的 pBR322-pSevgA-rrnBT質粒作為模板，分別利用如下正向引物和反向引物，按照常規方法進 行 PCR 擴增 pSevgA-rrnBT 多核苷酸片段：上游引物 5?-AATGAAGGATCCCAATTCCGACGTCTAAGA AACCATTATT-3'（pAYE-2，SEQ ID N0:60,帶下劃線堿基為限制性內切酶BamH I識別位點）， 和下游引物 5 ' -TAGATTCCTGCATTAGGGACGTCTAGATATGACGACAGGAAGAGTTTGTAGAA-3 '（pAYE-R， SEQ ID N0:61，帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoN I識別位點）。PCR反應使用全式金 (transgen)公司的 Fast pfu 聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min;95°C20sec，62°C20sec， 72°C lmin，共30個循環；72°C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電 泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠分離回收。將得到PCR產物用 限制性內切酶BamH I和EcoN I進行雙酶切后，分別與經同樣酶雙酶切的由實施例3. 6獲 得的5個ybaS-gadB-gadC的三基因抗酸表達盒表達質粒進行連接，將連接產物轉化到大腸 桿菌MG1655感受態細胞，將轉化細胞涂布于添加有34 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩選陽性 克隆，提取質粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆的5個ybaS-gadB-gadC-evgA四基因 抗酸表達盒質粒序列正確。
[0188] 本實施例4中構建的5個ybaS-gadB-gadC-evgA的四基因抗酸表達盒，包括 ybaS-rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/gadB(H465A&E89Q)/gadB(dHT&E89Q)-gadC470 -;mlBT-pSevgA-rrnBT，序列分別如SEQIDN0:62-66 所不。
[0189] 實施例5 :抗酸表達盒對大腸桿菌MG1655的極端酸沖擊存活的影響
[0190] 通過氯化f丐法將由實施例2中獲得的evgA抗酸表達盒表達質粒 (pACYC184-pNatevgA/pQevgA/pZevgA/pVevgA/pffevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/ pIIevgA/pOOevgA-rrnBT)，由實施例3中獲得的ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒 表達質粒（pACYC184-ybaS-rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/gadB(H465A&E89Q)/ gadB(dHT&E89Q)-gadC47〇-r;rnBT)，由實施例 4 中獲得的 ybaS-gadB-gadC-evgA 四 基因抗酸表達盒表達質粒（pACYC184-ybaS_rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/ gadB(H465A&E89Q)/gadB(dHT&E89Q)-gadC470-rrnBT-pSevgA-rrnBT)，以及對照質粒 (pACYC184-rrnBT)分別轉化入大腸桿菌MG1655感受態細胞，通過菌落PCR和質粒測 序鑒定得到陽性克隆。分別接菌到LB培養基37°C、250rpm過夜培養，以0.8mL菌液 和0.2mL 60%甘油的比例混勻，凍存在-80°C冰箱。所對應菌株分別命名為：對照空 白菌株MG、對照質粒菌株RB ;含evgA抗酸表達盒菌株Εη/Ε1/Ε2/Ε3/Ε4/Ε5/Ε6/Ε7/Ε8/ E9/E10 ;含 ybaS-gadB-gadC 三基因抗酸表達盒菌株 YBC1/YBC2/YBC3/YBC4/YBC5 ;含 ybaS-gadB-gadC-evgA 四基因抗酸表達盒菌株 YBC1E6/YBC2E6/YBC3E6/YBC4E6/YBC5E6。
[0191] 將上述凍存的含抗酸表達盒質粒的菌株、對照質粒的菌株和大腸桿菌MG1655恢 復到LB固體培養基平板上（對于大腸桿菌MG1655,不添加抗生素；對于含抗酸表達盒質 粒、對照質粒的菌株，添加34 μ g/mL的氯霉素；下同），37°C過夜培養。分別接菌到添加有 2%葡萄糖的1^培養基〇^)中37°(：、250印111過夜培養，以1 :100比例轉接到新鮮的1^培 養基中37°C、250rpm培養約1. 5小時，當菌液0D6。。達到0. 5~0. 6時轉接到新鮮的LBG-pH 2. 5培養基（通過鹽酸調節LBG培養基至pH 2. 5)進行酸沖擊2小時，初始0D6。。均為0. 05。 將沖擊后的菌液用新鮮的無抗性的LBG培養基進行1:10、1:100、1:1000、1:10000的梯度稀 釋，并分別取4 μ L點樣在無抗性的LB固體培養基平板上，37°C過夜培養，觀測平板菌落生 長情況。
[0192] 結果：
[0193] 1.對于evgA抗酸表達盒，沖擊后存活如圖10所示。
