dB的突變gadB(H465A)、gadB(dHT)(截斷C 端末尾兩個氨基酸）、gadB(H465A&E89Q)、gadB(dHT&E89Q);所利用的gadC為gadC突變 gadC470 (C端截斷，保留1-470位氨基酸的突變）。在一些具體實施方案中，ybaS-gadB-gadC 三基因抗酸表達盒包含兩部分：第一部分為與ybaS可操縱連接的ybaS天然啟動子、ybaS 和rrnBT終止子；第二部分為包含gadB和gadC的一個操縱子上，其啟動子為gadB天然啟 動子，終止子為rrnBT。在一些具體的實施方式中，本發明的ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表 達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO :55-59任一所示。
[0058] 在另一些實施方式中，本發明提供組合了 evgA調控基因和ybaS、gadB、gadC三種 結構基因的四基因抗酸表達盒。在一些具體實施方案中，所利用的evgA為野生型evgA; 所利用的ybaS為野生型ybaS ;所利用的gadB選自野生型gadB、突變體gadB (H465A)、 gadB(dHT)、gadB(H465A&E89Q)、gadB(dHT&E89Q);所利用的 gadC 為 gadC 突變 gadC470。 在一些具體實施方案中，四基因抗酸表達盒包含三部分：第一部分為與ybaS可操縱連接的 ybaS天然啟動子、ybaS和rrnBT終止子；第二部分為包含gadB和gadC的操縱子，其啟動子 為gadB天然啟動子，終止子為rrnBT ;第三部分為與evgA可操縱連接的選自evgA的天然啟 動子 pNat、人工啟動子 pQ、pZ、pV、pW、pN、pS、pAA、pJJ、pII、pOO 的啟動子，evgA 和 rrnBT 終 止子。在一些具體的實施方式中，本發明的四基因抗酸表達盒的核苷酸序列如SEQ ID N0: 62-66任一所不。
[0059] 本發明在另一方面提供了一種表達構建體，其包含本發明的表達盒。本發明的表 達構建體可以基于任意合適的載體。用于本發明的表達構建體的載體包括那些在宿主細胞 中自主復制的載體，如質粒載體；還包括能夠整合到宿主細胞DNA中并和宿主細胞DNA-起 復制的載體。可商購獲得許多適于本發明的載體。在一具體實施方案中，本發明的表達構 建體基于商業質粒 PACYC184 (NEB)構建。
[0060] 本發明在另一方面還提供了重組宿主細胞，其包含本發明的表達盒或本發明的表 達構建體。本領域已知通過密碼子優化等手段，來自一種生物體的基因也能在其他生物體 中起作用。因此，本發明的表達盒并不限于在大腸桿菌中使用。本發明重組宿主細胞優選 是原核生物細胞，更優選細菌細胞，最優選大腸桿菌細胞例如MG1655菌株。本領域熟知各 種將表達盒或表達構建體導入宿主細胞的方法，例如〇 &(：12法、電轉法等。如實施例5和6 所例證的，包含本發明的表達盒的重組宿主細胞，與相應的不含所述表達盒或表達構建體 的對照細胞相比，其抗酸性被提高。如本文所用，"抗酸性"包括在酸沖擊下的存活率和在酸 壓力條件下的生長率。
[0061] 本發明在另一方面提供了通過微生物發酵生產有機酸的方法，所述方法包括：
[0062] (a)將本發明的表達盒或表達構建體導入產有機酸微生物；
[0063] (b)對所述微生物進行發酵；和
[0064] (c)收獲所產生的有機酸。
[0065] 本發明的通過微生物發酵生產有機酸的方法中使用的產有機酸微生物優選原核 微生物，更優選細菌，最優選大腸桿菌。可以通過本發明的方法產生的有機酸包括氨基酸 (例如賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、谷氨酸）、丁二酸、檸檬酸和乳酸。
[0066] 在一【具體實施方式】中，本發明提供了通過微生物發酵生產賴氨酸的方法，所述方 法包括：
[0067] (a)將 SEQ ID NO :26-36、SEQ ID NO :55-59 和 SEQ ID NO :62-66 中任一所示的表 達盒或包含所述表達盒的表達構建體導入產賴氨酸微生物；
[0068] (b)對所述微生物進行發酵；和
[0069] (c)收獲所產生的賴氨酸。
[0070] 優選地，所述表達盒選自SEQ ID N0 :34、35、58、59、62。優選地，所述產賴氨酸微 生物是產賴氨酸大腸桿菌。更優選地，所述產賴氨酸微生物是大腸桿菌SCEcL3(pSLLl)菌 株。
[0071] 在一【具體實施方式】中，本發明提供了通過微生物發酵生產蘇氨酸的方法，所述方 法包括：
[0072] (a)將 SEQ ID NO :26-36、SEQ ID NO :55-59 和 SEQ ID NO :62-66 中任一所示的表 達盒或包含所述表達盒的表達構建體導入產蘇氨酸微生物；
[0073] (b)對所述微生物進行發酵；和
[0074] (c)收獲所產生的蘇氨酸。
[0075] 在一【具體實施方式】中，本發明提供了通過微生物發酵生產色氨酸的方法，所述方 法包括：
[0076] (a)將 SEQ ID NO :26-36、SEQ ID NO :55-59 和 SEQ ID NO :62-66 中任一所示的表 達盒或包含所述表達盒的表達構建體導入產色氨酸微生物；
[0077] (b)對所述微生物進行發酵；和
