增出與預期相符的正確條帶，并進 行凝膠分離回收。將得到PCR產物用限制性內切酶Κρη I和Xho I進行雙酶切后，與經同 樣酶雙酶切的質粒pBR322-temp2-rrnBT (此載體為發明人構建的載體，所述質粒的全長序 列可見于SEQ ID N0:18)進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態細胞，將轉 化細胞涂布于添加有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒，對其進行 測序，測序結果表明所克隆的PBR322中間克隆載體序列正確。
[0121] 2. 2. 2 構建 pQevgA/pZevgA/pVevgA/pWevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/ pIIevgA/pOOevgA-rrnBT 的 10 個 pBR322 中間表達載體（pBR322_pQevgA/pZevgA/pVevgA/ pffevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/pIIevgA/pOOevgA-rrnBT)
[0122] 本申請實施例中所使用的10個pBR322中間表達載體的構建過程，如圖2所示：
[0123] 使用實施例1中合成的含人工啟動子序列的10個pUC57質粒為作為模板，利用如 下2套正向引物和反向引物，按照常規方法進行PCR擴增獲得10個含人工啟動子部分序列 的多核苷酸片段：
[0124] 第一套引物：上游引物 5' -CGAGCCAAGCTTAAGCTTCAATTC-3' (5N-U ：SEQ ID NO ：19, 帶下劃線堿基為限制性內切酶Hind III識別位點），和下游引物5' -TTTAATGAATTCGGTCAG TGCGTC-3'（5N-L :SEQ ID N0 :20,帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoR I識別位點），用于擴 增9個含人工啟動子部分序列的多核苷酸片段（pQ/pZ/pV/pW/pN/pS/pAA/pJJ/p00)。
[0125] 第二套引物：上游引物 5' -CGAGCCAAGCTTAAGCTTCAATC-3' (9II-U ：SEQ ID NO ：21, 帶下劃線堿基為限制性內切酶Hind III識別位點），和下游引物（5N-L:SEQ ID NO :20)，用 于擴增1個多核苷酸片段（pll)。
[0126] PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C， 5min ;95°C 20sec，63°C 20sec，72°C 20sec，共 30 個循環；72°C 5min。反應結束后，對 PCR 擴 增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠 分離回收。將得到PCR產物用限制性內切酶Hind III和EcoR I進行雙酶切后，與經同樣 酶雙酶切的中間克隆載體pBR322-tempevgA-rrnBT進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌 MG1655感受態細胞，將轉化細胞涂布于添加有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性 克隆，提取質粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆的PBR322中間表達載體序列正確。
[0127] 2. 2. 3 構建 pQevgA/pZevgA/pVevgA/pWevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/ pIIevgA/pOOevgA-rrnBT 的 10 個 pACYC184 表達載體（pACYC184_pQevgA/pZevgA/pVevgA/ pffevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/pIIevgA/pOOevgA-rrnBT)
[0128] 本申請實施例中所使用的10個pACYC184表達載體的構建過程，如圖3所示：
[0129] 使用Tiangen公司的高純度質粒小提試劑盒提取實施例2. 2. 2中構建的10個 pBR322 中間表達載體（pBR322_pQevgA/pZevgA/pVevgA/pWevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/ pJJevgA/pIIevgA/p00evgA-rrnBT)質粒為作為模板，利用如下4套正向引物和反向引物， 按照常規方法進行PCR擴增獲得10個人工啟動子-evgA-rrnBT (pQevgA/pZevgA/pVevgA/ pWevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/pIIevgA/pOOevgA-rrnBT) (Xba I，Sail)的多核 苷酸片段：
[0130] 第一套引物：上游引物 5 ' -GAGATTTCTAGAAAGCTTCAATTCCGACGTCTAAGA-3 '（pAE -F2，SEQIDN0:22，帶下劃線堿基為限制性內切酶XbaI識別位點），和下游引物（pAE-R， SEQ ID N0:15)，用于擴增 7 個多核苷酸片段（pQevgA/pZevgA/pWevgA/pNevgA/pSevgA/ pAAevgA/pJJevgA-rrnBT)〇