[0194] (1)對照菌株MG和RB，酸沖擊后存活幾乎為零。
[0195] (2)含天然啟動子的evgA抗酸表達盒的菌株（En):酸沖擊后存活比對照菌株MG、 RB提高約104倍。
[0196] (3)含10個不同強度的組成型人工啟動子的evgA抗酸表達盒的菌株（E1/E2/E3/ E4/E5/E6/E7/E8/E9/E10):啟動子表達強度較強的菌株（E1/E2/E3/E4/E5/E6)，酸沖擊后 存活比對照菌株MG、RB提高約10 4倍；啟動子表達強度較弱的菌株（E7/E8/E9)，酸沖擊后 存活比對照菌株MG、RB提高約102~10 3倍；啟動子表達強度最弱的菌株（E10)，酸沖擊后 存活與對照菌株MG、RB相似。
[0197] 2.對于ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒，沖擊后存活如圖11所示。
[0198] (1)含三基因抗酸表達盒的菌株（YBC1/YBC2/YBC4)，酸沖擊后存活比對照菌株 MG、RB提高約2-10倍。
[0199] (2)含三基因抗酸表達盒的菌株（YBC5)，酸沖擊后存活比對照菌株MG、RB提高約 1〇2 倍。
[0200] (3)含三基因抗酸表達盒的菌株（YBC3)，酸沖擊后存活比對照菌株對照菌株MG、 RB提高約103倍。
[0201] 3.對于ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒，沖擊后存活如圖12所示。
[0202] (1)含四基因抗酸表達盒的菌株（YBC1E6/YBC2E6/YBC3E6/YBC4E6/YBC5E6)，酸沖 擊后存活比對照菌株MG、RB提高約10 2~10 3倍，比含evgA抗酸表達盒的菌株（E6)存活低 約10倍。
[0203] (2)含四基因抗酸表達盒的菌株（YBC1E6/YBC2E6/YBC4E6/YBC5E6)，酸沖擊后存 活分別比對應含三基因抗酸表達盒的菌株（YBC1/YBC2/YBC4/YBC5)提高約10 2倍；含四 基因抗酸表達盒的菌株（YBC3E6)，酸沖擊后存活分別比對應含三基因抗酸表達盒的菌株 (YBC3)提高約10倍。
[0204] 本實施例5說明：不同表達強度的evgA抗酸表達盒帶來菌株不同程度的酸沖擊存 活的提高，表達越強，存活提高越明顯；ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒帶來菌株酸沖 擊存活的提高；ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒可以帶來比對應ybaS-gadB-gadC 三基因抗酸表達盒提高的菌株酸沖擊存活。
[0205] 實施例6 :抗酸表達盒對酸壓力生長的效果
[0206] 將由實施例5獲得的含抗酸表達盒質粒的菌株、對照質粒的菌株和大腸桿菌 MG1655分別接菌到添加有LBG培養基中37°C、250rpm過夜培養，以初始0D6000. 05轉接到 300 μ L新鮮的初始pH 7. 0的賴氨酸發酵培養基（或同時添加10mM谷氨酰胺和10mM谷氨 酸鈉）中，使用全自動生長曲線分析儀Bioscreen C(芬蘭，Oy Growth Curves Ab Ltd)和 100孔板（Honeycompb Plate，可同時使用2塊），進行高通量生長測試。
[0207] 生長測試中賴氨酸發酵培養基的成分如表2所示，培養基用Κ0Η調節pH至7. 0,其 中葡萄糖、硫酸鎂單獨進行滅菌后添加入培養基中。隨生長測試的進行，培養基pH逐漸降 低至約4. 8,滿足酸壓力的生長測試評估。
[0208] 表2生長測試中賴氨酸發酵培養基的成分
[0209]
[0210]
[0211] 結果：
[0212] 1.對于evgA抗酸表達盒，酸壓力生長測試結果如圖13所示。
[0213] 在不添加谷氨酰胺和谷氨酸鈉的發酵培養基中生長24小時后，各菌株的生長 (Bioscreen C所測初始時刻與24小時時刻的Δ 〇D_)如表3所示。
[0214] 表3含evgA抗酸表達盒菌株酸壓力生長測試
[0215]
[0216] (1)含pNatevgA-rrnBT抗酸表達盒的菌株（En)，24小時生長均比對照菌株MG、RB 高，其中比對照菌株MG提高8. 6 %。
[0217] (2)含不同強度人工啟動子的evgA抗酸表達盒的菌株，其中：菌株E1/E2/E3/ E4/E5/E6/E7, 24小時生長均比對照菌株MG、RB高，其中比對照菌株MG分別提高23. 3 % /28.0% /42.3% /25. 1% /17.9% /11.6% /2. 7 %;菌株 E8, 24 小時生長比對照菌株 MG 提 高0. 4%，比對照菌株RB降低2. 0% ;菌株E9/E10, 24小時生長均比對照菌株MG、RB低，其 中比對照菌株MG分別降低3. 8 % /5. 4 %。
[0218] (3)不同表達強度的evgA抗酸表達盒帶來菌株不同程度的酸壓力生長耐受性的 提高，其中抗酸表達盒pVevgA-rrnBT，能夠提高對照菌株大腸桿菌MG1655在上述培養基中 的酸壓力生長耐受性，24小時時刻的生長有42. 3%的提高。
[0219] 2.對于ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒，酸壓力生長測試結果如圖14所示。
[0220] 在不添加（圖14A)或同時添加（圖14B) 10mM谷氨酰胺和10mM谷氨酸鈉的發酵培 養基中生長24小時后，各菌株的生長（Bioscreen C所測初始時刻與24小時時刻的A〇D6J 如表4所示。
