與ice1結合并調節cbf表達和擬南芥的耐凍性的制作方法

專利名稱：與ice1結合并調節cbf表達和擬南芥的耐凍性的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質，該蛋白的突變體以及編碼所述蛋白質的核酸，這種蛋白質可以與Ice1相互作用并能夠激活CBF3啟動子活性進而調節植物的耐凍性。
背景技術：
不利的低溫條件能夠影響目前幾乎所有生物的存活和分布。無柄植物已經進化到可以對不利的低溫條件進行感知和對抗，這些植物對不利的低溫的反應可以表現在生理，分子和生化水平上。許多溫帶的植物具有通過提前放置于一個非冷凍的低溫下來提高其耐凍性的潛能，這就是被稱為冷適應的過程(Guy 1990；Hughes and Dunn 1996；Browse and Xin 2001)。
分子水平上，一組特異性的蛋白質被誘導對低溫進行響應，從而幫助植物在低溫下維持生存。而且已經發現，在對低溫的響應時，基因表達會有所變化，這種變化在植物對急劇冷卻的耐性(Gong et al.2002；Hsieh et al.2002)和適冷性(Thomashow 1999；Knight et al.1999；Tahtiharju and Palva 2001)是十分重要的。能夠在適冷過程中被誘導的蛋白質包括呼吸作用和糖類、脂類、類苯丙醇和抗氧化物代謝過程中的酶，分子伴侶，抗凍蛋白質，以及許多其他的被認為對冷凍引起的脫水有抗性作用的蛋白質(Thomashow 1999；Guy1990；Mohapatra et al 1989)。這些基因及其基因產物被命名為CAPs(冷適應蛋白質)/CORs(冷響應)/LTIs(低溫誘導)。
許多這些基因的啟動子含有DRE/CRT(脫水應答元件/C-重復序列)區域，這種順式應答元件對于由冷壓力條件下的基因表達是必需的和充分的(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 1994；Stockinger et al 1997)。一小組同源轉錄因子(CBF/DREB)可以和這個序列結合進而激活冷調節基因的表達(Stockinger et al 1997；Liu et al 1998)。最近本發明的發明人鑒定了一種上游因子，其可以和CBF3啟動子的Myc相似序列結合，并且是擬南芥CBF3表達和耐凍性的一個重要決定因素(Chinnusamy et al 2003)。除了CBF3啟動子中Myc相似序列外，還有許多推測與Myb相似的序列(Shinwari et al 1998)。MYC相關的bHLH轉錄因子激活靶基因需要MYB作為共轉錄因子和(或)包含WD重復序列的因子(Spelt et al.2000；Walker et al.1999)。
Chinnusamy等人(2003)認為可能存在一種與Myb相似的轉錄因子通過與ICE1結合并引起CBF基因的冷激活表達。重要的是，微陣列分析結果顯示，在冷壓力下，Ice1突變體植物中的Snow1(參考本發明要求優先權的美國專利U.S.60/508,316中的AtMyb15，在此結合其整體作為參考)的表達水平要比野生植物的Snow1的表達水平要高(Chinnusamy et al 2003)。這表明在Ice1功能缺失的情況下，Snow1的表達水平會有所提高以彌補缺失的Ice1功能。
由于許多環境因素，例如寒冷，限制許多植物品種的地理分布和生長季節，而且通常會很不利地影響谷物生長的質量和產量，因此提高植物特別是那些作為有用農業作物的植物的耐冷性或者適冷性是非常必要的。
發明的簡單描述本發明的一個目的在于提供提高植物耐冷性或者適冷性(以下簡稱適冷性)的方法和組合物。
本發明的另一個目的在于提供轉基因植物和植物細胞，其具有提高的適冷性。
本發明這些和其他目的可以通過一種提高植物適冷性的方法達到，這種方法包括在植物內過量表達Snow1基因。
本發明的目的也可以通過一種提高植物細胞適冷性的方法達到，這種方法包括在植物細胞內過量表達Snow1基因。
本發明的目的也可以通過用編碼Snow1的核酸轉化植物或者植物細胞來達到。
因此，本發明還提供了一種通過用編碼Snow1的核酸轉化植物或者植物細胞以得到上述植物或者植物細胞的方法。
本發明還提供了一種分離純化的具有SEQ ID NO2氨基酸序列的Snow1。
本發明同時還提供了一種得到上述Snow1的方法，這種方法包括在Snow1表達的條件下，培養已經用編碼Snow1的核酸轉化的寄主細胞，以及分離Snow1。
在另一個具體實施例中，本發明提供了一種分離純化的具有Snow1轉錄激活因子活性的酶，這種酶的氨基酸序列與SEQ ID NO2序列有從70％到小于100％的同源性。
本發明同時還提供了一種得到上述酶的方法，這種方法包括在該酶表達的條件下，培養已經用表達該酶的核酸轉化的寄主細胞，以及分離該酶。
本發明還提供了一種提高植物適冷性的方法，其包括在植物內表達一種Snow1轉錄激活因子。
本發明還提供了一種提高植物的適冷性的方法，通過提高一種或者更多轉錄因子的表達，該轉錄因子選自CBF轉錄因子和DREB轉錄因子，和/或通過提高一種或者更多冷響應基因的表達。
本發明進一步還提供了一類前面所述的細胞和方法，其中Ice1基因與Snow1共表達以補充所獲得的增強的適冷性。
在這里，本發明的發明人評價了Snow1改變CBF3表達水平的能力。微矩陣方法和RNA印跡方法分析確認了Snow1在Ice1顯型細胞中會有所提高。Snow1是組成型，廣泛表達以及核定位。通過酵母雙雜交和蛋白質拖拉實驗確定了Snow1可以與Ice1物理結合。Snow1蛋白質能夠與CBF3啟動子的Myb相似識別序列結合，并且它的瞬時表達可以提高CBF3控制的熒光素酶的活性，這就顯示了其在適冷性和耐冷性中的作用。在冷壓力的條件下，過表達Snow1的轉基因植物(CBF-luc)可以表現出增強的熒光素酶活性。這些結果說明Snow1是CBF3表達的激活因子。
以上的目的只是描述本發明一些重要的方面，其他的目的、觀點和實施例會在后面的詳細描述中進行描述。附圖的簡要說明對本發明及其優點更完整的評價，以及更好的理解，可以通過結合后面的詳細描述參考下面的附圖獲得。


圖1Snow1在植物中組成型和廣泛地表達。(A)Snow1在野生型(CBF3-luc)和Ice1植物中正常和冷壓力的狀態下的轉錄。微管蛋白作為加載對照(B)。Snow1在擬南芥植物的不同組織中的轉錄。反轉錄2μg總RNA并用Snow1的基因特異性引物進行PCR，并以微管蛋白作為對照。(C)Gus蛋白質在擬南芥秧苗不同組織中的組織化學定位。
圖2Snow1與Ice1特異地相互作用。(A)用來研究雙雜交相互作用的誘餌和獵物的不同組合。(B)做為誘餌的Ice1不同區域，用來描繪Ice1與Snow1相互作用的結構域。這些區域會在A-F有所描述的。圖中所框起來的區域代表Ice1蛋白質的bHLH區域。(C)所述Ice1描述的區域與Snow1誘餌之間的相互作用。(D)用GST標記蛋白質進行的體外拖拉實驗。使用的組合物顯示在圖片頂部，分子量標記在左邊顯示。左面的圖片表示用考馬斯蘭染色的純化的帶有GST標簽的蛋白質，右面圖片表示的是自顯影結果。(E)用S標記的蛋白質進行的體外拖拉實驗。使用的組合物顯示在圖片頂部，分子量標記在左邊顯示。(F)Ice1與Snow1在體內的相互作用。用Myc-Ice1和HA-Snow1轉化擬南芥的原生質體。Myc標記的Ice1用抗c-Myc的抗體進行免疫沉淀。蛋白質在SDS-PAGE上進行溶解并轉到硝酸纖維素膜上，并用帶有抗HA的抗體的探針來檢測這張膜。圖片的左邊說明的是蛋白質分子量標記。
圖3Snow1蛋白質與CBF啟動子的不同部分結合。(A)Snow1蛋白質與CBF1啟動子部分的相互作用。(B)Snow1蛋白質與CBF2啟動子部分的相互作用。(C)Snow1蛋白質與CBF3啟動子部分的相互作用。各圖片的上方說明的是所用的不同片斷。
圖4Snow1是一種核定位的轉錄激活因子，Snow1的過量表達可以提高CBF3的表達。(A)GFP-Snow1蛋白質在核內的定位。圖片顯示的是GFP-Snow1在轉基因植物根部中共軛聚焦顯微鏡下觀察的圖片。(B)用CBF3-LUC和35S-Snow1和/或35S-Ice1轉化后，熒光素酶的相對活性。來自ReLLina的熒光素酶的基因作為內部對照，使每次轉化后獲得的數值標準化。熒光素酶的活性是以相對于Renilla熒光素酶活性的任意單位來表達的(如Ohta等2001所述)。
圖5(A)野生型與Snow1過表達植物株(7號)的秧苗和熒光的圖片。這是在冷處理12小時后的圖片。(B)野生型與Snow1過表達植株(第4，7和15號)在冷壓力下熒光強度的定量分析。
圖6Snow1過表達的第7號和第10號中Snow1和CBF3的穩定轉錄水平。圖片的右邊說明的是所用到的植物株，上方說明的是冷處理(0℃)的時間。以肌動蛋白作為內源對照。
圖7Snow1 T-DNA植株的分析。(A)說明Snow1基因中T-DNA所插入突變。(B)通過對純合(28號)和雜合(30號)T-DNA植物株進行RT-PCR來確認基因敲除。以野生型和微管蛋白作為內部對照。(C)野生型(WT)和純合T-DNA植物株(28號)中冷壓力的條件下CBF基因的水平。
圖8在Snow1純合過表達和T-DNA植株中的離子泄漏。檢測了已適應的植物合沒有適應的植物在冷壓力下的電導率。(A)Snow1過表達植株的電導率。(B)Snow1 T-DNA植株的電導率。
發明的詳細描述除非有特殊解釋，這里所用到的科技術語和酶學、生化、細胞生物學、分子生物學、植物生物學和藥學領域中的熟練的研究人員通常理解的意義相同。
所有與本發明所描述相似或者相當的方法和材料都可以應用于本發明的實踐和測試中。這里所提到的所有出版物，專利申請，專利以及其他參考文獻是在此引入整體作為參考。如果有沖突的地方，本說明書包括定義將會控制。進一步，材料、方法和實施例只是用于作為示范而不是限制，除非有特殊說明。
冷壓力能夠誘導表達許多由一系列冷誘導表達轉錄因子所依次調控的基因。CBF類轉錄因子包含許多重要的谷物冷響應決定因子。最近，本發明人報道了CBF基因是由另一種上游轉錄因子Ice1調控的。Ice1與CBF3啟動子的MYC相似識別序列結合。除了MYC相似識別序列外，CBF3啟動子還有MYB相似識別序列結合。Chinnusammy等人(2003)認為存在另外一種可以和MYB相似識別序列結合并調節CBF3表達的轉錄因子。本發明的發明人掃描了微陣列數據(Chinnusamy et al 2003)，發現Ice1突變體在冷壓力下，一種MYB轉錄因子會有較高的轉錄水平。考慮到一種基因功能的缺失會通過提高另一種基因的表達來補償，因此本發明的發明人研究了Snow1在調節CBF3表達中的功能。
