在遺傳修飾的非人生物中制備酮類胡蘿卜素的方法

專利名稱：在遺傳修飾的非人生物中制備酮類胡蘿卜素的方法
技術領域：
本發明涉及培養遺傳修飾的生物來制備酮類胡蘿卜素的方法，所述遺傳修飾生物與野生型相比具有修飾的酮酶活性及修飾的β環化酶活性；還涉及經過遺傳修飾的生物和它們作為用以生產酮類胡蘿卜素提取物的食品和飼料的用途。
背景技術：
類胡蘿卜素是在細菌、藻類、真菌及植物中從頭合成的。酮類胡蘿卜素，即含有至少一個酮基的類胡蘿卜素，例如蝦青素(Astaxanthin)、角黃素(Canthaxanthin)、海膽酮(echinenone)、3-羥基海膽酮(3-Hydroxyechinenon)、3’-羥基海膽酮(3’-Hydroxyechinenone)、金盞花玉紅質(adonirubin)和金盞花黃質(adonixanthin)等天然抗氧化劑和色素，是某些藻類和微生物產生的次級代謝產物。
鑒于其著色特性，酮類胡蘿卜素(尤其是蝦青素)被用作動物飼料的色素添加劑，特別是用于鱒魚、鮭魚和蝦的養殖中。
目前蝦青素的制備主要是通過化學合成的方法進行的。現在，通過培養藻類(如雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis))或發酵基因工程最優化的微生物并加以分離的生物技術方法，可以獲取少量天然酮類胡蘿卜素(例如天然蝦青素)。
因此，經濟的用于制備天然酮類胡蘿卜素的生物技術方法至關重要。
業已從多種生物中分離出編碼酮酶的核酸以及相應蛋白質序列，并注釋為如編碼橙黃農桿菌(Agrobacterium aurantiacum)來源酮酶的核酸(EP735 137，登陸號D58420)，來源于產堿菌屬種PC-1(Alcaligenes sp.PC-1)(EP 735137，登陸號D58422)，雨生紅球藻Flotow em.Wille和雨生紅球藻，NIES-144(EP 725137，WO 98/18910；Lotan等，FEBS Letters 1995，364，125-128，登陸號X86782及D45881)，Paracoccus marcusii(登陸號Y15112)，聚球藻屬(Synechocystis sp.)PC6803株(登陸號NP_442491)，慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium sp.)(登陸號AF218415)以及念珠藻屬(Nostocsp.)PCC 7120(Kaneko等，DNA Res.2001，8(5)，205-213；登陸號AP003592，BAB74888)的核酸。
EP735 137描述了將橙黃農桿菌或產堿菌屬PC-1來源的酮酶基因(crtW)插入微生物，從而在微生物(如 E.coli)中制備葉黃素(xanthophylls)的方法。
從EP 725137、WO 98/18910、Kajiwara等(Plant Mol.Biol.1995，29，343-352)及Hirschberg等(FEBS Letters 1995，364，125-128)可知將雨生紅球藻來源的酮酶基因(crtW，crtO或bkt)插入E.coli，以制備蝦青素的方法。
Hirschberg等(FEBS Letters 1997，404，129-134)描述了將雨生紅球藻來源的酮酶基因(crtO)插入聚球藻(Synechococcus)中制備蝦青素。Sandmann等(Photochemistry and Photobiology 2001，73(5)，551-55)描述了類似的方法，但其導致了角黃素的產生，且僅能產出微量的蝦青素。
WO 98/18910及Hirschberg等(Nature Biotechnology 2000，18(8)，888-892)描述了將雨生紅球藻來源的酮酶基因(crtO)插入煙草中，在煙草花的蜜腺中合成酮類胡蘿卜素。
WO 01/20011描述了在油料種子植物(如油菜籽、向日葵、大豆以及大麻)的種子中，使用種子特異性的啟動子以及雨生紅球藻來源的酮酶，通過DNA構建體生產酮類胡蘿卜素，尤其是蝦青素。
現有技術中描述的制備酮類胡蘿卜素的所有方法，尤其是所述的用于制備蝦青素的方法具有以下不足之處。一方面，產率仍然不如人意；另一方面，轉基因生物產生了大量的羥基化副產物(例如玉米黃質和金盞花黃質)。

發明內容
因此，本發明的目標在于提供通過培養遺傳修飾的非人生物制備酮類胡蘿卜素的方法；或進一步提供經過遺傳修飾的能產生酮類胡蘿卜素的非人生物，其減輕或不再具有上述現有技術的不足，或者能以更高產率生產所需的酮類胡蘿卜素。
據此，已經發現了通過培養遺傳修飾的生物來制備酮類胡蘿卜素的方法，所述遺傳修飾生物與野生型相比具有修飾的酮酶活性及修飾的β環化酶活性，而其修飾的β環化酶活性是由于該β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列，或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
“與野生型相比修飾的酮酶活性”，在起始生物或野生型不具酮酶活性的情況下，應優選理解為“與野生型相比造成的酮酶活性”。
“與野生型相比修飾的酮酶活性”，在起始生物或野生型具有酮酶活性的情況下，應優選理解為“與野生型相比增加的酮酶活性”。
