此序列，設計幾丁質酶基 因上下游引物Chi2F和Chi2R，擴增到一段2, 091bp片段，如序列表1所示。測序結果顯示 擴增到幾丁質酶PbChi70基因全長。幾丁質酶PbChi70的核苷酸序列編碼了 696個氨基酸 和一個終止密碼子。SignalP 4.0預測到該蛋白N端含有一段39個氨基酸殘基的信號肽。 預測成熟蛋白分子量和等電點分別是70kDa和5. 65。NCBI中BLAST比對分析顯示，在已 報道的有關性質研究的幾丁質酶中，與來源于Bacillus circulans(P20533. 1)的18家族 幾丁質酶相似性最高為 72% ;與來源于 Paenibacillus sp.FPU-7(BAM67142. l)、Bacillus pumilus(ABIl5〇82· 1)和 Bacillus sp.DAU101(ABC66〇95· 1)的 I8 家族幾丁質酶相似性分 別為67%、61 %和61 %。結構域分析顯示，幾丁質酶PbChi2含有一個18家族特征結構域、 一個3型纖連蛋白結構域和一個幾丁質結合相關的ChiAl-BD結構域。
[0062] 實施例2內切幾丁質酶基因的表達
[0063] 一、構建重組表達載體
[0064] 以巴倫葛茲類芽孢桿菌基因組DNA為模板，利用基因上下游引物Chi2EF和Chi2ER 擴增去除信號肽的幾丁質酶PbChi70基因，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。回 收PCR擴增產物，連接pMD18-T載體，熱激法轉化大腸桿菌DH5 α，將陽性重組質粒命名為 pMD18-T-PbChi70,送往測序。雙酶切質粒pMD18-T-PbChi70,回收目的基因片段，與經同樣 雙酶切的表達載體pET_28a(+)相連，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，提取質粒酶切鑒定陽 性重組子，將構建正確的重組質粒命名為pET28a-PbChi70。
[0065] 二、構建重組菌
[0066] 將上步驟獲得的重組質粒PET28a-PbChi70通過熱激法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)， 得到含有重組質粒pET28a-PbChi70的重組菌，將其命名為重組菌BL-pET28a-PbChi70。將 pET-28a(+)載體通過熱激法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到含有pET-28a(+)載體的重組 菌，將其命名為對照組。
[0067] 實施例3內切幾丁質酶的純化及性質測定
[0068] 一、幾丁質酶的純化
[0069] 挑取陽性克隆子于50mL LB液體培養基中（50 μ g/mL)，37°C搖床培養至對數期， 用作種子液。接種種子液于l〇〇mL LB液體培養基中，可用500mL三角瓶，含卡那霉素50 μ g/ mL，37°C搖床培養至0D600達到0. 6~0. 8時添加終濃度為ImM的IPTG，30°C搖床培養誘導 過夜。
[0070] 培養結束后10, 000rpm、2min離心收集菌液，菌液用20mLpH 7. 4磷酸鹽緩沖液懸 浮，200W、超3s、間歇4s、超90次超聲破碎細胞。細胞破碎后，10, OOOrpm，lOmin離心收集上 清即粗酶液。用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，保存，用作電泳分析蛋白表達情況。引物設計時保 留pET-28a(+)質粒N端的組氨酸標簽，利用Ni-IDA(鎳離子螯合親和層析）柱純化蛋白。 純化方法：用20mL磷酸鹽緩沖液、pH 7. 4平衡緩沖液平衡Ni-IDA柱5-10個柱體積；將粗 酶液以〇. 5mL/min流速上樣；用緩沖液A即：50mM磷酸鹽緩沖液、0. 5M NaCl、20mM咪唑、pH 7. 4,流速lmL/min洗滌柱子，至流穿液0D280小于0. 05 ;用緩沖液B即：50mM磷酸鹽緩沖 液，0. 5M NaCl，80mM咪唑；pH 7. 4,洗滌柱子至流穿液0D280小于0. 05 ;用緩沖液C(50mM 磷酸鹽緩沖液，〇. 5M NaCl，120mM咪唑；pH 7.4)洗脫蛋白并用離心管收集，SDS-PAGE檢測 蛋白純度(Laemmli et al. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970,227:680_685)〇