[0221] 表4含ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒菌株酸壓力生長測試
[0222]
[0223] (1)在不添加時，含ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒的菌株（YBC1/YBC2/YBC3/ YBC4/YBC5)，24小時生長均比對照菌株MG、RB低。
[0224] (2)在添加時，含ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒的菌株（YBC1/YBC2/YBC3/ YBC4/YBC5)，24小時生長均比對照菌株MG、RB高，其中比對照菌株MG分別提高40. 6 % /36. 2 % /64. 6 % /28. 9 % /54. 8 %。
[0225] (3) ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒在添加有谷氨酰胺、谷氨酸鈉時，能夠提高 對照菌株大腸桿菌MG1655在上述培養基中的酸壓力生長耐受性。
[0226] 3.對于ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒，酸壓力生長測試結果如圖15所 不。
[0227] 在不添加（圖15A)或同時添加（圖15B) 10mM谷氨酰胺和10mM谷氨酸鈉的發酵培 養基中生長24小時后，各菌株的生長（Bioscreen C所測初始時刻與24小時時刻的A〇D6J 如表5所示。
[0228] 表5含ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒菌株酸壓力生長測試
[0229]
[0230] (1)在不添加時，含ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒的菌株（YBC1E6/ YBC2E6/YBC3E6/YBC4E6/YBC5E6)，24小時生長均比對照菌株MG、RB高，其中比對照菌株MG 分別提高 57. 6% /54. 3% /68. 7% /42. 4% /57. 6%。
[0231] (2)在添加時，含ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒的菌株（YBC1E6/ YBC2E6/YBC3E6/YBC4E6/YBC5E6)，24小時生長均比對照菌株MG、RB高，其中比對照菌株MG 分別提高 72. 5% /68. 1% /86. 1% /71. 7% /70. 6%。
[0232] (3)ybaS-gadB-gadC-evgA四基因抗酸表達盒在不添加或添加有谷氨酰胺、谷氨酸 鈉時，均能夠提高對照菌株大腸桿菌MG1655在上述培養基中的酸壓力生長耐受性。
[0233] 實施例7 :抗酸表達盒對賴氨酸發酵的效果
[0234] 通過電轉化法將由實施例2中獲得的evgA抗酸表達盒表達質粒 (pACYC184-pNatevgA/pQevgA/pZevgA/pVevgA/pffevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/ pIIevgA/pOOevgA-rrnBT)，由實施例3中獲得的ybaS-gadB-gadC三基因抗酸表達盒 表達質粒（pACYC184-ybaS-rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/gadB(H465A&E89Q)/ gadB(dHT&E89Q)-gadC47〇-r;rnBT)，由實施例 4 中獲得的 ybaS-gadB-gadC-evgA 四 基因抗酸表達盒表達質粒（pACYC184-ybaS_rrnBT-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/ gadB (H465A&E89Q) /gadB (dHT&E89Q) -gadC470-rrnBT-pSevgA-rrnBT)分別轉化入一株經 改造的產賴氨酸大腸桿菌MG1655菌株（該菌株為以MG1655菌株為基礎，根據中國專利 申請CN103773745A所公開的方法進行改造獲得的產賴氨酸菌株SCEcL3 (pSLLl))電轉感 受態細胞中，通過菌落PCR和質粒測序鑒定得到陽性克隆。分別接菌到LB培養基37°C、 250rpm過夜培養，以0. 8mL菌液和0. 2mL 60%甘油的比例混勻，凍存在-80°C冰箱。所對 應菌株分別命名為：親本產賴氨酸菌株P、含evgA抗酸表達盒菌株ΡΕη/ΡΕ1/ΡΕ2/ΡΕ3/ΡΕ4/ PE5/PE6/PE7/PE8/PE9/PE10 ;含 ybaS-gadB-gadC 三基因抗酸表達盒菌株 PYBC1/PYBC2/ PYBC3/PYBC4/PYBC5 ;含 ybaS-gadB-gadC-evgA 四基因抗酸表達盒菌株 PYBC1E6/PYBC2E6/ PYBC3E6/PYBC4E6/PYBC5E6。
[0235] 將上述凍存的含抗酸表達盒質粒的產賴氨酸菌株和親本產賴氨酸菌株恢復到LB 固體培養基平板上（對于親本產賴氨酸菌株，添加50 μ g/mL氨芐青霉素 mL ;對于含抗酸 表達盒質粒的產賴氨酸菌株，添加50 μ g/mL氨芐青霉素 mL和34 μ g/mL的氯霉素），37°C 過夜培養。分別接菌到2mL LB培養基中37°C、200rpm過夜培養。以1:10的比例轉接到 1. 2mL發酵培養基中，使用微型生物反應器BioLector (德