“與野生型相比修飾的β環化酶活性”，在起始生物或野生型不具β環化酶活性的情況下，應優選理解為“與野生型相比造成的β環化酶活性”。
“與野生型相比修飾的β環化酶活性”，在起始生物或野生型具有β環化酶活性的情況下，應優選理解為“與野生型相比增加的β環化酶活性”。
本發明的非人生物(如微生物或植物)優選起始生物時能夠天然產生類胡蘿卜素(如β-胡蘿卜素或玉米黃質)，或能夠通過遺傳修飾(例如代謝途徑的再調節或互補)生產類胡蘿卜素(如β-胡蘿卜素或玉米黃質)。
作為起始或野生型生物，一些生物已經能夠產生酮類胡蘿卜素，例如蝦青素或角黃素。這些生物，如雨生紅球藻、Paracoccus marcusii、Xanthophyllomyces dendrorhous、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、綠球藻(Chlorococcum)、Phaffia rhodozyma、pheasant′s-eye、Neochloris wimmeri、原管藻(Protosiphon botryoides)、Scotiellopsis oocystiformis、Scenedesmusvacuolatus、Chlorela zofingiensis、Ankistrodesmus braunii、血紅裸藻(Euglena sanguinea)和Bacillus atrophaeus，作為起始或野生型生物，已經具有酮酶活性和β環化酶活性。
術語“野生型”，根據本發明應理解為相應的起始生物。
根據上下文，術語“生物”可以理解為非人起始生物(野生型)，或本發明中經過遺傳修飾的非人生物，或二者兼之。
優選地，特別是在不能明確指定植物或野生型的情況下，“野生型”在每種情況下是指用于判定下列活性變化的參照生物即酮酶活性的增加或造成、下文描述的羥化酶活性的增加或造成、下文描述的β環化酶活性的增加或造成、下文描述的HMG-CoA還原酶活性的增加、下文描述的(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性的增加、下文描述的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性的增加、下文描述的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性的增加、下文描述的異戊烯二磷酸酯Δ-異構酶活性的增加、下文描述的牻牛兒基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的法呢基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的八氫番茄紅素合酶活性的增加、下文描述的八氫番茄紅素去飽和酶活性的增加、下文描述的ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性的增加、下文描述的crtISO活性的增加、下文描述的FtsZ活性的增加、下文描述的MinD活性的增加、下文描述的ε-環化酶活性的增加和下文描述的內源β-羥化酶活性的降低，以及酮類胡蘿卜素含量的增加。
對于野生型已具有酮酶活性的微生物而言，該參照生物優選雨生紅球藻。
對于野生型不具有酮酶活性的微生物而言，該參照生物優選布拉霉(Blakeslea)。
對于野生型即已具有酮酶活性的植物而言，該參照生物優選夏側金盞花(Adonis aestivalis)、火焰金盞花(Adonis flammeus)或Adonis annuus，特別優選夏側金盞花。
對于野生型其花瓣中不具有酮酶活性的植物而言，該參照生物優選萬壽菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、香葉萬壽菊(Tagetes lucida)、普林萬壽菊(Tagetes Pringlei)、Tagetes palmeri、小萬壽菊(Tagetes minuta)或鐘形萬壽菊(Tagetes campanulata)，特別優選萬壽菊。
酮酶活性應理解為酮酶的酶活性。
酮酶是指一種蛋白質，其具有在任選取代的類胡蘿卜素β-芷香酮環上引入酮基的酶活性。
特別地，酮酶指具有將β-胡蘿卜素轉變成角黃素的酶活性的蛋白質。
據此，酮酶活性是指一定時間內由酮酶蛋白質反應的β-胡蘿卜素的量或生成的角黃素的量。
本發明方法的實施方案之一使用的起始生物為作為野生型或起始生物已經具有一定酮酶活性的非人生物(如如雨生紅球藻、Paracoccusmarcusii、Xanthophyllomyces dendrorhous、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、綠球藻(Chlorococcum)、Phaffia rhodozyma、pheasant′s-eye、Neochloris wimmeri、原管藻(Protosiphon botryoides)、Scotiellopsisoocystiformis、Scenedesmus vacuolatus、Chlorela zofingiensis、Ankistrodesmus braunii、血紅裸藻(Euglena sanguinea)或Bacillusatrophaeus。在該實施方案中，遺傳修飾導致了與野生型或起始生物相比酮酶活性的增加。