[0071] 二、幾丁質酶的分子量及活力測定
[0072] 蛋白分子量測定：（1)采用SDS-PAGE法測定，分離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃 度為4. 5%。低分子量標準蛋白為：磷酸化酶b(97. 2kDa)，白蛋白（66.4kDa)，卵清蛋白 (44. 3kDa)，碳酸酐酶（29kDa)，胰蛋白酶制劑（20. lkDa)和溶菌酶（14. 3kDa)。
[0073] 幾丁質酶酶活力的測定：取200 μ L處理好的膠體幾丁質（1 %，w/v)于1. 5mL離心 管中，50°C水浴鍋預熱lOmin后加入200 μ L適當稀釋的酶液反應30min。反應釋放出的還原 糖量參照 Miller 等的方法測定（Miller et al. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 1959, 31:426-428.), 即在反應液中加入600iiL DNS試劑終止反應，然后沸水中顯色lOmin。顯色完成后， 10,000rpm離心10min，檢測540nm處吸光值。幾丁質酶酶活力單位（1U)定義為在上述反 應條件下每分鐘反應生成1 U mol還原糖所需要的酶量。
[0074] 蛋白含量測定：參照 Lowry 等的方法（Lowry et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 1951，193:265-275)以牛 血清蛋白作為標準蛋白。
[0075] 實驗設3次重復，結果取平均值。
[0076] PbChi70的純化情況見表3。分別將粗酶液和純酶液作為待測酶液，并以對應滅活 的蛋白作為對照組，檢測幾丁質酶活性。粗酶液的總酶活力為642. 7U，其比活力為12. 9U/ mg。純酶液的總酶活力為333. 8U，其比活力為30. lU/mg。
[0077] 表3幾丁質酶的純化表
[0078]
[0079] 幾丁質酶酶活力在55°C，pH 5. 5的檸檬酸緩沖液中按標準方法測定。
[0080] 如圖2所示，重組幾丁質酶經過Ni-IDA -步純化后得到純酶，酶活力回收率見表 3 為 51. 9%〇
[0081] 三、幾丁質酶的酶學性質
[0082] 最適pH和pH穩定性，參見圖3。
[0083] 最適pH :將幾丁質酶加入不同pH值的6種不同緩沖液體系中，包括檸檬酸鹽緩沖 液pH 3. 0~6. 0,乙酸鈉緩沖液pH 4 0~5. 5, MES緩沖液pH 5. 5~6. 5,磷酸鹽緩沖液 pH 6. 0 ~8. 0, Tris 鹽酸緩沖液 pH 7. 0 ~9. 0, Glycine-NaOH 緩沖液 pH 9. 0 ~10. 5 和 Na2HP04-Na0H緩沖液pH 10. 5~12. 0。在55°C條件下測定酶活力，以酶活力最高點為100% 作圖。pH穩定性：分別用上述不同pH值的反應體系稀釋純酶液，將稀釋后的酶液置于40°C 水浴鍋中保溫30min，迅速將樣品置于冰水浴中冷卻30min，按照標準方法測定酶活力，以 未經處理的酶液作為對照，分別計算各pH處理后的殘余活力。
[0084] 檸檬酸鹽緩沖液：分別配置50mM檸檬酸和檸檬酸鈉溶液，將兩者按照不同比例混 合分別調節至pH 3.0~6.0。
[0085] 乙酸鈉緩沖液：配置50mM乙酸鈉溶液，用乙酸分別調節至pH 4. 0~5. 5。
[0086] MES緩沖液：配置50mM MES溶液，用氫氧化鈉分別調節至pH 5. 5~6. 5。
[0087] 磷酸鹽緩沖液：分別配置50mM磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液，將兩者按照不同比 例混合分別調節至pH 6. 0~8. 0。
[0088] Tris鹽酸緩沖液：配置50mM Tris溶液，用鹽酸分別調節至pH 7. 0~9. 0。
[0089] Glycine-NaOH緩沖液：配置50mMGlycine溶液，用氫氧化鈉分別調節至pH 9. 0~ 10. 5〇