RNA印跡分析結果顯示Snow1可以被冷壓力輕微誘導，這說明Snow1可能有對冷壓力的對抗作用。RNA印跡分析結果與微矩陣分析的結果相一致，其結果顯示Ice1突變株在低溫壓力下Snow1的表達水平會有所提高。Snow1表達的增強可能是為了補償Ice1功能的缺失。Snow1是在植物所有組織中普遍表達的核定位蛋白質。凝膠滯留實驗顯示Snow1可以和CBF3的啟動子結合，并需要CBF3啟動子的myb相似識別序列。Snow1與CBF3啟動子的結合說明了Snow1可以調控CBF3啟動子的表達。
Snow1可以和Ice1有物理的相互作用。酵母雙雜交分析顯示Snow1可以和Ice1的C端(266-499位氨基酸)相互作用。Snow1和ICE1相互作用的區域也被限定在了Ice1的358-494段氨基酸序列。并且蛋白質拖拉實驗顯示Snow1和Ice1可以相互作用。一種關系較遠的MYB轉錄因子(Myb79)不能夠與Ice1結合，這說明Snow1和Ice1的結合是特異的。在轉錄因子中的連續相互作用已經在調節下游基因中顯示出了重要的作用(Walker等1999，Spelt等2000，Grotewold等2000)。瞬時轉化實驗結果顯示，Snow1的過量表達可以提高CBF3啟動子控制的熒光素酶的表達。當Ice1與Snow1共同轉化時，熒光素酶活性的變化不大。這說明，在體內Ice1和Snow1是獨立激活CBF3的表達的，并且它們的相互作用并不能對CBF3有更強的激活。有可能是在冷壓力持續期間的初始，分散了被這兩個轉錄因子引導的CBF3的表達。與野生型植物相比，在CaMV35S啟動子控制下穩定表達Snow1的轉基因植物(CBF3-luc遺傳背景)可以在冷壓力下表現出增強的熒光。所有這些結果都說明Snow1是CBF3表達的轉錄激活因子。
相應地，本發明將在下面的描述和進一步解釋以及舉例中具體描述。
術語“植物”包括整個植物，植物組織(例如葉，干，根等)，種子，和植物細胞以及它們的子代。能夠在本發明的方法中使用的植物種類通常與能夠應用轉化技術的高等植物的類別一樣寬廣，包括單子葉植物，雙子葉植物。優選植物包括稻子，玉米，小麥，棉花，花生和大豆。
術語“植物”包括整個植物，植物組織(例如葉，干，根等)，種子，和植物細胞以及它們的子代。能夠在本發明的方法中使用的植物種類通常與能夠應用轉化技術的高等植物的種類一樣寬廣，包括單子葉植物，雙子葉植物。優選植物包括稻子，玉米，小麥，棉花，花生和大豆。
因此，在本發明的一項具體實施例中，可以通過提高植物中蛋白質的數量，尤其是植物中Snow1基因的增強，來提高或者增強抗冷性。
因此，在本發明的一項具體實施例是一種攜帶本發明中所述多聚核苷酸的植物細胞，優選攜帶本發明分離的多聚核苷酸的轉基因植物。
在這里所使用的術語“增強”是指提高植物細胞或者植物相應的DNA編碼的一種酶或者多種酶細胞內的活性。增強作用可以通過對細菌細胞的多種操作來輔助達到。為了實現增強，特別是過表達，可以提高相應基因的拷貝數，使用強啟動子，或者位于結構基因上游的啟動子和調節區域或者酶結合位點進行突變。定位于結構基因上游的表達框也可以通過同樣的方法起作用。另外，還可以使用可誘導啟動子來提高表達。也可以使用一種編碼具有較高活性的酶的基因。還可以通過延長RNA的生命周期來提高表達。進一步，抑制酶的簡并可以整體上提高酶的活性。而且這些檢測可以與任何希望的方法相結合。這些或其他的改變植物基因活性的方法是已經描述過的，例如在Plant Molecular Biology，Maliga et al，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)。
在這里所使用的“表達框”包括一種在植物中發揮功能的啟動子，連接于一段編碼SEQ ID NO2序列的Snow1蛋白的核酸(例如具有SEQID NO1序列的多聚核苷酸)，其中蛋白質在植物細胞內的增強的表達可以提高所述植物的抗凍性。在一個本發明的一個優選的實施例中，所述啟動子可以從下列啟動子中選擇一種病毒包被蛋白質啟動子，一種組織特異性啟動子，一種單子葉植物啟動子，一種泛素啟動子，一種壓力誘導啟動子，一種CaMV 35S啟動子，一種CaMV 19S啟動子，一種肌動蛋白啟動子，一種cab啟動子，一種蔗糖合成酶啟動子，一種微管蛋白啟動子，一種napin R基因復合體啟動子，一種番茄E8啟動子，一種patatin啟動子，一種甘露堿合成酶啟動子，一種大豆種子球蛋白蛋白質啟動子，一種大豆植物儲存蛋白質啟動子，一種細菌噬菌體SP6啟動子，一種細菌噬菌體T3啟動子，一種細菌噬菌體T7啟動子，一種Ptac啟動子，一種根部細胞啟動子，一種ABA誘導啟動子，一種膨脹誘導啟動子。進一步，在本發明表達框的另一個實施例中，是用于Snow1，但更適合包含一種具有編碼SEQ ID NO4序列的Ice1基因的核酸(例如具有SEQ ID NO3序列的多聚核苷酸)，其中植物細胞中蛋白質的增強表達說明了所述植物細胞增強的抗凍性。然而，在另一個本發明表達框的實施例中，表達框可以既包含編碼Snow1的多聚核苷酸也包含編碼Ice1的多聚核苷酸序列(這些多聚核苷酸以及它們的突變體將在后面描述)，在同一個啟動子或者一個可以選擇的可誘導型啟動子的控制下，連接到同一個或者不同的質粒或者載體上。這里所述的術語“選擇性誘導啟動子”是指當兩個或多個啟動子出現在同一個質粒或者載體上，或者當這些啟動子在不同的質粒或者載體上，但是這些質粒或者載體包含在相同的寄主細胞、植物細胞或者轉基因植物時，這些啟動子能夠與寄主兼容(被寄主細胞、植物細胞或者轉基因植物所穩定地支持)并可以被分別激活或者增強轉錄(例如，在一個啟動子是通過加入IPTG，另一個是通過提高溫度)。
也可以被應用一種編碼具有相應或者突變的高活性的酶(例如Snow1和/或Ice1)的基因。優選的是相應的酶具有比酶的原始形式更高活性，更優選的是具有比原始狀態高至少5，10，25％或者50％的更多活性，最優選的是能夠比原始狀態酶的活性高兩倍以上。
在本發明中，如果一種多聚核酸序列至少70％的堿基組成和堿基序列相應于本發明，就被稱為“同源的”，優選至少80％，更優選至少90％，最優選至少95％的堿基組成和堿基序列相應于本發明的序列。根據本發明，“同源蛋白質”可以被理解為包括蛋白質，該蛋白質含有至少70％氨基酸序列相應于本發明的氨基酸序列，或者該蛋白質由前面所述的多聚核苷酸序列編碼，優選至少80％，更優選至少90％，最優選95％，其中相應被理解為是指相應的氨基酸相同的或者互補的同源氨基酸。如這里所描述的，本發明的序列相應于SEQ ID NO1(多聚核苷酸序列Snow1)，SEQ ID NO2(氨基酸序列Snow1)，SEQ ID NO3(多聚核苷酸序列Ice1)，SEQ ID NO4(氨基酸序列Ice1)。“同源氨基酸”的表述是指那些具有相應性能，特別地涉及它們的電荷，疏水特性，空間排列性質等。這樣，蛋白質序列可以從70％最高到小于100％同源于SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4。
同源性，氨基酸或核苷酸序列的序列的相似性或相同性，通常可以用已知的軟件或者電腦程序來分析，例如BestFit或者Gap配對比對軟件(GCGWisconsin Package，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin 53711)。Bestfit是利用Smith和Waterman在發表在Advances inAppliedMatematics 2482-489(1981)的局部同源性運算法則，來發現兩條序列間相同性或相似性的最好片段。Gap是進行整體比對利用Needleman和Wunsch發表在J.Mol.Biol.48443-453(1970)的方法，每一序列與所有另一相似序列對比。在利用一種例如Bestfit的序列比對軟件來進行檢測序列同源性，相似性或相同性的程度時候，需要使用默認設置，或者選擇適當的評估標準以優化相同性，相似性或同源性的數值。同樣，當應用Bestfit的序列比對軟件來檢測兩條不同氨基酸序列的序列相同性、相似性或同源性時，需要使用默認設置，或者選擇適當的評估標準，例如blosum45或者blosum80以優化相同性，相似性，或同源性的數值。
本發明也涉及多聚核苷酸，其包含相應于SEQ ID NO1序列的多聚核苷酸的全部基因或者其片斷，其獲得可以通過利用包含所述相應于SEQ IDNO1序列的多聚核苷酸或者其片斷的探針與相應的基因庫進行雜交，進行篩選，然后分離所述的DNA序列。
本發明的多聚核苷酸序列可以適合作為RNA，cDNA，DNA的雜交探針以分離這些與Snow1基因有高度相似性的cDNA或者基因，尤其是SEQ IDNO1序列的Snow1基因。
本發明的多聚核苷酸序列還可以適合作為聚合酶鏈式反應(PCR)的引物以獲得編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的酶的DNA。
這些作為探針或引物的寡聚核苷酸序列包含多于30個，優選最多30個，更優選最多20個，最優選至少15個連續的核苷酸。具有至少40或者50個核苷酸的寡聚核苷酸也是適用的。
術語“分離”的意思是指從其自然環境中分離出來。可以認為本發明中“分離”的多聚核苷酸或者多肽可以進一步是實質上純化的或純化的(也就是說多聚核苷酸和多肽被純化)。這里所使用的“實質上純化的”意味著多聚核苷酸和多肽從自然環境中分離出后，達到了只含有很少的雜質的水平(例如得到的多聚核苷酸和多肽產物至少70％，優選至少80％，更優選至少90％，最優選至少95％是純化的)。這里所說的術語“純化”是指多聚核苷酸和多肽不含有污染物(例如100％純化)。
術語“多聚核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，可以表示未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。
術語“多肽”一般認為是指肽或者蛋白質，其包含通過肽鍵連接的兩個或更多的氨基酸。
本發明的多肽包括相應于SEQ ID NO2序列的多肽，特別是具有Snow1轉錄激活因子生物活性的多肽，還包括那些至少70％，優選至少80％，更優選至少90％，最優選至少95％與相應于SEQ ID NO2序列的多肽同源的多肽，并且具有所述活性。因此，這些多肽與SEQ ID NO2序列有從70％到最多100％的同源性。
本發明還涉及編碼DNA序列，其由SEQ ID NO1通過遺傳密碼子的簡并而來。用同樣的方式，本發明進一步涉及與SEQ ID NO1或者部分SEQ IDNO1序列雜交的DNA序列。而且本領域技術人員還知道保守氨基酸替換，例如在蛋白質中用丙氨酸替換甘氨酸或者谷氨酸替換天冬氨酸作為“同義突變”，其不會引起蛋白質活性的任何基本變化，例如功能中性的。同時知道蛋白質N端和/或C端的變化不會實質性破壞其功能，甚至可能使其功能更穩定。
