.5M鹽酸，1.5M醋酸鈉，0.025M Tris-HCl緩沖液，0. lmg/mL RNA酶；
[0090]除雜磁珠通過實施例1的方法制備而成；
[0091 ]提取磁珠懸浮液:提取磁珠懸浮液包括50mg/mL娃羥基磁珠和第二分散液，第二分 散液組分如下:0.25M氯化鈉，pH=5.2;
[0092] 細菌裂解液：1M的氫氧化鈉，0.25 %十二烷基硫酸鈉（SDS)，0.015M乙二胺四乙酸 (EDTA)；
[0093] 結合緩沖液:0.02M尿素，0.08M醋酸鈉，0.25 %的β-巰基乙醇，6M的鹽酸胍；
[0094] 清洗液:60%異丙醇，1Μ鹽酸胍；
[0095] 洗脫液：0.01M Tris-HCl緩沖液，0.001M EDTA;
[0096] 試劑盒提取方法其包括如下步驟：
[0097]步驟1)菌液準備：取常規法培養過夜的細菌培養液1.5mL，轉移到48孔板中，并做 好記錄；
[0098] 步驟2)菌體裂解：向上述加入菌液的孔板中加入0.165mL細菌裂解液，將上述孔板 在500rpm下禍旋混合3min;
[0099] 步驟3)質粒復性：向上述孔板中的菌液中加入0.25mL的除雜磁珠懸浮液，蓋嚴孔 板硅膠片，上下輕柔翻轉3~5次，使除雜磁珠懸浮液均勾分散于菌液中，將孔板于500rpm下 禍旋2min;
[0100] 步驟4)去除菌體基因組和蛋白：漩渦結束后，磁性分離棄去黑色沉淀，保留澄清透 明菌液。
[0101] 步驟5)質粒DNA結合:將菌液中加入1.2mL結合緩沖液以及0.055mL的提取磁珠懸 浮液，嚴蓋硅膠片，然后將孔板于1200rpm下漩渦混合5min，用磁板架至于孔板底部，磁性分 離，去除上清液。
[0102] 步驟6)清洗:每個孔位中加入0.7mL清洗緩沖液，將孔板于1 OOOrpm下漩渦50s，磁 性分離，去除上清液。在每個孔位中加入0.8mL 80%乙醇水溶液，將孔板于lOOOrpm下漩渦 45s，磁性分離，去除上清液，用80 %乙醇水溶液重復清洗一次。
[0103] 步驟7)除醇和洗脫:將上述含有磁珠的孔板放入40 °C的真空干燥箱干燥8min，除 去乙醇，在每個孔位中加入0.08mL的洗脫液，SOOrpm下漩渦lmin，磁性分離去除磁珠，孔板 洗脫液中即含有目標質粒DNA，將此含有質粒DNA的洗脫液轉移至PCR板中，-20°C下保存備 用。
[0104] 表一~表四分別為實施例2-5的提取效果：
[0105]表一:實施例2的提取效果
[0106]
[0107] 表二:實施例3的提取效果
[0108]
[0109]表三:實施例4的提取效果
[0110]
[0111] 表四：實施例5的提取效果 1
[0113]
[0114] 從表一-表四中觀察得到，實施例2-5中260/230> 1.8，且大部分在2.0附近，說明 提取DNA中基本無碳水化合物(糖類）、鹽類或有機溶劑的干擾和污染，純度較高;260/280> 1.77，且大部分都在1.8附近，說明提取DNA中基本無 RNA和蛋白質的污染，純度較高。260/ 230和260/280代表的是在紫外下的吸收峰，260nm處表示核酸吸收峰，230nm代表鹽、糖類吸 收峰，280nm代表蛋白質的吸收峰。
[0115] 盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地 實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限 于特定的細節和這里示出與描述的圖例。
【主權項】
1. 一種基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，包括有分別獨立分裝 的除雜磁珠懸浮液、提取磁珠懸浮液、細菌裂解液、結合緩沖液、清洗液和洗脫液； 其中，所述除雜磁珠懸浮液中分散有除雜磁珠，所述除雜磁珠表面至少修飾有苯乙烯、 二乙烯基苯和亞氨基二乙酸； 所述提取磁珠懸浮液中分散有提取磁珠，所述提取磁珠表面修飾有硅羥基。2. 如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述 除雜磁珠懸浮液包括有3_6mg/mL的除雜磁珠和第一分散液，所述第一分散液包括有1 -3M的 無機酸、2-4M的金屬鹽、0.02-0.05M的Tris-HCl緩沖液和0.1-0.2mg/mL的RNA酶;所述無機 酸選自硫酸、鹽酸、硝酸或其組合;所述金屬鹽選自碳酸鉀、醋酸鉀、碳酸鈉、醋酸鈉或其組 合。3. 如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述 提取磁珠懸浮液包括有40-60mg/mL的提取磁珠和第二分散液，所述第二分散液包括有0. ΙΟ. 5M 的氯化鈉; 且所述第二分散液的 pH為 5.0-7. 