[0151] 3. 3. 1 構建中間克隆質粒 pBR322-gadB-gadC470-rrnBT
[0152] 本申請實施例中所使用的中間克隆質粒PBR322-gadB-gadC470-rrnBT的構建過 程，如圖6所不：
[0153] 以大腸桿菌MG1655基因組作為模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常規方 法進行PCR擴增gadB-gadC470多核苷酸片段：上游引物5'-AATGAACCATGGACTGCCGTTAAACA ATATCTTTCTC-3'（Bp-For，SEQ ID N0:45,帶下劃線堿基為限制性內切酶Nco I識別位點）， 和下游引物 5 ' -TAGATTCTCGAGTTATTTACGATCATGAACAGCA-3 ' (BCp-Rev，SEQ ID N0 :46,帶 下劃線堿基為限制性內切酶Xho I識別位點）。PCR反應使用全式金（transgen)公司的 Fast pfu 聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C 2min20sec， 共30個循環；72°C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結 果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠分離回收。將得到PCR產物用限制性內 切酶Nco I和Xho I進行雙酶切后，與經同樣酶雙酶切的質粒pBR322-pNatevgA-rrnBT進 行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態細胞，將轉化細胞涂布于添加有50 μ g/ mL氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆 的 pBR322-gadB-gadC470_rrnBT 序列正確。
[0154] 3. 3. 2 構建中間克隆質粒 pBR322-gadB(H465A)-gadC470-rrnBT
[0155] 本申請實施例中所使用的中間克隆質粒PBR322-gadB(H465A)-gadC470-rrnBT的 構建過程，如圖7所示：
[0156] 以大腸桿菌MG1655基因組作為模板，利用如下2套正向引物和反向引物，按照常 規方法進行PCR擴增兩個多核苷酸片段：
[0157] 第一套引物：上游引物（Bp-For，SEQ ID NO :45)，和下游引物 5'-CGTTAAACGTTATC AGGTAGCTTTAAAGCTGTTCTG-3'（H465A(C470)-rev，SEQ ID N0:47)。
[0158] 第二套引物：上游引物 5' -AAAGCTACCTGATAACGTTTAACGGTAAC-3'（C470(H465A)-f or，SEQIDN0 :48)，和下游引物（BCp-Rev，SEQIDN0:46)。
[0159] PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C， 5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C lmin30sec，共 30 個循環；72°C 5min。反應結束后，對PCR 擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝 膠分離回收。以獲得的兩個片段為模板，進行重疊 PCR反應。先在不加入引物的情況下，使 用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec， 65°C 20sec，72°C 2min30sec，共 10 個循環。然后加入上游引物（Bp-For，SEQ ID NO :45)和 下游引物（BCp-Rev，SEQ ID NO :46)，使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C 2min30sec，共 25 個循環。反應結束 后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶， 并進行凝膠分離回收。
[0160] 將得到PCR產物用限制性內切酶Nco I和Xho I進行雙酶切后，與經同樣酶雙酶 切的質粒pBR322-pNatevgA-rrnBT進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態細 胞，將轉化細胞涂布于添加有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒， 對其進行測序，測序結果表明所克隆的pBR322-gadB-gadC470-rrnBT序列正確。
[0161] 3. 3. 3 構建中間克隆質粒 pBR322-gadB(dHT)-gadC470-rrnBT
[0162] 本申請實施例中所使用的中間克隆質粒pBR322-gadB (dHT) -gadC470-rrnBT的構 建過程，如圖7所示：
[0163] 第一套引物：上游引物（Bp-For，SEQ ID NO :45)，和下游引物 5'-GTTACCGTTAAACG TTATCATTTAAAGCTGTTCTGTTGGG-3' （dHT(C470)-rev，SEQ ID N0:49)。
[0164] 第二套引物：上游引物 5' -GAACAGCTTTAAATGATAACGITTAACGGTAAC-3'（C470(dHT) -for，SEQIDN0 :50)，和下游引物（BCp-Rev，SEQIDN0:46)。
[0165] PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C， 5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C lmin30sec，共 30 個循環；72°C 5min。反應結束后，對PCR 擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝 膠分離回收。以獲得的兩個片段為模板，進行重疊 PCR反應。先在不加入引物的情況下，使 用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec， 65°C 20sec，72°C 2min30sec，共 10 個循環。然后加入上游引物（Bp-For，SEQ ID NO :45)和 下游引物（BCp-Rev，SEQIDN0:46)，使用全式金（transgen)公司的Fastpfu聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C 2min30sec，共 25 個循環。反應結束 后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶， 并進行凝膠分離回收。
[0166] 將得到PCR產物用限制性內切酶Nco I和Xho I進行雙酶切后，與經同樣酶雙酶 切的質粒pBR322-pNatevgA-rrnBT進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態細 胞，將轉化細胞涂布于添加有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒， 對其進行測序，測序結果表明所克隆的pBR322-gadB-gadC470-rrnBT序列正確。
[0167] 3. 3. 4 構建中間克隆質粒 pBR322-gadB (H465A&E89Q) / gadB(dHT&E89Q)-gadC47〇-rrnBT
[0168] 本申請實施例中所使用的中間克隆質粒pBR322-gadB (H465A&E89Q) / gadB(dHT&E89Q)-gadC470-rrnBT 的構建過程，如圖 7 所示：
[0169] 使用Tiangen公司的高純度質粒小提試劑盒提取由實施例3. 3. 2獲得的 pBR322-gadB (H465A)-gadC470-rrnBT質粒作為模板，分別利用如下2套正向引物和反向引 物，按照常規方法進行PCR擴增兩個多核苷酸片段：
