0、D16S539、 TH01、TP0X和CSF1P0。關于開發用于STR分析的多重PCR的詳述，除其它地方之外，還可參見 PCT專利申請W0 2009/059049 A1。在一些實施方案中，PCR反應不是多重的。可合并非-多重 PCR反應中產生的擴增子，然后進行儀器分析，所述儀器例如熒光DNA片段分析儀(例如自動 化DNA測序儀)或質譜儀。STR標記的質譜分析除其它之外還可參見美國專利6，090，558。
[0032] 其它實施方案包括用于共擴增至少兩種快速突變Y-STR標記的PCR引物組。實施方 案包括用于共擴增本文提供的快速突變Y-STR標記的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12種或全部 13種的PCR引物組。在一些實施方案中，PCR引物組可包括用于共擴增非快速突變Y-STR標記 的Y-STR標記的引物。在一些實施方案中，所述PCR引物組可包括用于共擴增常染色體上存 在的STR標記的PCR引物。
[0033] 本發明的實施方案還包括等位基因梯以幫助鑒定快速突變Y-STR標記的等位基 因。所述等位基因梯可包括用于快速突變Y-STR標記的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12種或 全部13種的大小標準品組。對于存在于等位基因梯的各標記，等位基因梯可包括一個或多 個等位基因的標準品。等位基因梯可包括給定快速突變Y-STR標記的所有已知等位基因的 大小標準品，或者已知等位基因的任何亞組。在一些實施方案中，等位基因梯中的大小標準 品可用一種或多種熒光染料標記。在一些實施方案中，等位基因梯還可包括用于常染色體 STR標記的大小標準品。在一些實施方案中，等位基因梯還可包括用于非快速突變Y-STR標 記的Y-STR標記的大小標準品。
[0034] 本發明的其它實施方案包括用于確定兩種或更多種快速突變Y-STR標記的等位基 因的試劑盒。所述試劑盒的實施方案可包括本發明擴增引物組。在一些實施方案中，所述試 劑盒可包括用于核酸擴增反應的一種或多種試劑。所述試劑的實例包括但不限于DNA聚合 酶、dNTP、緩沖液、核酸純化試劑等。在一些實施方案中，所述試劑盒可包括經設計作為一種 或多種快速突變Y-STR標記等位基因的大小標準品的等位基因梯，所述等位基因通過存在 于試劑盒中的擴增引物而產生(或可能通過所述引物產生）。因此，在一些實施方案中，所述 試劑盒可包括特異性適用于通過將試劑盒引物用于擴增反應而產生的擴增子的等位基因 梯。例如包括用于共擴增快速突變Y-STR標記DYF387S1、DYF399S1和DYF404S1的引物的試劑 盒還可包括具有用于快速突變Y-STR標記DYF387S1、DYF399S1和DYF404S1的各種等位基因 的大小標準品的等位基因梯。所述試劑盒可包含用于共擴增全部13種RM-Y-STR的引物以及 具有如本領域技術人員已知的合適大小標準品的等位基因梯。就給定STR標記而言，等位基 因梯的組分大小標準品可用與用于產生分析樣品中實際等位基因擴增子的引物相同或不 同的可檢測標記來標記，所述標記例如熒光染料。
[0035] 通過參考以下包含實驗數據的實施例可更好地理解本發明。所述信息提供為實例 且并非旨在限制所要求保護的本發明范圍。本文提出的實例和數據在K. Ballantyne等.〃 Mutability of Y-Chromosomal Microsatellites: Rates, Characteristics, Molecular Bases and Forensic Implications" Am. J. Hum. Genet. 87:341 -353 (2010年9月10日）中公布并且在線公布于2010年9月2日，各通過引用結合到本文中。 實施例
[0036] 樣品 除家族或政府文件之外，用于突變率研究的所有父子對還通過利用常染色體STR、Y-STR、HLA和RFLP基因型分型和血液分型的分子分析來確認其父子關系。將本研究中包括的 父子關系的概率閾值設定為99.9%。樣品獲自德國的柏林、萊比錫和科隆地區以及波蘭的華 沙和弗羅茨瓦夫。由于DNA量低，使用GenomiPhi DNA擴增試劑盒(GE Healthcare, Little Chalfont，UK)對萊比錫樣品進行全基因組擴增。按照制造商的建議進行WGA反應，并且使 用Invisorb 96 Filter Microplates (Invitek GmbH, Berlin, Germany)對產物進行純 化。來自男性親屬的另外的獨立樣品組(不是用于男性家族或系譜的可突變性初篩，用于驗 證經鑒定的快速突變Y-STR的值)來自德國的格賴夫斯瓦爾德(Greifswald)、基爾和柏林地 區、比利時的魯汶地區、波蘭的華沙地區以及加拿大和德國中部，正如其他地方12所述。所 有家族/系譜通過與父子對相同的方法來確認；將對于快速突變(RM) Y-STR和Yfiler Y-STR兩者具有完整基因型的對考慮用于分析，或者在部分基因型的情況下，僅包括在一個或 多個基因座顯示突變的那些。用于本研究目的的所有樣品的使用符合制度規章并且在告知 許可下進行。