當相比于野生型酮酶活性增加時，與野生型相比，在一定時間內由酮酶蛋白質酮酶反應的β-胡蘿卜素的量或生成的角黃素的量也因之增加。
優選地，該酮酶活性的增加至少為野生型酮酶活性的5％，進一步優選為至少20％，進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％，更優選為至少300％，更為優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物以及野生型或參照生物的酮酶活性對植物或微生物材料中酮酶活性的測定，是基于Frazer等(J.Biol.Chem.272(10)6128-6135，1997)的方法。通過使用β-胡蘿卜素和角黃素底物，在脂質(大豆卵磷脂)和去污劑(膽酸鈉)存在的情況下測定植物或微生物提取物的酮酶活性。酮酶分析的底物/產物比例通過HPLC手段檢測。
有多種可以增加酮酶活性的途徑，如通過在翻譯和蛋白質水平關閉抑制性調節機制，或通過提高編碼酮酶核酸相對于野生型的基因表達(例如通過活化劑誘導酮酶基因或通過向生物插入編碼酮酶核酸)。
根據本發明，該實施方案中“提高編碼酮酶核酸的基因表達”也指對該生物自身的內源酮酶表達的調控。這一點可以通過如修飾酮酶編碼基因的啟動子DNA序列來實現。這一修飾可以通過DNA序列的缺失或插入來實現，從而改變或優選增加至少一個內源酮酶基因的表達率。
如上所述，可以通過應用外源刺激來改變至少一種內源酮酶的表達。這一點可以通過特定的生理條件(即通過應用外源物質)來實現。
此外，還可以通過使用野生型生物中不具有的或經修飾的調節蛋白質，與酮酶基因的啟動子相互作用，以增加至少一個內源酮酶基因的表達。
此類調節物可以是如WO 96/06166所描述的由DNA結合結構域和轉錄激活結構域所組成的嵌合蛋白質。
在優選實施方案中，通過提高編碼酮酶核酸的基因表達，較野生型增加酮酶活性。
在另一優選實施方案中，通過向生物插入編碼酮酶核酸來增加編碼酮酶核酸的基因表達。
該實施方案中，與野生型相比，本發明的轉基因生物中至少還存在一另一個酮酶基因。該實施方案中，本發明的遺傳修飾的生物優選具有至少一個編碼酮酶的外源(即異源)核酸，或具有至少兩個編碼酮酶的內源核酸。
根據本發明，在本方法的另一優選實施方案中，使用的起始生物為野生型并不具有酮酶活性的非人生物(如布拉霉、Marigold、萬壽菊、香葉萬壽菊、小萬壽菊、普林萬壽菊、Tagetes palmeri及鐘形萬壽菊)。
在該優選實施方案中，遺傳修飾造成了這些生物中的酮酶活性。該優選實施方案中，與未經遺傳修飾的野生型相比，本發明的遺傳修飾的生物具有酮酶活性，因而優選能夠轉基因表達酮酶。
在該優選實施方案中，與前述增加編碼酮酶核酸的基因表達類似，優選通過向起始生物插入編碼酮酶核酸，造成編碼酮酶核酸的基因表達。
為此，在兩個實施方案中，原則上可以使用各種酮酶基因，即編碼酮酶的各種核酸。
本說明書中提到的所有核酸可以為如RNA、DNA或cDNA序列。
對于真核生物來源的含有內含子的基因組酮酶序列，在宿主生物不能或不能通過改造來表達相應酮酶時，優選使用已經加工的核酸序列，如相應的cDNA。
可以用于本發明方法中的編碼酮酶的核酸及相應酮酶的實例為如以下來源的序列雨生紅球藻，特別是雨生紅球藻Flotow em.Wille(登陸號X86782；核酸SEQ ID NO3，蛋白質SEQ ID NO4)，雨生紅球藻，NIES-144(登陸號D45881；核酸SEQ ID NO35，蛋白質SEQ ID NO36)，橙黃農桿菌(登陸號D58420；核酸SEQ ID NO37，蛋白質SEQ IDNO38)，產堿菌屬種(登陸號D58422；核酸SEQ ID NO39，蛋白質SEQ IDNO40)，Paracoccus marcusii(登陸號Y15112；核酸SEQ ID NO41，蛋白質SEQ ID NO42)。
聚球藻屬PC6803株(登陸號NP442491；核酸SEQ ID NO43，蛋白質SEQ ID NO44)。
慢生根瘤菌屬(登陸號AF218415；核酸SEQ ID NO45，蛋白質SEQ ID NO46)。
念珠藻PCC7120株(登陸號AP003592，BAB74888；核酸SEQ IDNO47，蛋白質SEQ ID NO48)。
雨生紅球藻(登陸號AF534876，AAN03484；核酸SEQ ID NO49，蛋白質SEQID NO50)