用同樣的方式，本發明進一步還涉及與SEQ ID NO1或者部分SEQ IDNO1序列雜交的DNA序列。本發明還涉及利用得自SEQ ID NO1序列的引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)得到的DNA序列。如前所述，這種形式的寡聚核苷酸通常至少有15個核苷酸的長度。
術語“嚴格條件”或者”嚴格雜交條件”包括這樣的條件，在該條件下多聚核苷酸可以和靶基因結合，并達到了比其他序列高得多的可檢測水平(例如，比背景至少要高2倍)。嚴格條件是依賴于序列的，并且根據不同的環境會不同。通過控制雜交和/或者清洗條件的嚴格性，與探針(同源探針)100％互補的靶序列可以被識別出來。替代地，通過調節嚴格條件以允許序列中出現某些誤配，這樣可以檢測到更低程度的相似性(異源探針)。
通常，嚴格條件為鹽濃度為低于大約1.5M鈉離子濃度，一般為0.01-1.0M鈉離子濃度(或者其他的鹽)，pH值為7.0-8.3，對于短探針(例如10-50個核苷酸)溫度為至少大約30℃，對于長探針(例如50個以上核苷酸)溫度大約至少為60℃。嚴格條件還可以通過添加例如甲酰胺的去穩定劑而獲得。示例的低嚴格條件包括在30～50％的甲酰胺緩沖液，1M NaCl，1％SDS(十二烷基磺酸鈉)，37℃的條件下進行雜交，接下來在1X～2X的SSC溶液(20X的SSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸鈉)中在50-55℃下清洗。示例的中等嚴格條件包括在40～45％的甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基磺酸鈉)37℃條件下進行雜交，接下來在0.5X到1X的SSC溶液中在55℃到60℃下清洗。典型的高嚴格條件包括在50％的甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基磺酸鈉)，37℃條件下進行雜交，接下來在0.1X的SSC溶液中在60℃到65℃下清洗。
特點在于雜交后清洗的功能，其非常重要的因素是離子強度和最終清洗溶液的溫度。對于DNA-DNA雜交，Tm值可以通過Meinkoth和Wahl在Anal.Biochem.，138267-284(1984)上提供的公式Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L來估計，其中，M代表單價陽離子的摩爾濃度，％GC代表鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form代表雜交溶液中甲酰胺的百分比，L代表堿基對的雜交長度。Tm是指50％的互補靶序列與完全匹配的探針雜交(在一定離子強度和pH下)時的溫度。每當有1％的錯配，Tm就降低1℃；因此，可以調節Tm值，雜交和/或清洗條件從而和具有所希望相同性的序列進行雜交。例如，如果要找到大約90％相同性的序列，Tm值可以降低10℃。通常，對于特異性序列與它的互補鏈，在特定離子強度和pH值下，嚴格條件會選擇比熱熔點(Tm)低5℃。然而，苛刻的嚴格條件會在比熱熔點(Tm)低1，2，3，或4℃條件下雜交或者清洗；中等的壓力條件會在比熱熔點(Tm)低6，7，8，9或10℃雜交或者清洗；低的嚴格條件會在比熱熔點(Tm)低11，12，13，14，15或者20℃條件下雜交或者清洗。使用這個方程式，雜交和清洗組合物，以及希望的Tm值，本領域技術人員將了解雜交和/或清洗溶液的嚴格性的變化是固有描述的。如果誤配的程度導致Tm值低于45℃(水溶液)或者低于32℃(甲酰胺溶液)，優選提高SSC的濃度從而可以使用較高的溫度。核酸雜交的詳細指南在分子生物學現行草案(Current Protocols in Molecular Biology)第二章，Ausubel等，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(2000)中可以找到。
因此，根據前面所述信息，本領域技術人員可以鑒定和分離與本發明多聚核苷酸實質上相似的多聚核苷酸。在分離這樣的多聚核苷酸時，該多聚核苷酸也可以象本發明的多聚核苷酸一樣，例如應用于提高植物的抗凍性。
本發明的一個實施例就是篩選多聚核苷酸的方法，其與本發明的多聚核苷酸具有實質的同源性，優選那些編碼擁有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸。
本發明的多聚核苷酸序列可以被一種或者多種在植物學或類似領域中已知的質粒或載體攜帶。如前所述，多聚核苷酸序列(SEQ ID NO1和SEQ IDNO3)被相同或者不同的質粒或者載體攜帶也仍然在本發明的范圍內。在本發明的一個實施例中，這些多聚核苷酸可以在相同(或者不同)質粒或者載體上連接到單一啟動子、相同類型的不同種啟動子或者選擇誘導型啟動子上。
在一個實施例中，可以通過用于細胞類型的適合載體攜帶多聚核苷酸在細菌或者真菌中進行擴增，這是有利的。在這些細胞類型中擴增多聚核苷酸和獲得蛋白質的常用方法在現有技術中已知并描述過，例如Maniatis等，分子克隆(Molecular Cloning)A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1982)以及Sambrook等，分子克隆(MolecularCloning)A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)。
在另一個優選的實施例中，多聚核苷酸包括SEQ ID NO1序列，與SEQID NO1互補的多聚核苷酸，與SEQ ID NO序列至少70％、80％、90％或95％相同的多聚核苷酸；或者在嚴格條件下與SEQ ID NO1序列雜交那些序列，嚴格條件下包括在5X的SSC和溫度50℃-68℃下清洗。因此，該多聚核苷酸可以與序列SEQ ID NO1有從70％最多到小于100％的相同。
在本發明的一個實施例中，本發明的多聚核苷酸(例如如上所述，SEQID NO1，及其變體，編碼SEQ ID NO2序列的多聚核苷酸，或其變體)會包含在一種質粒或者載體上，無論與Ice1相關的多聚核苷酸(例如如上所述，SEQ ID NO3及其變體，編碼SEQ ID NO4的多聚核苷酸，或者其變體)是否存在。
在本發明的另一個實施例中，本發明質粒或載體包含在寄主細胞、植物細胞或者轉基因植物中。優選的，植物是擬南芥或者選自小麥，玉米，花生，棉花，燕麥，大豆植物。在一個優選的實施例中，多聚核苷酸(如上所述，編碼Snow1和/或Ice1)連接于一種啟動子，優選的，一種可誘導啟動子。如前所述，多聚核苷酸可以在相同(或不同)質粒或者載體上，連接于單一啟動子，同種類型的不同啟動子，或者選擇性誘導啟動子。
在本發明的另一個優選的實施例中，本發明提供了一種方法，用于篩選編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白的多聚核苷酸，包括將本發明的多聚核苷酸與要篩選的多聚核苷酸雜交；表達多聚核苷酸，獲得蛋白質；檢測蛋白質中是否具有Snow1轉錄激活因子活性。
在本發明的另一個優選的實施例中，本發明提供了一種方法，用于檢測與核苷酸SEQ ID NO1有至少70％同源性的核酸，與SEQ ID NO1互補和/或編碼SEQ ID NO2中氨基酸序列的蛋白質的序列，包括將一種核酸樣品與探針或者引物接觸，該探針或者引物包含SEQ ID NO1核苷酸序列的至少15個連續核苷酸或者其互補序列的至少15個連續核苷酸。
在本發明的另一個優選的實施例中，本發明提供了一種方法，用于制備與本發明的多聚核苷酸有至少70％同源性的核酸，包括將核酸樣品與引物接觸，該引物包含SEQ ID NO1核苷酸序列的至少15個連續核苷酸或者其互補序列的至少15個連續核苷酸。
在本發明的另一個優選的實施例中，本發明提供一種制備Snow1蛋白質的方法，包括在適合Snow1表達的條件下，培養攜帶本發明多聚核苷酸的寄主細胞一段時間，然后收集Snow1蛋白質。
在本發明的另一個優選的實施例中，本發明提供一種制備一種轉基因植物的方法，包括將本發明的多聚核苷酸導入植物中。
在本發明的另一個優選的實施例中，本發明提供一種提高植物所需適冷性的方法，包括將本發明的多聚核苷酸(包括單獨用于Snow1在此限定的多聚核苷酸或者在用于Ice1在此限定的多聚核苷酸存在的情況下)導入所述的植物中。
根據本發明的用于轉化植物和植物細胞的方法，載體和成分對于本領域技術人員來說是已知的，而且沒有特殊限定。描述性的例子可以參考Karimi等人在TRENDS in Plant Science，Vol.7，NO5，May 2002，pp.193-195，的文章看到進一步的例子，在此引入作為參考。
在本發明的另一個優選的實施例中，本發明提供一種分離的多肽，包含SEQ ID NO2中的氨基酸序列或者那些與SEQ ID NO2有至少70％，優選80％，更優選90％，最優選95％同源性的蛋白質，其中多肽具有Ice1的轉錄激活因子的活性。因此，酶具有與SEQ ID NO2從70％最多到小于100％的同源性。
在另一個實施例中，本發明還提供一種提高植物適冷性的方法，包括在植物中過表達Snow1轉錄激活因子。在這個實施例中，Snow1還可以進一步和Ice1共表達。
在另一個實施例中，本發明提供一種提高植物適冷性的方法，包括提高一種或者更多附加轉錄因子的表達，該轉錄因子選自CBF轉錄因子和DREB1轉錄因子轉錄因子，和/或提高一種或者更多冷響應基因的表達。
在本發明上下文中，術語“冷響應基因”包括編碼選自下列蛋白質的基因糖類呼吸作用中的酶，糖類代謝中的酶，脂類呼吸作用中的酶，脂類代謝中的酶，類苯丙醇呼吸作用中的酶，類苯丙醇代謝中的酶，抗氧化劑呼吸作用中的酶，抗氧化劑代謝中的酶，分子伴侶，抗凍蛋白質，和對冷凍引起的脫水作用有耐性的蛋白質。
本發明的上述描述提供了一種任何本領域熟練的人都可以獲得和利用的方法和步驟，并作為附加的權利要求書的主題，其構成了原始說明書的一部分。
在上面所使用的詞組“選自”、“選自以下”和類似的表達包括限定物質的混合物。
在此提到數字界限或者范圍時，其終點也是包括在內的。并且，在數字界限或者范圍內所有數值和子集也都是特定包括在內的，如同其已經明確寫出。
提供上述描述是使本領域技術人員能夠獲得和利用本發明，并且提供在特定應用和需要中。。本領域技術人員可以對所提到的實施例進行各種修飾，在此所提到的原理也可以應用到其他的實施例和應用中去，而沒有離開本發明的精神和范圍。因此，本發明不僅僅限制在實施例中所描述的，而是符合與在此所公開的原則和特征一致的最大范圍。
本發明已經進行了總體上的介紹，通過參考特定的實施例獲得更進一步的理解，在此提供的這些實施例只是為了描述而不是作為限制，除非有其他特殊說明。
具體實施例方式
