大鼠體內分離出的細胞放在 37 °C，5 % C〇2條件下培養待用。
[0113] 3.轉染
[0114] 于轉染前比，吸出細胞，離必去除血清，用無血清的RPMI-1640進行重懸，然后鋪 12孔板，采用Iipofection 2000按說明書推薦方法進行轉染，轉染4化后收集細胞。
[0115] 4. RNA提取及CDNA合成
[0116] W TRIzol試劑按標準方法提取細胞的總RNA，然后W OligO dT引物和AMV反轉錄 酶反轉錄出cDNA，同時W目-actin作為內參。
[0117] 5. Real-time PCR 檢測 [011引 5.1注射方案
[0119] 大鼠均分成3組（每組5只）：
[0120] 第一組注射生理鹽水，作為陰性對照組；
[0121] 第二組注射anti-MHC- I -ShRNA載體，作為陽性對照組；
[0122] 第H組注射anti-MHC- I -SiRNA載體，作為實驗組。
[0123] 5. 2注射特異性anti-M肥-I -SiRNA后，anti-M肥-I -SiRNA在血清和組織器官 中的變化.
[0124] 分別W anti-M肥-I -SiRNA和目-actin的引物進行real-time PCR檢測。利用 real-time PCR分析注射后在不同時間點，anti-MHC- I -SiRNA在血清、肝臟、T細胞、肺組 織的表達水平，具體結果見圖1。
[01巧]退火溫度；53°C。
[0126] 目-actin引物如下所示：
[0127] ACT-Pl:5'-ctccatcctggcctcgctgt-3' (SEQ ID NO. :6)
[012引 ACT-Pl:5,-gctgtcaccttcaccgttcc-3，（SEQ ID NO. :7)
[0129] 退火溫度；52 °C，產物=268bp
[0130] 圖I顯不血清、肝臟、T細胞、肺組織中anti-MHC- I -siRNA的表達水平。從 圖1可W看出，anti-MHC- I -SiRNA的表達水平在肝臟中注射后1小時顯著上升，并 在隨后的24小時內逐漸回歸到正常水平。同一時間段內觀測血漿、T細胞和肺組織 內anti-MHC- I -SiRNA的變化，anti-MHC- I -SiRNA的表達水平在注射后1小時均 顯著上升，并在隨后的24小時內逐漸回歸到正常水平。結果表明，組織細胞直接從 血液中吸收了 anti-M肥-I -SiRNA載體，并導致了 anti-M肥-I -SiRNA含量上升。 anti-MHC- I -SiRNA的含量水平在肝臟和血漿中都有所提高，有力證明了肝臟從膽管中吸 收了 anti-MHC- I -SiRNA載體后，產生了包含anti-MHC- I -SiRNA的微泡，然后通過血 液循環系統傳遞給祀組織或祀細胞。T細胞中anti-MHC- I -SiRNA水平的顯著提升，暗示 了肝臟在體內高效產生和傳遞miRNAs/siRNAs的能力。與體外傳遞系統相比，體內活體器 官作為傳遞系統會帶來更多益處。首先，不再新需要大量的細胞培養，取而代之的是產生 SiRNAs的活體器官。其次，SiRNAs的載體由內源細胞分泌，取代了復雜的外源載體成分， 可W有效避免免疫反應帶來的問題。再次，SiRNAs傳遞效率更高，因為在T細胞中也發現 anti-M肥-I -SiRNA水平的上升。
[0131] 5. 3注射anti-M肥-I -SiRNA后，M肥-I在血清和組織器官中的變化
[013引利用real-time PCR分析注射1小時后，M肥-I在血清、肝臟、T細胞、肺組織的表 達水平，具體結果如圖2所述。
[0133] 從圖2可W看出，與對照組注射anti-MHC- I -SiRNA (陽性對照組）和陰性對照 組（注射生理鹽水）相比，實驗組（注射anti-MHC- I -SiRNA載體）的MHC的表達水平顯 著降低，從而說明anti-MHC- I -SiRNA可抑制MHC- I的mRNA表達水平。
[0134] 實施例3.移植術后大鼠注射特異性anti-MHC- I -SiRNA的免疫排斥監測
[0135] 1.特異性anti-M肥-I -SiRNA對腎臟移植大鼠 anti-M肥-I -SiRNA的影響：
[0136] 注射方案同實施例2中的5.1節。采用補體介導的細胞毒試驗檢測實驗組（注 射anti-MHC- I -SiRNA)和對照組大鼠（注射生理鹽水）血清、肝臟、T細胞、肺組織中 anti-MHC- I -SiRNA 的表達水平。
[0137] 具體結果如圖3所示。