4。4. 如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述 細菌裂解液包括0.2-1.5M的氫氧化鉀、0.15-0.5wt %的十二烷基硫酸鈉和0.01-0.025M的 乙二胺四乙酸。5. 如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述 結合緩沖液包括〇. 01-0.03M的尿素、0.08-0.15M的醋酸鈉、0.2-lwt %的β-巰基乙醇、4-6.5Μ的第一變性劑，所述第一變性劑選自鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鉀、碘化鈉或其組合。6. 如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述 清洗液包括38-72wt %的異丙醇，0.8-1.6Μ的第二變性劑，所述第二變性劑選自鹽酸胍、異 硫氰酸胍、碘化鉀或其組合。7. 如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述 洗脫液包括0.005-0.02M的Tris-HCl緩沖液和0.001-0.005M的乙二胺四乙酸。8. 如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述 除雜磁珠的制備方法如下： S1:將1-5份的包裹Si02的四氧化三鐵納米磁球加入到含800份乙醇和200份水的混合體 系中，加入0.1-1份三乙胺，在惰性氣體保護下，升溫至40-80°C，隨后加入0.5-5份硅烷偶聯 劑KH570，攪拌反應4-6小時，經清洗干燥后，得到修飾有KH570的磁珠； S2:取1-5份修飾有KH570的磁珠加入到1000份DMSO溶液中，加入0.5-1份的苯乙烯、 0.2-1份的二乙烯基苯、1-2份的丙烯醇和0.05份的偶氮二異丁腈，升溫至60-85Γ，惰性氣 體保護下，攪拌反應4-6小時，加入0.5-1.5份的甲基丙烯酸縮水甘油酯，繼續攪拌反應12-16小時，經洗滌干燥后，得到改性磁珠。 S3:取1-5份所述改性磁珠分散到1000份的含有0.2M的碳酸鈉水溶液中，加入1-3份的 亞氨基二乙酸，反應2-4小時，經洗滌干燥后，即得到除雜磁珠。9. 如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述 提取磁珠的粒徑為100-2000nm〇10. -種如權利要求1-9中任一項所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒的 使用方法，其特征在于，包括： 步驟1)菌液準備:取細菌培養液1.0-2.0份，轉移到孔板中，并記錄； 步驟2)菌體裂解:向孔板中加入0.1 -0.2份的細菌裂解液，混勻； 步驟3)質粒復性:向孔板中加入0.2-0.4份的除雜磁珠懸浮液，混勻； 步驟4)去除菌體基因組和蛋白：磁性分離棄去除雜磁珠及其吸附物，保留孔板中澄清 透明的菌液； 步驟5)質粒DNA結合：向菌液中加入0.5-1.5份的結合緩沖液以及0.03-0.08份的提取 磁珠懸浮液，混勻，磁性分離，去除上層清液； 步驟6)清洗:向孔板中加入0.4-0.8份清洗液，混勻，磁性分離，去除上層清液； 步驟7)除醇和洗脫:將上述含有提取磁珠的孔板放入40 °C的真空干燥箱干燥5-10min， 隨后加入0.04-0.1份的洗脫液，混勻，磁性分離去除磁珠，在孔板的洗脫液中即含有目標質 粒 DNA。
【專利摘要】本案涉及基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，包括有分別獨立分裝的除雜磁珠懸浮液、提取磁珠懸浮液、細菌裂解液、結合緩沖液、清洗液和洗脫液；其中，所述除雜磁珠懸浮液中分散有除雜磁珠，所述除雜磁珠表面至少修飾有苯乙烯、二乙烯基苯和亞氨基二乙酸；所述提取磁珠懸浮液中分散有提取磁珠，所述提取磁珠表面修飾有硅羥基。本案通過開發一種除雜磁珠在菌體裂解之后，將細胞壁、蛋白等雜質去除而保留上清液中的質粒DNA，從而替代了傳統過程中的離心步驟，更為高效快捷；該試劑盒使用時可以預先將緩沖液、磁珠懸浮液等分裝于相應的核酸提取儀器中的孔板中，滿足自動化、高通量的需求；提取的質粒DNA純度高、片段完整。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105647910
【申請號】
【發明人】吳巧, 張佳斌, 曲峰, 尚春慶
【申請人】蘇州英芮誠生化科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月5日