材料與方法基因表達分析為了進行RNA分析，使用的是在相同MS培養基不同部分的10天的野生型秧苗和Ice1(顯型)植物。通過Liu和hu(1997)所描述的RNA印跡實驗對從對照和壓力處理的植物中提取的總RNA進行分析。如上所述從過表達Sow1的植物中提取RNA。將RNA轉到尼龍膜上，用全長的Snow1的cDNA或者CBF3探針標記尼龍膜。以β-微管蛋白基因通過PCR的方法(Chinnusamy等，2003)進行擴增來作為上樣的對照。為了分析在不同組織中的表達，從根部，葉子，花和長角果中提取RNA并且用全長的Snow1的cDNA作為探針進行RNA印跡分析。ICE1的開放閱讀框(SEQ ID NO3)通過對由RT-PCR得到的cDNA進行測序來確定(見美國專利申請號No.10/425,913，其全部內容在此引入作為參考)。
酵母雙雜交相互作用研究用引物5′GATGGGAAGAGCTCCATGCTG 3′(SEQ ID NO5)和5′CCGCTCGAGCTAGCCAATACATCGAACCAG 3′(SEQID NO6)擴增Snow1的全長，并克隆到pACT2載體(獵物載體)的SmaI和XhoI位點。利用引物5′TGAGACTGGGATTGAGGTTTCTG 3′(SEQ ID NO7)和5′CAAGCTTGCCTGCAGGTCGAC 3′(SEQ ID NO8)從pMal-Icel DNA(Ice1克隆在MBP融合載體上)上作為模板擴增Ice1的C端區域(相對應的是266-494氨基酸)，并且克隆到pAS2載體(誘餌載體)的SmaI和SalI位點。為了描繪出相互作用的結構域，利用基因的特異引物進行PCR擴增Ice1的C端部分的一些缺失體，并克隆到pAS2的NcoI和BamHI的位點。將獵物和不同的誘餌質粒共轉化化Y190酵母株，并從缺失色氨酸和亮氨酸的SC培養基上挑選陽性克隆。對所得到的陽性克隆進行β-半乳糖苷酶活性測試。
在大腸桿菌中表達和純化融合蛋白質用基因特定引物CGGGATCCATGGGAAGAGCTCCATGCTGTG(SEQID NO9)和SP6引物進行擴增全長的Snow1 cDNA(克隆在pGEMT-easy上)。所擴增的產物被克隆到pMAL載體(NEB)或者pGEX 4T-1載體(Pharmacia，美國)的BamHI和SalI位點。利用引物CGGGATCCGAATGGTGGAAGAAGTTTGGAGAAA(SEQ ID NO10)和CCGCTCGAGTTAACAAAATGGAATCACCAAGTT(SEQ ID NO11)擴增全長的AtMyb79cDNA并克隆到pGex 4T-1載體(Pharmacia)的BamHI和XhoI位點。根據手冊的說明書的指導來純化MBP-Snow1的融合蛋白質。用構建的表達GST融合的Snow1和GST融合的Atmyb79(遠端MYB轉錄因子)的質粒轉化大腸桿菌BL21(已增加密碼子)細胞。將單克隆在37℃培養過夜后，轉入新鮮的20倍體積的LB(Luria-Bertani)培養基中，進一步培養1小時。用1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷在37℃下處理4小時以誘導重組蛋白質的表達。離心收集細胞(5,000g，10分鐘，4℃)，加入預冷的裂解緩沖液(10mM Tris pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA and 100μg/ml溶菌酶)于冰上孵育15分鐘。添加二硫蘇糖醇(50mM)，氟化磺酰苯甲烷(1mM)and N-十二烷基肌氨酸(1％)后進行一分鐘超聲。超聲產物在30,000g 4℃下離心15分鐘后變得澄清。在上清中加入Triton X-100(1.5％)后振蕩。準備谷胱甘肽-瓊脂糖珠子(Sigma)。用預冷的PBS清洗六次珠子。再用100mM谷胱甘肽(Sigma)，50mM Tris，pH8.8清洗GST融合的蛋白質。用含有用1M咪唑的預冷的PBS清洗HIS標記的ICE1。
DNA結合為了和CBF啟動子結合，用KOD聚合酶(Novagen)通過PCR方法擴增CBF啟動子的不同片斷(在圖3中有對片斷的詳細描述)。用Qiaquick膠純化試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖膠上洗提出擴增的片斷。清洗的片斷用γ-P32ATP和T4多核苷酸激酶進行末端標記。500pg的標記過的探針與500ng提純的MBP-SNOW1融合蛋白質在室溫孵育30分鐘。在與標記的探針孵育之前，純化的蛋白質與100ng未標記的片斷在室溫下孵育30分鐘以競爭。DNA-蛋白質的復合體在0.5XTBE中5％聚丙烯酰氨膠中分離，用并自顯影的方法顯像。
瞬時表達測試將全長的Snow1和AtMyb79cDNA克隆在植物表達載體2X35S-MCS-Nos.的SmaI和SalI位點上。用基因槍將得到的效應質粒的質粒DNA效應物和CBF啟動子-luc報告子轉化到擬南芥的葉子中(Ohta等，2001)。
體外拖拉實驗體外拖拉實驗是用來確認Snow1和Ice1的物理結合的。使用克隆在pGEM-Teasy載體上的全長Snow1與AtMyb79(克隆在pBCSKStrategene載體的EcoRI和XhoI位點之間)。全長的Ice1和ABI2克隆在pCITE4a的EcoRI/SalI和NcoI/EcoRI位點上。用Megascript T7RNA聚合酶試劑盒(Ambion)體外轉錄每種線性質粒各2μg。用Flexi Rabbit Reticulocyte系統(Promega)在35S-甲硫氨酸存在的情況下，體外翻譯10μg純化的Snow1和AtMyb79轉錄產物。S標記的Ice1和S標記的ABI2轉錄產物在沒有35S-甲硫氨酸存在的情況下體外翻譯，并用S標簽純化試劑盒(Novagen)根據手冊的說明書來純化所得到的蛋白質。利用結合在S標記的漿液上的S標記的Ice1和S標記的ABI2對35S標記蛋白質進行拖拉。在另一試驗中，使用GST-Snow1或者GST-Myb79蛋白質來制備35S標記的S標簽Ice蛋白質并用來拖拉。拖拉實驗根據如上所述(Haftler et al 2000)進行。
Snow1的表達和定位為了構建Snow1啟動子-GUS的融合產物，首先用引物CCCAAGCTTATACCATATCAAATCTGAGAAAG(SEQ ID NO18)和CGCGGATCCATTTGTGATTGCTGATAAAAGAAG(SEQ ID NO19)從Col野生型的基因組中PCR擴增Snow1 cDNA起始位點上游的2.0kb片斷，并克隆到pCAMBIA1391Z的HindIII和BamHI位點上。所得到質粒轉移到農桿菌GV3101然后通過植物真空滲入的方法導入Col-O生態型的擬南芥中(Bechtold and Pelletier，1998)。在含有30mg/L潮霉素的MS培養基上篩選轉基因植物。轉基因的秧苗在長到21天的時候根據Jefferson等人(1987)所述，用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸染色進行組織化學染色，并在奧林巴斯FZX12解剖顯微鏡下識別。為了構建全長的GFP融合的Snow1，首先用引物CCGGAATTCATGGGAAGAGCTCCATGCTGTGAG(SEQ ID NO20)和CGCGGATCCCTAGCCAATACATCGAACCAGAAG(SEQ ID NO21)進行PCR擴增并克隆到含有bialophos acetyltransferase選擇標記基因的pEGAD載體的EcoRI和BamHI位點(Cutler等，2000)。所得到質粒利用農桿菌GV3101介導通過植物真空滲入的方法導入Col-O生態型的擬南芥(Bechtoldand Pelletier，1998)。為了進行共軛聚焦顯微鏡觀察，在含有50mg/L潮霉素的MS瓊脂糖培養基上篩選的Snow1GFP轉基因秧苗，在玻璃片上制作標本，進而利用Zeiss 510Meta共軛聚焦顯微鏡通過488-nm激發激光和522/DF35散發濾鏡顯象。
構建轉基因植物利用引物GCTCTAGAATGGGAAGAGCTCCATGCTGTGA(SEQ ID NO22)和GGGGTACCCTAGCCAATACATCGAACCAGA(SEQ ID NO23)通過PCR方法擴增全長的Snow1基因，并克隆到pRT105載體的XbaI/KpnI位點。從得到的質粒上分離出含有35S啟動子-Snow1-nos終止子的基因盒，并克隆到pCAMBIA 3300載體的PstI位點。最終構建的質粒利用農桿菌GV3101介導，通過植物滲入的方法轉化到擬南芥(CBF3-luc背景)。可以利用攜帶有Snow1過表達載體的農桿菌GV3101來得到在CBF3-LUC背景下Snow1過量表達的植物株。在萌芽兩個星期后，每隔三天噴三次30mg/L basta來篩選T1代轉基因植物。
結果Snow1在Ice1突變植物中表達量更高RNA印跡實驗用來分析Ice1突變體對于Snow1轉錄水平的影響。與微陣列分析結果一致的是在冷壓力下Ice1突變體中Snow1的轉錄水平比野生型植物要高(CBF3luc)。在冷處理1小時，3小時，6小時后可以看到增高的Snow1轉錄水平。然而，在冷壓力處理12小時后，Ice1中Snow1的表達要比野生型植物要低。RNA印跡實驗還說明在對冷處理的反應中Snow1的表達會上調。野生型植物在冷壓力處理1小時后，可以表現出冷壓力誘導的Snow1轉錄并在處理6小時候達到最高值。Snow1的轉錄在沒有壓力的條件下也可以被檢測到。
Snow1在植物的所有部分都有組成型表達為了分析Snow1的分布，對從根，莖，花和長角果中提取出的RNA進行RNA膠印跡分析。發現Snow1在擬南芥的所有組織中都有表達。獲得了在Snow1啟動子控制下表達Gus基因的轉基因植物。轉基因擬南芥植物的T1代進行了Gus表達的分析。發現在根，葉，干和花部有Gus的表達，這進一步證實了Snow1是組成型廣泛表達的。
酵母雙雜交相互作用為了確定Snow1能否與Ice1相互作用，使用了酵母雙雜交體系。Ice1蛋白質的不同部分用作誘餌蛋白質，全長的Snow1蛋白質作為獵物以研究它們之間的相互作用。Snow1優先能夠與Ice1的C端部分相互作用。Snow1與Ice1的相互作用是特異的，因為單獨的獵物質粒和AtMyb79獵物質粒都不能與Ice1相互作用。Ice1的C端部分還可以通過敲除來收縮，并用作誘餌以精確描繪與Snow1相互作用。相應于Ice1上358-494位的氨基酸的區域可以特異性的與Snow1相互作用。除了酵母雙雜交以外，本發明人還利用蛋白質拖拉實驗來確認Snow1與Ice1的相互作用。GST-Snow1能夠拖拉35S-標記的Ice1。同樣的，S-標簽的Ice1也能夠拖拉35S標記的Snow1。它們的相互作用是特異的，因為GST-Myb79和S標記的ABI2都不能分別拖拉Ice1或者Snow1。這些結果說明Snow1與Ice1相互作用。