[0078] (c)收獲所產生的色氨酸。
[0079] 在一【具體實施方式】中，本發明提供了通過微生物發酵生產谷氨酸的方法，所述方 法包括：
[0080] (a)將 SEQ ID NO :26-36、SEQ ID NO :55-59 和 SEQ ID NO :62-66 中任一所示的表 達盒或包含所述表達盒的表達構建體導入產谷氨酸微生物；
[0081] (b)對所述微生物進行發酵；和
[0082] (c)收獲所產生的谷氨酸。
[0083] 在一【具體實施方式】中，本發明提供了通過微生物發酵生產丁二酸的方法，所述方 法包括：
[0084] (a)將 SEQ ID NO :26-36、SEQ ID NO :55-59 和 SEQ ID NO :62-66 中任一所示的表 達盒或包含所述表達盒的表達構建體導入產丁二酸微生物；
[0085] (b)對所述微生物進行發酵；和
[0086] (c)收獲所產生的丁二酸。
[0087] 在一【具體實施方式】中，本發明提供了通過微生物發酵生產檸檬酸的方法，所述方 法包括：
[0088] (a)將 SEQ ID NO :26-36、SEQ ID NO :55-59 和 SEQ ID NO :62-66 中任一所示的表 達盒或包含所述表達盒的表達構建體導入產檸檬酸微生物；
[0089] (b)對所述微生物進行發酵；和
[0090] (C)收獲所產生的梓檬酸。
[0091] 在一【具體實施方式】中，本發明提供了通過微生物發酵生產乳酸的方法，所述方法 包括：
[0092] (a)將 SEQ ID NO :26-36、SEQ ID NO :55-59 和 SEQ ID NO :62-66 中任一所示的表 達盒或包含所述表達盒的表達構建體導入產乳酸微生物；
[0093] (b)對所述微生物進行發酵；和
[0094] (c)收獲所產生的乳酸。
[0095] 本發明在最后一方面提供了高通量篩選用于微生物發酵的抗脅迫表達盒的方法， 所述方法包括以下步驟：
[0096] (a)將待篩選的表達盒導入到所述微生物；
[0097] (b)在脅迫沖擊下高通量評估所述微生物的存活率；
[0098] (c)用高通量生長測試儀如BioscreenC評估所述微生物在脅迫壓力環境下的生 長率；
[0099] (d)用高通量微型發酵儀器如BioLector評估所述微生物在脅迫壓力環境下的發 酵性能；
[0100] (e)將能夠提高所述微生物的所述存活率和/或所述生長率和/或所述發酵性能 的表達盒鑒定為可以用于微生物發酵的抗脅迫表達盒。
[0101] 如本文所用，"脅迫沖擊"是指將微生物置于能夠影響微生物存活的極端脅迫條件 下培養一段合適的時間。本領域技術人員能夠確定對于微生物的脅迫沖擊條件。例如，對 于大腸桿菌，酸沖擊是指在pH 2. 0-ρΗ 3. 0,優選pH 2. 5下培養例如1、2、3、4、5小時，優選 培養2小時。"脅迫壓力"是指主要影響微生物生長的脅迫條件。本領域技術人員能夠確定 對于微生物的脅迫壓力條件。例如，對于大腸桿菌，酸壓力是指pH低于7. 0但高于4. 0,例 如 pH 6. 0。
[0102] 本發明的高通量篩選抗脅迫表達盒的方法是一種逐級進行的全面綜合的評估方 法，該方法關聯了存活率、生長率和發酵性能，避免了單純通過的極端脅迫沖擊存活的評估 而忽視抗脅迫壓力對生長和發酵性能的影響，也避免了單純通過生長評估而忽視生長與發 酵性能平衡關系的影響，在兩步篩選后，采用高通量的微型發酵評估抗脅迫和發酵性能，最 終篩選獲得的少量最具利用前景的抗脅迫表達盒在工業發酵罐進行后續評估，從而避免直 接大量發酵評估所有抗酸表達盒，提高篩選的效果和效率。 實施例
[0103] 下面將通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所描述 的實施例范圍內。
[0104] 實施例1 :構建不同強度的啟動子的調控元件
[0105] 本實施例中選用10個具有不同強度的人工組成型啟動子[8]和RBS序列，通過基 因合成克隆在商用PUC57載體由Genscript中國（南京金斯瑞）公司合成。序列及強度信 息如表1所示。
[0106] 表1人工啟動子序列及強度
[0107]
[0108] 實施例2 :構建evgA抗酸表達盒
[0109] 2. 1 構建 pNatevgA-rrnBT 抗酸表達盒
[0110] 2. 1. 1 構建 pNatevgA-rrnBT 的 pBR322 中間表達載體
[0111] 本申請實施例中所使用的pNatevgA-rrnBT中間表達載體 pBR322-pNatevgA_rrnBT的構建過程，如圖1所示：
[0112] 首先使用試劑盒（Promega，A1125)提取大腸桿菌MG1655 (Novagen)基因組作 為模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常規方法進行PCR擴增獲得含天然啟動子的 pNatevgA 多核苷酸片段：上游引物 5? -GAGATTCCATGGGACTAAACCGTGGCTTTTGCAAT-3' (evgA_ U，SEQ ID N0:11，帶下劃線堿基為限制性內切酶Nco I識別位點），和下游引物5'-TTCCTT CTCGAGTTAGCCGATTTTGTTACGTTGTG-3'（evgA L,SEQ ID NO : 12,帶下劃線堿基為限制性內切 酶Xho I識別位點）。PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應 條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C 30sec，共 30 個循環；72°C 5min。反應結 束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條 帶。之后使用Tiangen公司的高純度DNA片段小提試劑盒進行凝膠分離回收。