[0138] 圖3顯示移植術后大鼠注射特異性anti-MHC- I -SiRNA,血清、肝臟、T細胞、肺組 織中anti-MHC- I -SiRNA的表達水平。從圖3可W看出，anti-MHC- I -SiRNA的表達水 平在肝臟中注射后1小時顯著上升，并在隨后的24小時內逐漸回歸到正常水平。同一時間 段內觀測血漿、T細胞和肺組織內anti-MHC- I -SiRNA的變化，anti-MHC- I -SiRNA的表 達水平在注射后1小時均顯著上升，并在隨后的24小時內逐漸回歸到正常水平。
[0139] 結果表明，移植術后大鼠注射特異性anti-MHC- I -SiRNA,組織細胞直接從 血液中吸收了 anti-M肥-I -SiRNA載體，并導致了 anti-M肥-I -SiRNA含量上升。 anti-Mffi：- I -SiRNA的含量水平在肝臟和血漿中都有所提高，有力證明了移植術后大鼠 注射特異性anti-MHC- I -SiRNA,肝臟從膽管中吸收了 anti-MHC- I -SiRNA載體后， 產生了包含anti-Mffi：- I -SiRNA的微泡，然后通過血液循環系統傳遞給祀組織或祀細 胞。T細胞中anti-MHC- I -SiRNA水平的顯著提升，暗示了移植術后大鼠注射特異性 anti-MHC- I -SiRNA,肝臟在體內高效產生和傳遞miRNAs/siRNAs的能力。
[0140] 2.特異性anti-MHC- I -SiRNA對腎臟移植大鼠MHC- I抗體的影響：
[01川利用real-time PCR分析注射特異性anti-M肥-I -SiRNA載體I小時后，移植術 后大鼠的血IC- I在血清、肝臟、T細胞、肺組織的表達水平。具體結果如圖4所述。從圖4 可W看出，與對照組利用注射anti-MHC- I -SiRNA(陽性對照組）和陰性對照組（注射生理 鹽水）相比，實驗組（注射anti-MHC- I -SiRNA載體）的MHC- I的表達水平顯著降低，從 而說明anti-MHC- I -SiRNA可抑制MHC- I的mRNA表達水平。采用補體介導的細胞毒試驗 檢測實驗組（注射anti-MHC- I -SiRNA)和對照組大鼠（注射生理鹽水）血清中MHC- I 抗體。
[0142] 具體操作步驟包括；使用標準的血IC- I分型抗體與受者的淋己細胞混合，加入補 體，抗體與MHC- I抗原特異結合后激活補體，使淋己細胞膜受損或裂解，然后用染料（臺酪 藍或伊紅）染色，通過在顯微鏡下計數死亡淋己細胞的百分比判定結果。
[0143] 死亡細胞死亡百分率高為陽性，說明待檢淋己細胞的MHC- I型與MHC- I標準分 型抗體一致；陰性時，說明待檢淋己細胞的MHC- I型與MHC- I標準分型抗體不一致。
[0144] 注射anti-MHC- I -SiRNA后，移植術后實驗組大鼠死亡細胞百分率低，為陰性，說 明移植術后實驗組大鼠淋己細胞的MHC- I型與MHC- I標準分型抗體不一致，抑制了移植 大鼠的免疫排斥反應。
[0145] 3.特異性anti-MHC- I -SiRNA對腎臟移植大鼠群體反應性抗體的影響
[0146] 群體反應性抗體（panel reactive antibodies, PRA)是指群體反應性抗MHC-IgG 抗體，是各種組織器官移植術前篩選致敏受者的重要指標，與移植排斥反應和存活率密切 相關。
[0147] 利用ELISA-PRA方法檢測PRA，具體操作步驟包括；酶標板用純化的包括大鼠絕大 部分的血IC- I特異性抗原預先包被，檢測時將待檢血清加入并賠育一定時間后，加入酶標 記的抗體IgG或IgM的大鼠 M肥基因或其蛋白的抑制劑，再加入酶作用的底物顯色，根據顏 色的深淺，可測定出MHC- I抗體的特異性和滴度。
[0148] 注射特異性anti-MHC- I -SiRNA的移植術大鼠，群體反應性抗體PRA的 致敏性< 30%，比對照組的高致敏性> 30 %低，說明實驗組群體反應性抗體降低， anti-MHC- I -SiRNA抑制了移植大鼠的免疫排斥反應。
[0149] 4.特異性anti-MHC- I -SiRNA對腎臟移植大鼠外周血T細胞的影響
[0150] 利用流式細胞儀測定外周血T細胞。采用流式細胞術H色絕對計數法（ProCOUNT 法），具體操作包括；在定量的被測標本中加入英光素標記的抗CD34、CD45MM：基因或其蛋 白的抑制劑和核酸染料及已知數量的英光微球，經英光染色后溶解紅細胞，在流式細胞儀 上經488nm波長激光激發，檢測CD45+CD34+和含核酸量多的細胞，計為造血干祖細胞。
[0151] 正常外周血中造血干/祖細胞數量極少，每微升血液中僅有0. 320-3. 50個。
[0152] 流式細胞儀測定結果可W看出，注射anti-MHC