[0131] 第二套引物：上游引物 5 ' -GAGATTTCTAGAAAGCTTCAATTCCGACGTCTAAGA-3 '（pAE -F3，SEQIDN0:23，帶下劃線堿基為限制性內切酶XbaI識別位點），和下游引物（pAE-R， SEQ ID NO :15)，用于擴增1個多核苷酸片段（pVevgA-rrnBT)。
[0132] 第三套引物：上游引物 5 ' -GAGATTTCTAGAAAGCTTCAATCCGACGTCTGAGA-3 '（pAE_F4， SEQIDN0:24，帶下劃線堿基為限制性內切酶XbaI識別位點），和下游引物（pAE-R，SEQ ID NO :15)，用于擴增1個多核苷酸片段（pIIevgA-rrnBT)。
[0133] 第四套引物：上游引物 5 ' -GAGATTTCTAGAAAGCTTCAATTCCGACGTCTAAG-3 '（pAE_F5， SEQIDN0:25，帶下劃線堿基為限制性內切酶XbaI識別位點），和下游引物（pAE-R，SEQ ID NO :15)，用于擴增1個多核苷酸片段（pOOevgA-rrnBT)。
[0134] PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C， 5min ;95°C 20sec，62°C 20sec，72°C 30sec，共 30 個循環；72°C 5min。反應結束后，對 PCR 擴 增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠 分離回收。將得到PCR產物用限制性內切酶Xba I和Sal I進行雙酶切后，與經同樣酶雙 酶切的中間克隆載體PACYC184進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態細胞， 將轉化細胞涂布于添加有34 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒，對其進行 測序，測序結果表明所克隆的人工啟動子-evgA的10個pACYC184表達載體序列正確。
[0135] 2. 3 構建對照質粒 pACYC184-rrnBT
[0136] 本申請實施例中所使用的對照質粒pACYC184-rrnBT的構建過程，如圖4所示：
[0137] 使用Tiangen公司的高純度質粒小提試劑盒提取由實施例2. 2獲得的 pACYC184-pNatevgA-rrnBT質粒，經限制性內切酶Xba I和Xho I雙酶切后，載體骨架 用T4DNA polymerase(NEB)進行平末端化，反應條件為：12°C，30min;加入1.5μ1 0.2M EDTA，75°C，20min。純化后通過T4DNA ligase(NEB)連接后轉化到大腸桿菌MG1655感受態 細胞，將轉化細胞涂布于添加有34 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒，對 其進行測序，測序結果表明所克隆的pACYC184-rrnBT序列正確。
[0138] 本實施例2中構建的evgA抗酸表達盒，包括pNatevgA-rrnBT和pQevgA/pZevgA/ pVevgA/pWevgA/pNevgA/pSevgA/pAAevgA/pJJevgA/pIIevgA/pOOevgA-rrnBT，序列分別如 SEQ ID NO :26-36 所示。
[0139] 實施例3 :構建ybaS-gadB-gadC的三基因抗酸表達盒
[0140] 構建 ybaS-gadB/gadB (H465A)/gadB (dHT)/gadB (H465A&E89Q) / gadB(dHT&E89Q)-gadC470-rrnBT三基因抗酸表達盒的pACYC184表達質 粒 pACYC184-ybaS-rrnBT-gadB/gadB (H465A)/gadB (dHT)/gadB (H465A&E89Q)/ gadB(dHT&E89Q)-gadC470-rrnBT。其中：ybaS 的啟動子為 ybaS 天然啟動子（SEQ ID NO: 70)，gadB-gadC470操縱子的啟動子為gadB天然啟動子（SEQ ID NO :72)。
[0141] 3· 1 構建中間克隆質粒 pACYC184_Hind III-pNatevgA-Xho I-rrnBT-BamH I
[0142] 本申請實施例中所使用的中間克隆質粒pACYC184_Hind III-pNatevgA-Xho I-rrnBT-BamH I的構建過程，如圖5所示：
[0143] 使用Tiangen公司的高純度質粒小提試劑盒提取由實施例2. 1. 1獲得的 pBR322-pNatevgA-rrnBT質粒作為模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常規方法進行 PCR擴增獲得pNatevgA-rrnBT (Hind III，Xho I)多核苷酸片段：h.游引物 5'_AATGATAAGCT IGACTAAACCGTGGCTTTTGCA-3'（evgA-Fn，SEQ ID NO :37,帶下劃線堿基為限制性內切酶Hind III 識別位點），和下游引物 5' -TAGATTGGATCCTAGATATGACGACAG-3' (evgA-Rn，SEQ ID N0 : 38,帶下劃線堿基為限制性內切酶Xho I識別位點）。PCR反應使用全式金（transgen)公 司的 Fast pfu 聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，58°C 20sec，72°C lmin， 共30個循環；72°C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結 果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠分離回收。將得到PCR產物用限制性內 切酶Hind III和Xho I進行雙酶切后，與經同樣酶雙酶切的質粒pACYC184進行連接，將連 接產物轉化到大腸桿菌MG1655感受態細胞，將轉化細胞涂布于添加有34 μ g/mL氯霉素的 LB平板上篩選陽性克隆，提取質粒，對其進行測序，測序結果表明所克隆的pACYC184-Hind III-pNatevgA-Xho I-rrnBT-BamH I 序列正確。