Snow1與CBF3啟動子的MYB識別位點結合進行凝膠滯留實驗(EMSA)確定Snow1與CBF啟動子的結合。CBF啟動子的不同區域進行PCR擴增并用于凝膠滯留實驗。在CBF1啟動子中，預測的Myb識別序列的分布如下-1000/-750區域中為0，在-750/-500，-500/-300和-150/+1區域中分別有一個，在-300/-150區域中有兩個。類似的，在CBF2啟動子序列中，在-1000/-750區域也沒有預測的Myb識別序列，在-500/-270和-270/-20區域各有一個。CBF3啟動子的四個不同區域還被應用在與MBP-Snow1融合蛋白質的凝膠滯留實驗中。除了第三個片斷沒有該序列外，其他所有的片斷都有兩個MYB識別序列。
在CBF1啟動子的相應于-750/-500和-500/-300區域的片斷中發現一個主要復合體，而CBF1啟動子的其他區域則沒有和Snow1結合。使用CBF2啟動子片斷時，觀察到與相應于-1000/-750和-500/-270區域的片斷的結合。而在CBF2的-270/-20區域則沒有結合發生。Snow1與CBF3啟動子的四個片斷都可以結合。這些復合體可以通過添加更高量的與相同序列結合的冷競爭者來消除。這些結果說明Snow1可以和CBF啟動子結合，并有可能是通過Myb序列介導的。
Snow1調節CBF3的表達可以通過瞬時轉化來確定Snow1是否能夠激活CBF3的表達。在CaMV35S啟動子控制下，克隆全長Snow1cDNA，構建效應子質粒。當CaMV35-Snow1和CBF3-響應報告基因CBF3-LUC被用基因槍轉入擬南芥葉子中的時候，相對于帶有或不帶有只含有CBF3-luc的報告質粒的對照，熒光素酶的活性增高了將近6倍(圖4A)。活性的提高要比使用CaMV35-Ice1作為效應子要大。當CaMV35-Snow1與CaMV35-Ice1被共同攻擊的時候，相對于單獨使用CaMV35-Snow1作為效應子，被熒光素酶的活性驅動的CBF3只有很小的變化。這些結果說明Snow1能夠增強CBF3的表達。
Snow1的亞細胞定位為了檢測Snow1蛋白質的亞細胞定位，全長的Snow1 cDNA與綠色熒光蛋白質(GFP)編碼序列的C端的序列進行框架融合。使用CaMV 35S啟動子驅動的GFP-Snow1融合用來獲得轉基因植物。T1代轉基因植物中GFP熒光的共軛聚焦圖像表明在細胞核中中存在GFP-Snow1(圖4B)，從而確認Snow1在沒有壓力的情況下是細胞核定位的。
轉基因分析將Snow1過表達構建導入GV3101的農桿菌中。含有Snow1過表達載體的農桿菌可以用作野生型(CBF3-LUC)植物的花浸漬(flower-dipping)轉化。Snow1過表達株(T1)可以通過它對basta的抗性來篩選。用T2代的種子，分析了T2代秧苗中Snow1過表達株的CBF3-LUC熒光強度。野生型沒有冷處理的情況下，Snow1過表達株中檢測不到熒光。然而，冷處理后Snow1過表達株比野生型表現出較高的CBF3-LUC表達。應該注意的是本發明人利用了T2代Snow1過表達株(分離群體)，在T2代秧苗株中與野生型的密度相比具有較強熒光的熒光強度。在冷處理過程中，Snow1過表達株比野生型表現出較高的熒光強度。有趣的是，一種Snow1過表達株在所測試的時間里一直表現出較低的熒光發光密度，這說明可能Snow1也會有共抑制的作用。
根據上述指導，可以對本發明進行許多種修改和變化。因此，可以理解在隨附的權利要求的范圍中，除了在此特別限定的之外，也可以實現本發明。
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<223>合成的DNA<400>1atgggaagag ctccatgctg tgagaagatg gggttgaaga gaggaccatg gacacctgaa60gaagatcaaa tcttggtctc ttttatcctc aaccatggac atagtaactg gcgagccctc120cctaagcaag ctggtctttt gagatgtgga aaaagctgta gacttaggtg gatgaactat180ttaaagcctg atattaaacg tggcaatttc accaaagaag aggaagatgc tatcatcagc240ttacaccaaa tacttggcaa tagatggtca gcgattgcag caaaactgcc tggaagaacc300gataacgaga tcaagaacgt atggcacact cacttgaaga agagactcga agattatcaa360ccagctaaac ctaagaccag caacaaaaag aagggtacta aaccaaaatc tgaatccgta420ataacgagct cgaacagtac tagaagcgaa tcggagctag cagattcatc aaacccttct480ggagaaagct tattttcgac atcgccttcg acaagtgagg tttcttcgat gacactcata540agccacgacg gctatagcaa cgagattaat atggataaca aaccgggaga tatcagtact600atcgatcaag aatgtgtttc tttcgaaact tttggtgcgg atatcgatga aagcttctgg660aaagagacac tgtatagcca agatgaacac aactacgtat cgaatgacct agaagtcgct720ggtttagttg agatacaaca agagtttcaa aacttgggct ccgctaataa tgagatgatt780tttgacagtg agatggaact tctggttcga tgtattggct ag 822<210>2<211>276<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的多肽<400>2Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Met Gly Leu Lys Arg Gly Pro1 5 10 15Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Ile Leu Val Ser Phe Ile Leu Asn His20 25 30Gly His Ser Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Gln Ala Gly Leu Leu Arg
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Lys Pro Asp50 55 60Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Lys Glu Glu Glu Asp Ala Ile Ile Ser65 70 75 80Leu His Gln Ile Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Ala Lys Leu85 90 95Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu100 105 110Lys Lys Arg Leu Glu Asp Tyr Gln Pro Ala Lys Pro Lys Thr Ser Asn115 120 125Lys Lys Lys Gly Thr Lys Pro Lys Ser Glu Ser Val Ile Thr Ser Ser130 135 140Asn Ser Thr Arg Ser Glu Ser Glu Leu Ala Asp Ser Ser Asn Pro Ser145 150 155 160Gly Glu Ser Leu Phe Ser Thr Ser Pro Ser Thr Ser Glu Val Ser Ser165 170 175Met Thr Leu Ile Ser His Asp Gly Tyr Ser Asn Glu Ile Asn Met Asp180 185 190Asn Lys Pro Gly Asp Ile Ser Thr Ile Asp Gln Glu Cys Val Ser Phe195 200 205Glu Thr Phe Gly Ala Asp Ile Asp Glu Ser Phe Trp Lys Glu Thr Leu210 215 220Tyr Ser Gln Asp Glu His Asn Tyr Val Ser Asn Asp Leu Glu Val Ala225 230 235 240Gly Leu Val Glu Ile Gln Gln Glu Phe Gln Asn Leu Gly Ser Ala Asn245 250 255Asn Glu Met Ile Phe Asp Ser Glu Met Glu Leu Leu Val Arg Cys Ile260 265 270Gly Ile Cys Glu275<210>3<211>2021<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA<400>3atcaaaaaaa aagtttcaat ttttgaaagc tctgagaaat gaatctatca ttctctctct60ctatctctat cttccttttc agatttcgct tcttcaatt catgaaatcct cgtgattcta120
