操作，從 而降低其非匹配組織相容性抗原的免疫原性。
[0070] 主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑
[0071] 本發明的動物實驗和人體試驗表面，使用主要組織相容性復合物基因或其蛋白的 抗抑制劑可改善非匹配組織相容性抗原的免疫原性。
[0072] 如本文所用，術語"本發明的活性成分"、"本發明抑制劑"、"主要組織相容性復合 物基因或其蛋白的抑制劑"可互換使用，都指能夠降低主要組織相容性復合物基因或其蛋 白表達和/或活性的物質。
[0073] 代表性的主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑包括小分子化合物、 microRNA、反義核酸、或抗體等。通常，在獲得了主要組織相容性復合物基因或其蛋白序列 之后，送些主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑可通過常規方法設計、篩選、制備 或購買獲得。
[0074] 優選的主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑為篩選獲得的高表達的非 匹配組織相容性抗原的抑制劑，例如siRNA、ShRNA等。優選的SiRNA可W通過比較供受體之 間的非匹配組織相容性抗原的匹配程度后設計獲得。例如SEQ ID NO. :4-5(小鼠），9-10、 12-13、15-16(人）所示的序列。
[0075] 可用于本發明的主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑的有效治療濃度 可W根據非匹配組織相容性抗原的表達量W及定時對其降低免疫排斥反應的效果的監測 來確定，送些均是本領域常規的方法。
[0076] 藥物組合物
[0077] 本發明的藥物組合物包含安全有效量的本發明的主要組織相容性復合物基因或 其蛋白的抑制劑W及藥理上可接受的賦形劑或載體。
[0078] 其中，"安全有效量"指的是：主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑的量 足W明顯改善主要組織相容性復合物基因或其蛋白的表達量和/或活性，而不至于產生嚴 重的副作用。通常，藥物組合物含有0.1 -IOmg本發明的主要組織相容性復合物基因或其蛋 白的抑制劑/劑，更佳地，含有0. 3-3mg本發明主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制 劑/劑。較佳地，所述的"一劑"為一個安無。
[0079] -種優選的主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑為非匹配主要組織相 容性復合物中篩選獲得的高表達抗原編碼序列的抑制劑，例如SiRNA,所述的SiRNA可W如 沈Q ID NOs. :4、5、9、10、12、13、15、或16所示。
[0080] "藥學上可W接受的載體"指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物 質，它們適合于人使化而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。"相容性巧此指的是組合 物中各組份能和本發明的主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑W及它們之間相 互滲和，而不明顯降低主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑的藥效。
[0081] 本發明的主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑或藥物組合物的施用方 式沒有特別限制，代表性的施用方式包括（但并不限于）；腸胃外給藥（如腹腔內注射劑、 靜脈注射劑等）。
[0082] 用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、 懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和 非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、己醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0083] 本發明主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑可W單獨給藥，或者與其他 藥學上可接受的藥物聯合給藥，例如免疫抑制劑。優選的免疫抑制劑包括不會影響本發明 主要組織相容性復合物基因或其蛋白的抑制劑的藥物，例如，環抱素、雷帕霉素、他克莫司、 霉酪酸醋、咪哇立賓、環磯醜胺。
[0084] 使用藥物組合物時，是將安全有效量的活性成分適用于需要治療的哺乳動物（如 人），其中施用時劑量為藥學上認為的有效給藥劑量，日給藥劑量通常為0. 1-lOmg/kg，優 選0. 3-3mg/kg。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，送些都是熟練醫 師技能范圍之內的。
[0085] 本發明的有益效果
