cosmosil, Japan)，乙臆 / 水（75:25, v/ v)作為流動相，流速為lmL/min。
[0102] 進一步采用活性炭柱分離制備幾丁二糖，其中φ=2.6 cm，H = 50cm，用50%乙醇 溶液及去離子水分別平衡層析柱4h備用，其中流速為lmL/min。將糖液真空濃縮后上樣，并 用總體積1. 8L的0~40%乙醇溶液線性洗脫。洗脫液采用自動部分收集器收集，10mL/管。 DNS法測定收集樣品的還原糖含量，分別采用TLC法和HPLC法定性和定量分析收集的組分， 合并同一組分的收集液，50°C下真空旋轉蒸發濃縮，然后在糖液中加入適量乙醇結晶。
[0103] 圖7結果表明，水解液中的主要組分為幾丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖，其中幾丁 二糖的含量達到80. 4%，水解率達到89. 5%。采用活性炭色譜層析分離水解液制備幾丁 二糖，結果表明能夠將水解液中所產的幾丁二糖與N-乙酰氨基葡萄糖完全分開，回收率為 87 %。幾丁二糖糖液經過結晶后得到晶體，產率為61 %，幾丁二糖的純度達到99 %。
[0104] 所述水解率為PbChi70產生的還原糖質量除以初始底物質量的百分比。
[0105] 所述回收率為幾丁二糖經純化后的質量除以PbChi70水解產生二糖質量的百分 比。
[0106] 所述產率為幾丁二糖晶體質量除以初始底物質量的百分比。
[0107] 以上所述僅為本發明的較佳可行實施例，并非因此局限本發明的專利范圍，故凡 是運用本發明說明書及附圖內容所作的等效變化，均包含于本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種內切幾丁質酶，是如下1)~3)中的一種蛋白質： 1) 由序列表中序列2的第40~696所示的氨基酸序列組成的蛋白質； 2) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； 3) 將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有幾丁質酶活性的由1)衍生的蛋白質。2. 權利要求1所述內切幾丁質酶的編碼基因。3. 如權利要求2所述的編碼基因，其特征在于：編碼基因為如下1)~4)中任一基因： 1) 其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第118~2091位； 2) 其編碼序列是序列表中序列1 ; 3) 在嚴格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼如權利要求1所述蛋白質的基因； 4) 與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼如權利要求1所述蛋白質的基因。4. 擴增如權利要求2或3所述基因全長或其任一片段的引物對。5. 含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。6. 如權利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是在pET28a⑴的 BamH I和Xho I酶切位點間插入所述基因得到的重組表達載體。7. 如權利要求5所述的重組菌，其特征在于，將所述的重組載體導入大腸桿菌得到的 重組大腸桿菌。8. -種表達內切幾丁質酶的方法，是發酵培養如權利要求5或7所述重組菌，得到內切 幾丁質酶。9. 如權利要求8所述的方法，發酵培養條件是：培養溫度是37°C至0D_達到0. 6~ 0. 8,加入終濃度ImM異丙基硫代-β -D-半乳糖苷（IPTG)，30°C培養過夜。10. 權利要求1所述內切幾丁質酶在水解幾丁質中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種內切幾丁質酶及其編碼基因和在生產幾丁二糖中的應用。蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列2自N末端40至696位氨基酸殘基組成的蛋白質；(b)有序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質酶活性的由序列1衍生的蛋白質。利用本發明提供的幾丁質酶制備幾丁二糖，轉化率高，能源消耗少，無污染物產生，具有重要的經濟價值。本發明蛋白在工業應用中具有較大潛力。CGMCC 953020140820
【IPC分類】C12R1/01, C12N9/42, C12N15/70, C12N15/56, C12P19/14, C12N1/21, C12P19/26
【公開號】CN105647888
【申請號】
【發明人】閆巧娟, 付星, 楊紹青, 江正強, 郭禹, 楊鑫斌
【申請人】中國農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月14日