ctttaatgct tctctttttt tacttttcca agtctctgaa tattcaaagt atatatcttt180tgttttcaaa cttttgcaga attgtcttca agcttccaaa tttcagttaa aggtctcaac240tttgcagaat tttcctctaa aggttcagac tttggggtaa aggtgtcaac tttggcgatg300ggtcttgacg gaaacaatgg tggaggggtt tggttaaacg gtggtggtgg agaaagggaa360gagaacgagg aaggttcatg gggaaggaat caagaagatg gttcttctca gtttaagcct420atgcttgaag gtgattggtt tagtagtaac caaccacatc cacaagatct tcagatgtta480cagaatcagc cagatttcag atactttggt ggttttcctt ttaaccctaa tgataatctt540cttcttcaac actctattga ttcttcttct tcttgttctc cttctcaagc ttttagtctt600gacccttctc agcaaaatca gttcttgtca actaacaaca acaagggttg tcttctcaat660gttccttctt ctgcaaaccc ttttgataat gcttttgagt ttggctctga atctggtttt720cttaaccaaa tccatgctcc tatttcgatg gggtttggtt ctttgacaca attggggaac780agggatttga gttctgttcc tgatttcttg tctgctcggt cacttcttgc gccggaaagc840aacaacaaca acacaatgtt gtgtggtggt ttcacagctc cgttggagtt ggaaggtttt900ggtagtcctg ctaatggtgg ttttgttggg aacagagcga aagttctgaa gcctttagag960gtgttagcat cgtctggtgc acagcctact ctgttccaga aacgtgcagc tatgcgtcag1020agctctggaa gcaaaatggg aaattcggag agttcgggaa tgaggaggtt tagtgatgat1080ggagatatgg atgagactgg gattgaggtt tctgggttga actatgagtc tgatgagata1140aatgagagcg gtaaagcggc tgagagtgtt cagattggag gaggaggaaa gggtaagaag1200aaaggtatgc ctgctaagaa tctgatggct gagaggagaa ggaggaagaa gcttaatgat1260aggctttata tgcttagatc agttgtcccc aagatcagca aaatggatag agcatcaata1320cttggagatg caattgatta tctgaaggaa cttctacaaa ggatcaatga tcttcacaat1380gaacttgagt caactcctcc tggatctttg cctccaactt catcaagctt ccatccgttg1440acacctacac cgcaaactct ttcttgtcgt gtcaaggaag agttgtgtcc ctcttcttta1500ccaagtccta aaggccagca agctagagtt gaggttagat taagggaagg aagagcagtg1560aacattcata tgttctgtgg tcgtagaccg ggtctgttgc tcgctaccat gaaagctttg1620gataatcttg gattggatgt tcagcaagct gtgatcagct gttttaatgg gtttgccttg1680gatgttttcc gcgctgagca atgccaagaa ggacaagaga tactgcctga tcaaatcaaa1740gcagtgcttt tcgatacagc agggtatgct ggtatgatct gatctgatcc tgacttcgag1800tccattaagc atctgttgaa gcagagctag aagaactaag tccctttaaa tctgcaattt1860tcttctcaac tttttttctt atgtcataac ttcaatctaa gcatgtaatg caattgcaaa1920tgagagttgt ttttaaatta agcttttgag aacttgaggt tgttgttgtt ggatacataa1980cttcaacctt ttattagcaa tgttaacttc catttatgtc t2021<210>4<211>494<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的多肽<400>4
Met Gly Leu Asp Gly Asn Asn Gly Gly Gly Val Trp Leu Asn Gly Gly1 5 10 15Gly Gly Glu Arg Glu Glu Asn Glu Glu Gly Ser Trp Gly Arg Asn Gln20 25 30Glu Asp Gly Ser Ser Gln Phe Lys Pro Met Leu Glu Gly Asp Trp Phe35 40 45Ser Ser Asn Gln Pro His Pro Gln Asp Leu Gln Met Leu Gln Asn Gln50 55 60Pro Asp Phe Arg Tyr Phe Gly Gly Phe Pro Phe Asn Pro Asn Asp Asn65 70 75 80Leu Leu Leu Gln His Ser Ile Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser Pro Ser85 90 95Gln Ala Phe Ser Leu Asp Pro Ser Gln Gln Asn Gln Phe Leu Ser Thr100 105 110Asn Asn Asn Lys Gly Cys Leu Leu Asn Val Pro Ser Ser Ala Asn Pro115 120 125Phe Asp Asn Ala Phe Glu Phe Gly Ser Glu Ser Gly Phe Leu Asn Gln130 135 140Ile His Ala Pro Ile Ser Met Gly Phe Gly Ser Leu Thr Gln Leu Gly145 150 155 160Asn Arg Asp Leu Ser Ser Val Pro Asp Phe Leu Ser Ala Arg Ser Leu165 170 175Leu Ala Pro Glu Ser Asn Asn Asn Asn Thr Met Leu Cys Gly Gly Phe180 185 190Thr Ala Pro Leu Glu Leu Glu Gly Phe Gly Ser Pro Ala Asn Gly Gly195 200 205Phe Val Gly Asn Arg Ala Lys Val Leu Lys Pro Leu Glu Val Leu Ala210 215 220Ser Ser Gly Ala Gln Pro Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Ala Met Arg225 230 235 240Gln Ser Ser Gly Ser Lys Met Gly Asn Ser Glu Ser Ser Gly Met Arg245 250 255Arg Phe Ser Asp Asp Gly Asp Met Asp Glu Thr Gly Ile Glu Val Ser260 265 270Gly Leu Asn Tyr Glu Ser Asp Glu Ile Asn Glu Ser Gly Lys Ala Ala275 280 285Glu Ser Val Gln Ile Gly Gly Gly Gly Lys Gly Lys Lys Lys Gly Met290 295 300
Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Asn305 310 315 320Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile Ser Lys Met325 330 335Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Asp Tyr Leu Lys Glu Leu340 345 350Leu Gln Arg Ile Asn Asp Leu His Asn Glu Leu Glu Ser Thr Pro Pro355 360 365Gly Ser Leu Pro Pro Thr Ser Ser Ser Phe His Pro Leu Thr Pro Thr370 375 380Pro Gln Thr Leu Ser Cys Arg Val Lys Glu Glu Leu Cys Pro Ser Ser385 390 395 400Leu Pro Ser Pro Lys Gly Gln Gln Ala Arg Val Glu Val Arg Leu Arg405 410 415Glu Gly Arg Ala Val Asn Ile His Met Phe Cys Gly Arg Arg Pro Gly420 425 430Leu Leu Leu Ala Thr Met Lys Ala Leu Asp Asn Leu Gly Leu Asp Val435 440 445Gln Gln Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe Ala Leu Asp Val Phe450 455 460Arg Ala Glu Gln Cys Gln Glu Gly Gln Glu Ile Leu Pro Asp Gln Ile465 470 475 480Lys Ala Val Leu Phe Asp Thr Ala Gly Tyr Ala Gly Met Ile485 490<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA<400>5gatgggaaga gctccatgct g21<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA<400>6ccgctcgagc tagccaatac atcgaaccag 30<210>7<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA<400>7tgagactggg attgaggttt ctg 23<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成的DNA<400>19