[0086] 本發明通過特異性載體降低供體器官和組織的非匹配組織相容性抗原，降低組織 和器官移植導致免疫排斥反應；本發明提供的特異性載體降低供體器官和組織的非匹配的 主要組織相容性復合物，能抑制與免疫反應有關細胞燈細胞和B細胞等巨瞻細胞）的增殖 和功能，降低抗體免疫反應，可應用于器官移植抗排斥反應和自身免疫病等。
[0087] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，送些實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆；實驗室手冊（New York = Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[008引實施例1.克隆大鼠M肥-I基因的cDNA
[0089] MHC-I類抗原表達于所有有核細胞表面，MHC-I類分子限制性抗原的遞呈是激活 細胞毒性T淋己細胞（切totoxic Tlympho ^te，CT L)的前提，而CT L在機體抗瘤與抗 病毒免疫中起重要作用。
[0090] 1.引物設計合成
[00川根據M肥-I的CDNA序列，分別設計上下游引物，由金思特科技（南京）有限公司 合成。
[0092] 正向引物序列；5'-CCTGCTACCGTTCCTCACAG-3'（沈Q ID NO. :1)
[0093] 反向引物序列；5'-TACCTCTCCCAGTGGTCAGG-3'（沈Q ID NO. :2)
[0094] 2.總RNA的提取
[0095] SD大鼠（來自南京大學動物實驗中必）麻醉后摘取脾臟，W總RNA提取系統（購 自Q IAGen公司）提取IOOmg脾組織的總RNA。脾組織經細胞裂解液變性、碼磨及離必后， 將上清液轉移到特定的旋轉柱子中，加沖洗液離必沖洗3次，再W DEPC處理的雙蒸水收集 總RNA。W 0D260/0D280比值檢測純度（大于1. 8)。變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。
[0096] SD大鼠為大鼠（rat ;rattus norregicus)的一個品系，由美國斯潑累格?多雷 (Sprague Dawley)農場于1925年用Wistar大鼠培育而成，其毛色白化，廣泛用于藥理、毒 理、藥效及GLP實驗。
[0097] 3.反轉錄 PCR
[009引 W大鼠脾組織總RNA為模板，分別加入M肥-I基因的下游引物，采用反轉錄系統 (購自金思特科技（南京）有限公司）進行反轉錄，分別合成M肥-I CDNA第一鏈，反應體 積為20 U 1。取5~10 U 1逆轉錄產物為底物，加上游引物，用PCR試劑盒進行擴增，反應體 積為50111，引物濃度為50口11101/1。反應條件：941：1111111，581：1111111，721：1111111，35循環。 低溶點瓊脂糖凝膠電泳回收擴增片斷。
[0099] 4. cDNA克隆擴增
[0100] 回收反轉錄PCR產物，經E coR I和B amH I酶切后，與相應酶切的地V 220質粒 DNA連接，轉化感受態大腸桿菌DH 5曰，涂板培養。利用地V 220中LacZ基因插入失活顯色 反應，篩選出插入有MHC- I基因片斷的白色陽性菌落。挑取白色菌落，小量擴增。W堿裂 解法提取質粒，酶切鑒定。
[0101] 采用天根DP117-無內毒素質粒大提試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公 司）將M肥-I質粒進行去毒性處理，用于后續實驗研究。具體操作步驟參照天根DP117-無 內毒素質粒大提試劑盒的使用說明書。
[0102] 實施例2.構建利用SiRNA技術降低抗體移植排斥反應的特異性 anti-M肥-I -SiRNA
[0103] 利用SiRNA技術使供體受體不匹配的MHC- I等位基因表達降低，從而抗原抗體不 結合，不產生免疫應答反應。
[0104] 1.特異性anti-MHC- I -SiRNA的質粒構建
[0105] 針對M肥-I (在美國國立圖書館的GE肥BANK數據庫檢索的序列號為U47329)的 cDNA序列，選擇起始密碼下游912bp處CACGGTAATCATTGCTGTTCTGG(SEQ ID NO. :3)作為革己 序列。
[0106] SiRNA 的祀序列：CACGGTAATCATTGCTGTTCTGG(SEQ ID NO. :3)
[0107] anti-M肥-I -SiRNA 的序列：
[0108] 正義鏈：5'-CGGUAAUCAUUGCUGUUCUUU-3'（沈Q ID NO. : 4)
[0109] 反義鏈：3'-UU GCCAUUAGUAACGACAAGA-5'（沈Q ID NO. : 5)
[0110] 將上述構建的SiRNA的表達前體克隆到SiRNA雙元表達載體 pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP，構建出質粒；anti-M肥-I -siRNA。
[0111] 2.細胞
[0112] 無菌抽取移植腎器官的SD大鼠的抗凝外周血及正常SD大鼠的抗凝外周血，用淋 己細胞分離液在于超凈臺中分離出外周血淋己細胞，W PBS洗涂2次，W徹底去除淋己細 胞分離液，并用紅細胞裂解液裂解殘余的紅細胞，最后W RPMI-1640+15% FBS重懸，經流 式細胞儀測定>95%為B淋己細胞，將從來自移植腎器官的SD