[0170] 第一套引物：上游引物（Bp-For，SEQ ID NO :45)，和下游引物 5'-GGATTGCGGATACT GTTCTTTGTC-3'（E89Q-rev，SEQ ID NO :51)。
[0171] 第二套引物：上游引物5'-GACAAAGAACAGTATCCGCAATCC-3'（E89Q-for，SEQIDN0 : 52)，和下游引物（BCp-Rev，SEQ ID NO :46)。
[0172] PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C， 5min ;95°C 20sec，63°C 20sec，72°C lmin30sec，共 30 個循環；72°C 5min。反應結束后，對PCR 擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝 膠分離回收。以獲得的兩個片段為模板，進行重疊 PCR反應。先在不加入引物的情況下，使 用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec， 65°C 20sec，72°C 2min30sec，共 10 個循環。然后加入上游引物（Bp-For，SEQ ID NO :45)和 下游引物（BCp-Rev，SEQ ID NO :46)，使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C 2min30sec，共 25 個循環。反應結束 后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶， 并進行凝膠分離回收。
[0173] 將得到PCR產物用限制性內切酶Nco I和Xho I進行雙酶切后，與經同樣酶雙酶 切的質粒pBR322-pNatevgA-rrnBT進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態細 胞，將轉化細胞涂布于添加有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒， 對其進行測序，測序結果表明所克隆的pBR322-gadB (H465A&E89Q) -gadC470-rrnBT序列正 確。
[0174] 以實施例3. 3. 3獲得的pBR322-gadB (dHT) -gadC470-rrnBT質粒作為模板，經同樣 步驟，克隆pBR322-gadB (dHT&E89Q) -gadC470-rrnBT，測序結果表明序列正確。
[0175] 3. 4 擴增 gadB-gadC470/gadB(H465A)-gadC470/gadB(dHT)-gadC470/ gadB (H465A&E89Q) -gadC470/gadB (dHT&E89Q) -gadC470 多核苷酸片段
[0176] 本申請實施例中所使用的多核苷酸片段的擴增，如圖8所示：
[0177] 使用Tiangen公司的高純度質粒小提試劑盒提取由實施例3. 3獲得的5個中間克 隆質粒作為模板，分別利用如下正向引物和反向引物，按照常規方法進行PCR擴增5個多核 苷酸片段：上游引物 5' -ACAAATTGATGGATTTATCCATTAACA-3'（gadC470-F，SEQ ID N0:53)， 和下游引物 5' -TAGATTCTCGAGTTATTTACGATCATGAAC-3'（gC-Rl, SEQ ID NO :54,帶下劃線堿 基為限制性內切酶Xho I識別位點）。PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu 聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C lmin45sec，共 30 個循 環；72°C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增 出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠分離回收。
[0178] 3. 5 擴增 ybaS-rrnBT-gadB-gadC470/ybaS-gadB (H465A) _gadC470/ ybaS-gadB(dHT)-gadC470/ybaS-gadB(H465A&E89Q)-gadC470/ ybaS-gadB (dHT&E89Q) -gadC470 多核苷酸片段
[0179] 本申請實施例中所使用的多核苷酸片段的擴增，如圖8所示：
[0180] 重疊 PCR擴增以上5個多核苷酸片段：以實施例3. 4獲得的5個多核苷酸片段， 分別和以實施例3. 2獲得的ybaS-rrnBT-gadB作為模板，進行重疊 PCR反應。先在不加入 引物的情況下，使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C， 5min ;95°C 20sec，61°C 20sec，72°C 3min，共 10 個循環。然后加入上游引物（yS-Fl-A，SEQ ID NO :39)和下游引物（gC-Rl，SEQ ID NO :54)，使用全式金（transgen)公司的 Fast pfu 聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，61°C 20sec，72°C 3min，共 25 個循環。反 應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正 確條帶，并進行凝膠分離回收。
[0181] 3. 6構建ybaS-gadB-gadC的三基因抗酸表達盒表達質粒 pACYC184-ybaS-rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/gadB(H465A&E89Q) / gadB(dHT&E89Q)-gadC47〇-rrnBT
[0182] 本申請實施例中所使用的三基因抗酸表達盒表達質粒 pACYC184-ybaS-rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/gadB(H465A&E89Q) / gadB(dHT&E89Q)-gadC470-rrnBT 的構建過程，如圖 8 所示：
[0183] 將由實施例3. 5獲得的5條PCR產物用限制性內切酶Hind III和Xho I 進行雙酶切后，分別與經同樣酶雙酶切的由實施例3. 1獲得的質粒pACYC184-Hind III-pNatevgA-Xho I-rrnBT-BamH I進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態 細胞，將轉化細胞涂布于添加有34 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒，對 其進行測序，測序結果表明所克隆的5個ybaS-gadB-gadC的三基因抗酸表達盒表達質粒序 列正確。
[0184] 本實施例3中構建的5個ybaS-gadB-gadC的三基因抗酸表達 盒，包括 ybaS-rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/gadB(H465A&E89Q)/ gadB(dHT&E89Q)-gadC470-rrnBT，序列分別如 SEQ ID NO :55-59 所示。
[0185] 實施例4 :構建ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒
[0186] 本申請實施例中所使用的ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒表達質粒 pACYC184-ybaS-rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/gadB(H465A&E89Q)/gadB(dHT&E89Q )-gadC47〇-rrnBT-pSevgA_rrnBT 的構建過程，如圖 9 所示：
[0187] 使用Tiangen公司的高純度質粒小提試劑盒提取由實施例2. 2獲得