cgcggatcca tttgtgattg ctgataaaag aag 33<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA<400>20ccggaattca tgggaagagc tccatgctgt gag 33<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA<400>21cgcggatccc tagccaatac atcgaaccag aag 33<210>22<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA<400>22gctctagaat gggaagagct ccatgctgtg a 31<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA<400>23ggggtaccct agccaataca tcgaaccaga 30
權利要求
1.一種分離的多聚核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質。
2.權利要求1所述的分離的多聚核苷酸，其中所述的蛋白質具有Snow1轉錄激活因子活性。
3.一種分離的多聚核苷酸，其包含SEQ ID NO1的多聚核苷酸。
4.一種分離的多聚核苷酸，其與權利要求3所述的多聚核苷酸互補。
5.一種分離的多聚核苷酸，其與權利要求3所述的多聚核苷酸至少70％相同。
6.一種分離的多聚核苷酸，其與權利要求3所述的多聚核苷酸至少80％相同。
7.一種分離的多聚核苷酸，其與權利要求3所述的多聚核苷酸至少90％相同。
8.一種分離的多聚核苷酸，其與權利要求3所述的多聚核苷酸在嚴格條件下雜交；其中所述嚴格條件包括在5X SSC中50～68℃溫度下清洗。
9.權利要求3所述的分離的多聚核苷酸，其編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質。
10.一種包含權利要求1所述的分離的多聚核苷酸的載體。
11.一種包含權利要求3所述的分離的多聚核苷酸的載體。
12.一種包含權利要求1所述的分離的多聚核苷酸的寄主細胞。
13.一種包含權利要求3所述的分離的多聚核苷酸的寄主細胞。
14.一種包含權利要求1所述的分離的多聚核苷酸的植物細胞。
15.一種包含權利要求3所述的分離的多聚核苷酸的植物細胞。
16.一種包含權利要求1所述的分離的多聚核苷酸的轉基因植物。
17.一種包含權利要求3所述的分離的多聚核苷酸的轉基因植物。
18.權利要求16所述的轉基因植物，其中所述的植物為擬南芥。
19.權利要求17所述的轉基因植物，其中所述的植物為擬南芥。
20.權利要求16所述的轉基因植物，其中所述植物選自小麥、玉米、花生、棉花、燕麥和大豆植物。
21.權利要求16所述的轉基因植物，其中分離的多聚核苷酸連接于可誘導啟動子。
22.權利要求17所述的轉基因植物，其中分離的多聚核苷酸連接于可誘導啟動子。
23.一種篩選編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸的方法，包括將權利要求1所述的分離的多聚核苷酸與要篩選的多聚核苷酸雜交；表達多聚核苷酸得到蛋白質；檢測所述的蛋白質中是否具有Snow1轉錄激活因子活性。
24.一種篩選編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸的方法，包括將權利要求3所述的分離的多聚核苷酸與要篩選的多聚核苷酸雜交；表達多聚核苷酸得到蛋白質；檢測所述的蛋白質中是否具有Snow1轉錄激活因子活性。
25.一種篩選編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸的方法，包括將權利要求8所述的分離的多聚核苷酸與要篩選的多聚核苷酸雜交；表達多聚核苷酸得到蛋白質；檢測所述的蛋白質中是否具有Snow1轉錄激活因子活性。
26.一種檢測與權利要求1所述核苷酸至少70％同源的核酸的方法，包括將核酸樣品與包含權利要求1核苷酸序列的至少15個連續核苷酸或者其互補序列的至少15個連續核苷酸的探針或者引物進行接觸。
27.一種制備與權利要求1所述核苷酸至少70％同源的核酸的方法，包括將核酸樣品與包含權利要求1核苷酸序列的至少15個連續核苷酸或者其互補序列的至少15個連續核苷酸的引物進行接觸。
28.一種檢測權利要求3所述核苷酸的方法，包括將核酸樣品與包含權利要求3的核苷酸序列的至少15個連續核苷酸或者其互補序列的至少15個連續核苷酸的探針或者引物進行接觸。
29.一種制備權利要求3中所述核苷酸方法，包括將核酸樣品與包含權利要求3的核苷酸序列的至少15個連續核苷酸或者其互補序列的至少15個連續核苷酸的引物進行接觸。
30.一種獲得Snow1蛋白質的方法，包括在適合Snow1表達的條件下培養權利要求12的寄主細胞一段時間，并收集Snow1蛋白質。
31.一種獲得Snow1蛋白質的方法，包括在適合Snow1表達的條件下培養權利要求13的寄主細胞一段時間，并收集Snow1蛋白質。
32.一種獲得轉基因植物的方法，包括將權利要求1的多聚核苷酸導入植物中。
33.一種獲得轉基因植物的方法，包括將權利要求1的多聚核苷酸導入植物中。
34.一種提高植物所需要的適冷性的方法，包括將權利要求1的多聚核苷酸導入所述的植物中。
35.一種提高植物所需要的適冷性的方法，包括將權利要求3的多聚核苷酸導入所述的植物中。
36.一種提高植物所需要的適冷性的方法，包括在所述植物中增強Snow1基因的表達。
37.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
38.權利要求37所述的分離的多肽，其具有Snow1轉錄激活因子活性。
39.一種分離的多肽，其與權利要求37的分離的多肽至少70％相同并具有Snow1轉錄激活因子的活性。
40.一種分離的多肽，其與權利要求37的分離的多肽至少80％相同并具有Snow1轉錄激活因子的活性。
41.一種分離的多肽，其與權利要求37的分離的多肽至少90％相同并具有Snow1轉錄激活因子的活性。
42.一種分離的多肽，其與權利要求37的分離的多肽至少95％相同并具有Snow1轉錄激活因子的活性。
43.一種提高植物適冷性的方法，包括在植物中過表達Snow1轉錄激活因子。
44.權利要求43所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子具有SEQ IDNO2的氨基酸序列。
45.權利要求43所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有SEQ IDNO1序列的核酸編碼。
46.權利要求43所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有與Snow1至少70％相同的序列的核酸編碼。
47.權利要求43所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有與Snow1至少90％相同的序列的核酸編碼。
48.權利要求43所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由與Snow1核酸互補序列在嚴格條件下進行雜交的核酸編碼，其中所述嚴格條件包括在5XSSC中50～68℃溫度下清洗。
49.權利要求43所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子的氨基酸序列與Snow1具有至少80％的同源性。
50.權利要求43所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子的氨基酸序列與Snow1具有至少90％的同源性。
51.權利要求43所述的方法，其中植物為擬南芥。
52.權利要求43所述的方法，其中植物選自小麥、玉米、花生、棉花、燕麥和大豆。
53.權利要求43所述的方法，其中植物具有一種或者更多附加的轉錄因子的增強表達，轉錄因子選自CBF轉錄因子和DREB1轉錄因子。
54.權利要求43所述的方法，其中植物具有一種或者更多冷應答基因的增強表達。
55.權利要求54所述的方法，其中冷應答基因編碼一種蛋白質，該蛋白質選自一種糖類的呼吸作用中的酶，一種糖類代謝中的酶，一種脂類呼吸作用中的酶，一種脂類代謝中的酶，一種類苯丙醇呼吸作用中的酶，一種類苯丙醇代謝中的酶，一種抗氧化劑呼吸作用中的酶，一種抗氧化劑代謝中的酶，一種分子伴侶，一種抗凍蛋白質，和一種對冷凍引起的脫水作用有抗性的蛋白質。
56.權利要求43所述的方法，其中植物被編碼Snow1轉錄激活因子的載體所轉化。
57.權利要求56所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子具有SEQ IDNO2的氨基酸序列。
58.權利要求56所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有SEQ IDNO1序列的核酸編碼。
59.權利要求56所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有與SEQ IDNO1至少70％相同的序列的核酸編碼。
60.權利要求56所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有與SEQ IDNO1至少90％相同的序列的核酸編碼。
61.權利要求56所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由一種與SEQ IDNO1互補序列在嚴格條件下進行雜交的核酸編碼，其中所述嚴格條件包括在5X SSC中50～68℃溫度下清洗。
62.權利要求56所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子的氨基酸序列與SEQ ID NO2具有至少80％同源性。
63.權利要求56所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子的氨基酸序列與SEQ ID NO2具有至少90％的同源性。
64.權利要求56所述的方法，其中植物為擬南芥。
65.權利要求56所述的方法，其中植物選自小麥、玉米、花生、棉花、燕麥和大豆。
66.權利要求56所述的方法，其中植物具有一種或更多附加轉錄因子的增強表達，該附加轉錄因子選自CBF轉錄因子和DREB1轉錄因子。
67.權利要求56所述的方法，其中植物具有一種或更多冷應答基因的增強表達。
68.權利要求67所述的方法，其中所述冷應答基因編碼一種蛋白質，該蛋白質選自一種糖類的呼吸作用中的酶，一種糖類代謝中的酶，一種脂類呼吸作用中的酶，一種脂類代謝中的酶，一種類苯丙醇呼吸作用中的酶，一種類苯丙醇代謝中的酶，一種抗氧化劑呼吸作用中的酶，一種抗氧化劑代謝中的酶，一種分子伴侶，一種抗凍蛋白質，和一種對冷凍引起的脫水作用有抗性的蛋白質。
69.一種在植物細胞中提高一種或更多冷應答基因表達的方法，包括用編碼Snow1轉錄激活因子的載體轉化植物。