[0113] 將得到PCR產物用限制性內切酶Nco I和Xho I進行雙酶切后，與經同樣酶雙酶 切的質粒pBR322-templ-rrnBT (此載體為發明人構建的載體，所述質粒的全長序列可見于 SEQ ID N0:13)進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態細胞，將轉化細胞涂 布于添加有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒，對其進行測序，測 序結果表明所克隆的pBR322-pNatevgA_rrnBT序列正確。
[0114] 2. 1. 2 構建 pNatevgA-rrnBT 的 pACYC184 表達載體
[0115] 本申請實施例中所使用的pNatevgA-rrnBT表達載體pACYC184-pNatevgA_rrnBT 的構建過程，如圖1所示：
[0116] 使用Tiangen公司的高純度質粒小提試劑盒提取由實施例2. 1. 1獲得的 pBR322-pNatevgA-rrnBT質粒作為模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常規方法進行 PCR 擴增獲得 pNatevgA-rrnBT (Xba I，Sal I)多核苷酸片段：h.游引物 5' -GAGATTTCTAGAG ACTAAACCGTGGCTTTTGCAATA-3'（pAE-Fl，SEQ ID N0:14,帶下劃線堿基為限制性內切酶 Xba I 識別位點），和下游引物 5' -TAGATTGTCGACGGATCCTAGATATGAC-3' (pAE-R, SEQ ID NO ：15, 帶下劃線堿基為限制性內切酶Sal I識別位點）。PCR反應使用全式金（transgen)公司的 Fast pfu 聚合酶，PCR反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，60°C 20sec，72°C 30sec，共 30個 循環；72°C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增 出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠分離回收。將得到PCR產物用限制性內切酶Xba I和 Sal I進行雙酶切后，與經同樣酶雙酶切的質粒pACYC184(NEB)進行連接，將連接產物轉化 到大腸桿菌MG1655感受態細胞，將轉化細胞涂布于添加有34 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩 選陽性克隆，提取質粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆的pACYC184-pNatevgA-rrnBT 序列正確。
[0117] 2.2 構建 pQevgA/pZevgA/pVevgA/pWevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/ pIIevgA/pOOevgA-rrnBT 抗酸表達盒
[0118] 2. 2. 1 構建 pQevgA/pZevgA/pVevgA/pWevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/ pIIevgA/pOOevgA-rrnBT 的 pBR322 中間克隆載體
[0119] 本申請實施例中所使用的中間克隆載體pBR322-tempevgA_rrnBT的構建過程，如 圖2所示：
[0120] 使用Tiangen公司的高純度質粒小提試劑盒提取pBR322-pNatevgA-rrnBT質粒作 為模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常規方法進行PCR擴增獲得evgA(Kpn I，Xho I)多核苷酸片段：上游引物 5' -TCCCTTGGTACCGCATGAACGCAATAATTATTGATGAC-3' (evgA-K， SEQ ID N0:16,帶下劃線堿基為限制性內切酶Κρη I識別位點），和下游引物5'-TACAGA￡I CGAGTTAGCCGATTTTGTTAC-3' (evgA_X，SEQ ID N0 :17,帶下劃線堿基為限制性內切酶 Xho I 識別位點）。PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為： 95°C，5min;95°C 20sec，60°C 20sec，72°C 30sec，共 30 個循環；72°C 5min。反應結束后，對 PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