[0037]標記和基因型分型實驗方案 Y-STR標記主要選自先前研究，另外包括項目開始時已知的Y-STR 42，所述先前研究詳 述了大量（167種)先前未知的Y-STR 29。關注點在單拷貝Y-STR標記上以便在鑒定突變時能 夠通過DNA序列分析來充分確認基因型差異。然而，鑒于我們的目的是尋找RM Y-STR，我們 包括了一些額外的多拷貝Y-STR，特別是具有高多樣性的那些(通過獨立基因型分型對其進 行突變確認）。基因座、引物序列和實驗方案的完整列表可參見在線補充數據S1。用市售的 試劑盒，AmpF/STR Yfiler PCR擴增試劑盒(Applied Biosystems)，遵循制造商的說明書， 對186種Y-STR中的17種進行基因型分型。實驗方案和標記的完整描述可參見（28)。用各包 括1至5種標記的54個多重測定對其余169種Y-STR進行基因型分型。用3種不同的實驗方案 進行PCR，并且在補充數據S1中提供詳情。此外，在男性親屬的獨立樣品組中采用3個多重測 定，對研究期間鑒定為快速突變(RM) Y-STR的13種Y-STR進行基因型分型。所有PCR均在 Erasmus MC Rotterdam法醫分子生物學部門的GeneAmp PCR System 9700儀器（Applied Biosystems)上進行。用Applied Biosystems, Foster City, USA的3130x/ Genetic分析 儀（Applied Biosystems)進行片段長度分析。用GeneMapper軟件（ID v 3.2，Applied Biosystems)對生成的譜進行基因型分型。采用內部研發的微軟Excel 2007宏來鑒定基因 型差異。父子兩者在Y-STR基因座的全部突變通過鹿特丹的DNA序列分析來確認，如Μ. Goedbloed等(2009) Int. J. Legal. Med. 123，471-482中描述的。具有三個或更多個等 位基因的多拷貝Y-STR基因座不能夠被測序，但通過至少兩次獨立地片段長度分析擴增來 確認突變。
[0038]統計數據分析 如Goedbloed中描述的，米用如WinBUGS中實施的Marcov Chain Monte Carlo (MCMC) Gibbs抽樣，用二項式分層貝葉斯模型43來估計個體標記的突變率。簡言之，認為可將各突 變率看作是任何Y-STR潛在的突變率的實現。簡言之，我們認為Y-STR i的突變率0!為來自 由超參數（hyperparameter)〇定義的共同群體分布（common population distribution) 的樣品。這樣，經估計的Y-STR突變率并入了對該Y-STR所觀察到的數據提供的信息(在所有 觀察的父子對中所觀察到的突變數）以及在來自全部Y-STR的超參數中估計的"所述Y-STR" 突變率的信息。在實踐中，這暗示未觀察到突變的Y-STR將顯示比其它觀察到大量突變的Y-STR更小的突變率（由后驗分布估計），但總不同于0。
[0039]各Y-STR的突變率以對元（logit)形式編碼，并且認為將遵循正態分布，其具有待 估計的參數S和^以及各STR的特定突變率。由于在我們的研究前，僅可得到非常有限 的關于Y-STR突變率范圍的數據，因此我們假定就超參數而言的擴散、無信息先驗分布。針 對超參數η指定無信息先驗正態分布（μ=0, 0=1 Χ?ο"6)并且針對參數η指定具有參數α= 1χ10-5和β = 1χ10-5的先驗擴散γ分布。當估計各基因座的突變率時，用Gibbs采樣器 (sampler)平行產生了 3個MCMC鏈，對各鏈均運行100，000次。在廢棄最初50，000次運行以及 進行15的細化(thinning)后，根據3個鏈對均值、中值和95%可信區間（CI)進行估計以便減 少相鄰模擬間自相關的量。抽樣群體(科隆、柏林、萊比錫、華沙和弗羅茨瓦夫）間突變率的 基因座-特異性差異借助排列分析(permutation analysis)來測試。各基因座以及各群體 的平均突變率與假定排列群體(permutated population)相比，其中各父子對隨機分配至 群體，對于各基因座保持原始樣品大小。將排列的