70.權利要求69所述的方法，其中植物具有增強的適冷性。
71.權利要求69所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子具有SEQ IDNO1的氨基酸序列。
72.權利要求69所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有SEQ IDNO2序列的核酸編碼。
73.權利要求69所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有與SEQ IDNO1至少70％相同的序列的核酸編碼。
74.權利要求69所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由具有與SEQ IDNO1至少90％相同的序列的核酸編碼。
75.權利要求69所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子由一種與SEQ IDNO1互補序列在嚴格條件下進行雜交的核酸編碼，其中所述嚴格條件包括在5X SSC中50～68℃溫度下清洗。
76.權利要求69所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子的氨基酸序列與SEQ ID NO2具有至少80％的同源性。
77.權利要求69所述的方法，其中Snow1轉錄激活因子的氨基酸序列與SEQ ID NO2具有至少90％的同源性
78.權利要求69所述的方法，其中植物細胞為擬南芥。
79.權利要求69所述的方法，其中植物細胞選自小麥、玉米、花生、棉花、燕麥和大豆。
80.一種表達盒，其包括一種啟動子，其作用于在植物細胞中連接到編碼SEQ ID NO1的Snow1蛋白質的分離的核酸上，其中植物細胞中蛋白質的增強表達表明所述植物細胞的適冷性增強。
81.權利要求80所述的表達盒，其中啟動子選自一種病毒包被蛋白質啟動子，一種組織特異性啟動子，一種單子葉植物啟動子，一種泛素啟動子，一種壓力誘導啟動子，一種CaMV 35S啟動子，一種CaMV 19S啟動子，一種肌動蛋白啟動子，一種cab啟動子，一種蔗糖合成酶啟動子，一種微管蛋白啟動子，一種napin R基因復合體啟動子，一種番茄E8啟動子，一種patatin啟動子，一種甘露堿合成酶啟動子，一種大豆種子蛋白球蛋白啟動子，一種大豆植物儲存蛋白質啟動子，一種細菌噬菌體SP6啟動子，一種細菌噬菌體T3啟動子，一種細菌噬菌體T7啟動子，一種Ptac啟動子，一種根部細胞啟動子，一種ABA誘導啟動子，和一種膨脹誘導啟動子。
82.一種攜帶共表達(a)和(b)的載體的寄主細胞，其中(a)是與SEQID NO1具有至少70％同源性并編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸，(b)是與SEQ ID NO3具有至少70％同源性并編碼具有Ice1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸。
83.權利要求82所述的寄主細胞，其中(a)是與SEQ ID NO1具有至少90％同源性的多聚核苷酸。
84.權利要求82所述的寄主細胞，其中(a)是SEQ ID NO1的多聚核苷酸。
85.權利要求82所述的寄主細胞，其中(b)是與SEQ ID NO3具有至少90％同源性的多聚核苷酸。
86.權利要求82所述的寄主細胞，其中(b)是SEQ ID NO3的多聚核苷酸。
87.權利要求82所述的寄主細胞，其中所述的載體包括所述的連接于可誘導啟動子的多聚核苷酸。
88.權利要求87所述的寄主細胞，其中啟動子選自一種病毒包被蛋白質啟動子，一種組織特異性啟動子，一種單子葉植物啟動子，一種泛素啟動子，一種壓力誘導啟動子，一種CaMV 35S啟動子，一種CaMV 19S啟動子，一種肌動蛋白啟動子，一種cab啟動子，一種蔗糖合成酶啟動子，一種微管蛋白啟動子，一種napin R基因復合體啟動子，一種番茄E8啟動子，一種patatin啟動子，一種甘露堿合成酶啟動子，一種大豆種子球蛋白蛋白質啟動子，一種大豆植物儲存蛋白質啟動子，一種細菌噬菌體SP6啟動子，一種細菌噬菌體T3啟動子，一種細菌噬菌體T7啟動子，一種Ptac啟動子，一種根部細胞啟動子，一種ABA誘導啟動子，和一種膨脹誘導啟動子。
89.權利要求87所述的寄主細胞，其中(a)和(b)是可選擇誘導的。
90.一種攜帶共表達(a)和(b)的載體的植物細胞，其中(a)是與SEQID NO1具有至少70％同源性并編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸，(b)是與SEQ ID NO3具有70％同源性并編碼具有Ice1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸。
91.權利要求90所述的植物細胞，其中植物是擬南芥。
92.權利要求90所述的植物細胞，其中(a)是與SEQ ID NO1具有至少90％同源性的多聚核苷酸。
93.權利要求90所述的植物細胞，其中(a)是SEQ ID NO1的多聚核苷酸。
94.權利要求90所述的植物細胞，其中(b)是與SEQ ID NO3具有至少90％同源性的多聚核苷酸。
95.權利要求90所述的植物細胞，其中(b)是SEQ ID NO3的多聚核苷酸。
96.權利要求90所述的植物細胞，其中所述的載體包括所述的連接于可誘導啟動子的多聚核苷酸。
97.權利要求96所述的植物細胞，其中啟動子選自一種病毒包被蛋白質啟動子，一種組織特異性啟動子，一種單子葉植物啟動子，一種泛素啟動子，一種壓力誘導啟動子，一種CaMV 35S啟動子，一種CaMV 19S啟動子，一種肌動蛋白啟動子，一種cab啟動子，一種蔗糖合成酶啟動子，一種微管蛋白啟動子，一種napin R基因復合體啟動子，一種番茄E8啟動子，一種patatin啟動子，一種甘露堿合成酶啟動子，一種大豆種子球蛋白蛋白質啟動子，一種大豆植物儲存蛋白質啟動子，一種細菌噬菌體SP6啟動子，一種細菌噬菌體T3啟動子，一種細菌噬菌體T7啟動子，一種Ptac啟動子，一種根部細胞啟動子，一種ABA誘導啟動子，和一種膨脹誘導啟動子。
98.權利要求96所述的植物細胞，其中(a)和(b)是可選擇誘導的。
99.一種攜帶共表達(a)和(b)的載體的轉基因植物，其中(a)是與SEQ ID NO1具有至少70％同源性并編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸，(b)是與SEQ ID NO3具有70％同源性并編碼具有Ice1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸。
100.權利要求99所述的轉基因植物，其中所述植物選自小麥，玉米，花生，棉花，燕麥和大豆植物。
101.權利要求99所述的轉基因植物，其中(a)是與SEQ ID NO1具有至少90％同源性的多聚核苷酸。
102.權利要求99所述的轉基因植物，其中(a)是SEQ ID NO1的多聚核苷酸。
103.權利要求99所述的轉基因植物，其中(b)是與SEQ ID NO3具有至少90％同源性的多聚核苷酸。
104.權利要求99所述的轉基因植物，其中(b)是SEQ ID NO3的多聚核苷酸。
105.權利要求99所述的轉基因植物，其中所述的載體包括所述的連接于可誘導啟動子的多聚核苷酸。
106.權利要求105所述的轉基因植物，其中啟動子選自一種病毒包被蛋白質啟動子，一種組織特異性啟動子，一種單子葉植物啟動子，一種泛素啟動子，一種壓力誘導啟動子，一種CaMV 35S啟動子，一種CaMV 19S啟動子，一種肌動蛋白啟動子，一種cab啟動子，一種蔗糖合成酶啟動子，一種微管蛋白啟動子，一種napin R基因復合體啟動子，一種番茄E8啟動子，一種patatin啟動子，一種甘露堿合成酶啟動子，一種大豆種子球蛋白蛋白質啟動子，一種大豆植物儲存蛋白質啟動子，一種細菌噬菌體SP6啟動子，一種細菌噬菌體T3啟動子，一種細菌噬菌體T7啟動子，一種Ptac啟動子，一種根部細胞啟動子，一種ABA誘導啟動子和一種膨脹誘導啟動子。
107.權利要求105所述的轉基因植物，其中(a)和(b)是可選擇誘導的。
108.一種提高植物所需要的適冷性的方法，包括將至少一種可以共表達(a)和(b)的載體導入所述植物，其中(a)是與SEQ ID NO1具有至少70％同源性并編碼具有Snow1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸，(b)是與SEQ ID NO3具有至少70％同源性并編碼具有Ice1轉錄激活因子活性的蛋白質的多聚核苷酸，其中所述植物中存在這兩種多聚核苷酸。
109.權利要求108所述的方法，其中所述植物為擬南芥。
110.權利要求108所述的轉基因植物，其中(a)是與SEQ ID NO1具有至少90％同源性的多聚核苷酸。
111.權利要求108所述的轉基因植物，其中(a)是SEQ ID NO1的多聚核苷酸。
112.權利要求108所述的轉基因植物，其中(b)是與SEQ ID NO3具有至少90％同源性的多聚核苷酸。
113.權利要求108所述的轉基因植物，其中(b)是SEQ ID NO3的多聚核苷酸。
114.權利要求108所述的方法，其中所述的載體包含所述的連接于可誘導啟動子的多聚核苷酸。
115.權利要求114所述的方法，其中啟動子選自一種病毒包被蛋白質啟動子，一種組織特異性啟動子，一種單子葉植物啟動子，一種泛素啟動子，一種壓力誘導啟動子，一種CaMV 35S啟動子，一種CaMV 19S啟動子，一種肌動蛋白啟動子，一種cab啟動子，一種蔗糖合成酶啟動子，一種微管蛋白啟動子，一種napin R基因復合體啟動子，一種番茄E8啟動子，一種patatin啟動子，一種甘露堿合成酶啟動子，一種大豆種子球蛋白蛋白質啟動子，一種大豆植物儲存蛋白質啟動子，一種細菌噬菌體SP6啟動子，一種細菌噬菌體T3啟動子，一種細菌噬菌體T7啟動子，一種Ptac啟動子，一種根部細胞啟動子，一種ABA誘導啟動子，和一種膨脹誘導啟動子。
116.權利要求114所述的方法，其中(a)和(b)是可選擇誘導的。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白質(Snowl)，及其突變體，以及編碼所述蛋白質的核酸，其與Icel相互作用并能夠激活CBF3啟動子活性從而調節植物的耐凍性。
文檔編號A01H1/00GK1745172SQ200480003201
公開日2006年3月8日 申請日期2004年10月6日 優先權日2003年10月6日
發明者朱健康, 馬努·阿加瓦爾, 阿維尼什·卡普爾 申請人:美國亞利桑那大學董事會