[0144] 3. 2擴增ybaS-rrnBT-gadB多核昔酸片段
[0145] 本申請實施例中所使用的ybaS-rrnBT-gadB多核苷酸片段的擴增，如圖8所示：
[0146] PCR擴增ybaS多核苷酸片段：以大腸桿菌MG1655基因組作為模板，利用如下正 向引物和反向引物，按照常規方法進行PCR擴增：上游引物5' -AATGATAAGCTTTCGATTTGCAT CAGGATTAGACATT-3'（yS-Fl-A，SEQ ID N0:39,帶下劃線堿基為限制性內切酶 Hind III 識 別位點），和下游引物 5' -GCCTTCTAGATCAGCCCTTAAACAC-3' (yS_R，SEQ ID N0 :40,帶下劃 線堿基為限制性內切酶Xba I識別位點）。PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu 聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，60°C 20sec，72°C lmin，共 30 個循環； 72 °C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與 預期相符的正確條帶，并進行凝膠分離回收。
[0147] PCR擴增rrnBT多核苷酸片段：以由實施例2. 1. 1獲得的pBR322-pNatevgA-rrnBT 質粒作為模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常規方法進行PCR擴增：上游引物 5' -GTTTAAGGGCTGATCTAGAAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCGTCGAA-3' (rB-F, SEQ ID NO ：41, 帶下劃線堿基為限制性內切酶Xba I識別位點），和下游引物5'-TATTGTTTAACGGCAGTCCCGG GTAGATATGACGACAGGAAGAGTTTGTAGAA-3'（rB-R，SEQ ID N0:42,帶下劃線堿基為限制性內切 酶Xmal識別位點）。PCR反應使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應 條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，60°C 20sec，72°C 30sec，共 30 個循環；72°C 5min。反應結 束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條 帶，并進行凝膠分離回收。
[0148] PCR擴增gadB多核苷酸片段：以大腸桿菌MG1655基因組作為模板，利用如下正向 引物和反向引物，按照常規方法進行PCR擴增：上游引物5'-CCCGGGACTGCCGTTAAACAATATCT TTCTC-3'（gBC-F，SEQ ID N0:43,帶下劃線堿基為限制性內切酶Xma I識別位點），和下游 引物 5'-TGTTAATGGATAAATCCATCAATTTGT-3'（gBC-R，SEQ ID N0:44)。PCR 反應使用全式金 (transgen)公司的 Fast pfu 聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min;95°C20sec，60°C20sec， 72°C 30sec，共30個循環；72°C 5min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電 泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠分離回收。
[0149] 重疊 PCR擴增ybaS-rrnBT-gadB多核苷酸片段：以前述獲得的ybaS、rrnBT、gadB 為模板，進行重疊 PCR反應。先在不加入引物的情況下，使用全式金（transgen)公司的Fast pfu 聚合酶，PCR 反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec，65°C 20sec，72°C lmin30sec，共 10 個 循環。然后加入上游引物（yS-Fl-A，SEQ ID NO :39)和下游引物（gBC-R，SEQ ID NO :44)， 使用全式金（transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反應條件為：95°C，5min ;95°C 20sec， 65°C 20sec，72°C lmin30sec，共25個循環。反應結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝 膠電泳檢測，結果PCR擴增出與預期相符的正確條帶，并進行凝膠分離回收。
[0150] 3.3 構建中間克隆質粒 pBR322-gadB/gadB(H465A)/gadB(dHT)/ gadB(H465A&E89Q)/gadB(dHT&E89Q)-gadC47〇-rrnBT