學誘變、基因工程等手段將序列表中序 列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，仍具有 幾丁質酶活性的蛋白質。
[0014] 為了使1)中的PbChi70便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成 的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0015] 表1標簽的序列
[0016]
[0017] 上述2)中的PbChi70可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到〇 上述2)中的PbChi70的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'末端第1-2091位堿基所 示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯 義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0018] 上述2)的蛋白質具體可以是在所述1)的蛋白質的C-端帶上6個His標簽的蛋 白質。
[0019] 所述內切幾丁質酶PbChi70蛋白質的編碼基因，也屬于本發明的保護范圍。
[0020] 所述內切幾丁質酶PbChi70的編碼基因，具體為如下1)~4)中任一所述的基因：
[0021] 1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第1~2091位；
[0022] 2)其核苷酸序列是序列表中的序列1的自5'末端第1~1014位；
[0023] 3)在嚴格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼如所述蛋白質的基因；
[0024] 4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼如所述蛋白質的基因。
[0025] 序列表中的序列1由2091個堿基組成，其開放閱讀框架（0RF)為自5'末端第 1-2091位堿基，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的PbChi70蛋白質。
[0026] 所述嚴格條件可為用0. 1 X SSPE或0. 1 X SSC，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交并洗膜。
[0027] 擴增所述內切幾丁質酶PbChi70基因全長或其任一片段的引物對，也屬于本發明 的保護范圍。
[0028] 含有所述PbChi70基因的重組載體、轉基因細胞系和重組菌，也屬于本發明的保 護范圍。
[0029] 所述重組載體具體可為在pET28a(+)的BamH I和Xho I酶切位點間插入所述內 切幾丁質酶PbChi70基因得到的重組表達載體。
[0030] 所述重組菌是將所述的重組載體導入大腸桿菌得到的重組大腸桿菌。
[0031] 本發明所提供表達所述內切幾丁質酶PbChi70蛋白的方法，是將上述所得的重組 菌發酵培養，得到蛋白。
[0032] 所述發酵培養的條件是：培養溫度是37°C，培養至0D_達到0. 6~0. 8,加入終濃 度ImM異丙基硫代-β -D-半乳糖苷（IPTG)，30°C培養過夜。
[0033] 上述方法還包括將所述內切幾丁質酶進行純化的步驟，所述純化包括以下步驟：
[0034] 1)將所述重組菌破壁；
[0035] 2)取上清液用Ni-IDA或Ni-NTA親和層析進行純化。
[0036] 3)檢測各個純化步驟中收集樣品的蛋白濃度及酶的純度。
[0037] 用本發明提供的幾丁質酶可以水解膠體幾丁質，所述蛋白質在水解幾丁質生產幾 丁二糖中的應用，也屬于本發明的保護范圍之內。
[0038] 本發明從巴倫葛茲類芽孢桿菌（Paenibacillus barengoltzii)中擴增得到幾 丁質酶編碼基因，并轉入大腸桿菌中，實驗結果表明，本發明的幾丁質酶最適反應溫度為 55°〇，在溫度低于551：條件下處理3〇 1^11，殘余酶活力達90%以上，表現出較好的熱穩定 性；其最適pH為5. 5 ;用本發明提供的幾丁質酶可以水解膠體幾丁質，水解產物主要為幾丁 二糖及少量單糖。幾丁二糖采用活性炭色譜層析分離經結晶后得到晶體，產率可達61 %，純 度達到99%。水解反應條件溫和，對環境友好。
[0039] 利用本發明提供的幾丁質酶制備幾丁二糖，轉化率高，能源消耗少，無污染物產 生，具有重要的經濟價值。此外，本
【發明內容】
對促進海洋資源的利用及酶制劑工業的發展也 具有重要意義。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發明的幾丁質酶基因 PbChi70保守區（A)和基因全長（B)PCR擴增產物 瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0041] 圖2為經各步驟純化后幾丁質酶PbChi70的SDS-PAGE電泳圖，泳道Μ為低分子量 標準蛋白；泳道1為破壁后的粗酶液；泳道2為純化后的幾丁質酶。
[0042] 圖3為純化后幾丁質酶的最適pH(Α)及pH穩定性（Β)，圖中：（?)檸檬酸鹽緩沖 液，（·）乙酸鈉緩沖液，（□ )MES緩沖液，（▲)磷酸鹽緩沖液，（Λ )Tris鹽酸緩沖液， (〇）Glycine-NaOH 緩沖液，（? )Na2HP04-Na0H 緩沖液。
[0043] 圖4為純化后幾丁質酶的最適溫度（A)及溫度穩定性（B)。
[0044] 圖5為幾丁質酶水解膠體幾丁質產物的TLC分析圖。Μ :幾丁寡糖標準品；其它水 解時間圖上已列出。
[0045] 圖6為幾丁質酶水解幾丁寡糖產物的TLC圖。Μ :幾丁寡糖標準品；其它水解時間 圖上已列出。
[0046] 圖7為幾丁質酶水解膠體幾丁質制備幾丁二糖的水解歷程圖。圖中：（? )Ν_乙 酰氨基葡萄糖，（)幾丁二糖，（▲)幾丁三糖。
【具體實施方式】
[0047] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。
[0048] 下述實施例的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0049] 下述實施例中所用材料如試劑、克隆表達載體、菌株以及發酵用原材料均可從商 業途徑獲得。
[0050] 下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得 到的。
[0051] 以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0052] 本發明所依賴的遺傳資源是巴倫葛茲類芽孢桿菌（Paenibacillus barengoltzii)CAU904,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京 市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月20日，保藏號為CGMCCNo. 9530,分類 命名：巴倫葛茲類芽孢桿菌，原始來源是2011年10月采自南海的海水水樣，直接來源與原 始來源相同。
[0053] 實施例1幾丁質酶基因的發現
[0054] -、幾丁質酶基因組保守區片段PCR擴增簡并引物設計
[0055] 以巴倫葛茲類芽抱桿菌（Paenibacillus barengoltzii) CAU904為基因組模板， 根據GenBank數據庫中報道的幾丁質酶氨基酸序列，利用在線軟件Block Maker (http:// blocks, fhcrc. org/blocks/blockmkr/make_blocks. html)搜索保守區。根據幾丁質酶的保 守氨基酸序列，利用在線設計軟件 C0DH0P(http://blocks, fhcrc. org/codehop. html),選 取GenBank中已報道的類芽孢桿菌屬GH 18家族幾丁質酶氨基酸序列進行同源比對，選擇 序列保守區THINYAFA和DLDWEYPV設計表2中的簡并引物Chi2DF和Chi2DR。
[0056] PCR反應條件：94°C預變性5min ;以94°C變性30s、62~52°C退火30s、72°C延伸 40s為一個循環進行20個循環；以94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸40s為一個循環 進行15個循環；72°C總延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳回收，用TA克隆試劑 盒連入PMD18-T載體中，轉化E. coli DH5a，菌落PCR挑取陽性克隆測序，測序結果NCBI中 進行BLAST比對。以基因組DNA為模板擴增到一段412bp左右的片段，參見圖1，測序結果 在NCBI中進行Blastx比對。
[0057] 表2幾丁質酶PbChi70基因克隆引物表
[0058]
[0059] 表2中：下劃線標注為限制性酶切位點；Y = C/T，N = A/G/C/T，R = A/G
[0060] 二、幾丁質酶基因全長PCR擴增
[0061] 比對結果顯示，步驟一獲得的保守片段的氨基酸序列，據