副球藻菌MBIC1143(登陸號D58420，P54972；核酸SEQ ID NO51，蛋白質SEQ IDNO52)橙黃短波單胞菌(Brevundimonas aurantiaca)(登陸號AY166610，AAN86030；核酸SEQ ID NO53，蛋白質SEQID NO54)泡沫節球藻(Nodularia spumigena)NSOR10(登陸號AY210783，AAO64399；核酸SEQ ID NO55，蛋白質SEQ ID NO56)點形念珠藻(Nostoc punctiforme)ATCC 29133(登陸號NZ_AABC01000195，ZP_00111258；核酸SEQ ID NO57，蛋白質SEQ ID NO58)點形念珠藻(Nostoc punctiforme)ATCC 29133(登陸號NZ_AABC01000196；核酸SEQ ID NO59，蛋白質SEQID NO60)耐輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)RI(登陸號E75561，AE001872；核酸SEQ ID NO61，蛋白質SEQ IDNO62)，聚球藻屬種WH 8102，核酸Acc.No.NZ_AABD01000001，堿基對1,354,725-1,355,528(SEQID NO75)，蛋白質Acc.No.ZP_00115639(SEQ ID NO76)(注釋為推定的蛋白質)，或自上述序列衍生的序列，例如通過對如序列SEQ ID NO58或SEQ ID NO57的變異/突變產生序列為SEQ ID NO64或66的酮酶以及相應的編碼核酸序列SEQ ID NO63或SEQ ID NO65，通過對如序列SEQ ID NO60或SEQ ID NO59的變異/突變產生序列為SEQ ID NO68或70的酮酶以及相應的編碼核酸序列SEQ ID NO67或SEQ ID NO69，或通過對如序列SEQ ID NO76或SEQ ID NO75的變異/突變產生序列為SEQ ID NO72或74的酮酶以及相應的編碼核酸序列SEQ ID NO71或SEQ ID NO73。
容易發現可用于本發明方法的其它酮酶和酮酶基因的天然實例，例如通過比較數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性(所述數據庫含有前述序列，特別是具有SEQ ID NO4和/或48和/或58和/60的序列)，可以從多種已知基因組序列的生物中發現其它酮酶和酮酶基因。
通過眾所周知的雜交技術，從前述核酸序列起始，特別是從多種基因組序列未知生物的SEQ ID NO3和/或47和/或57和/59的序列起始，可以容易地發現其它酮酶和酮酶基因的天然實例。
該雜交可以在溫和(低嚴緊性)或優選在嚴緊(高嚴緊性)的條件下進行。
該類雜交條件可以應用于該說明書中的所有核酸，在如Sambrook，J.，Fritsch，E.F，Maniatis，T.，《Molecular Cloning(A Laboratory Manual)》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，9.31-9.57或CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中有所描述。
例如，洗滌步驟的條件可以從低嚴緊性(在50℃使用2X SSC)和高嚴緊性(在50℃，優選在65℃使用0.2X SSC)所限定的條件范圍中選擇(20X SSC0.3M檸檬酸鈉，3M氯化鈉，pH7.0)。
此外，還可以將洗滌步驟中的溫度從溫和條件的室溫(22℃)升至嚴緊條件的65℃。
可以同時改變鹽濃度和溫度兩參數，也可以保持其中之一恒定，只改變另一個。在雜交過程中也可以使用變性劑(如甲酰胺或SDS)。若為50％甲酰胺，優選在42℃下進行雜交。
以下給出了一些雜交條件和洗滌步驟的代表性條件
(1)雜交條件，例如(i)65℃、4X SSC，或(ii)45℃、6X SSC，或(iii)68℃、6X SSC、100mg/ml變性魚精DNA，或(iv)68℃、6X SSC、0.5％SDS、100mg/ml變性且片段化的鮭精DNA，或(v)42℃、6X SSC、0.5％SDS、100mg/ml變性且片段化的鮭精DNA、50％甲酰胺，或(vi)42℃、50％甲酰胺、4X SSC，或(vii)42℃、50％(vol/vol)甲酰胺、0.1％牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)、750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉，或(viii)50℃、2X或4X SSC(溫和條件)，或(ix)42℃、30至40％甲酰胺、2X或4X SSC(溫和條件)。
(2)在以下條件進行10分鐘的洗滌步驟，例如，(i)50℃、0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％SDS，或(ii)65℃、0.1X SSC，或(iii)68℃、0.1X SSC、0.5％SDS，或(iv)42℃、0.1X SSC、0.5％SDS、50％甲酰胺，或(v)42℃、0.2X SSC、0.1％SDS，或(vi)65℃、2X SSC(溫和條件)。
在本發明方法的一個優選實施方案中，插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO4氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO4序列在氨基酸水平上的同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少90％、更優選至少95％、更優選至少97％、更優選至少98％，特別優選至少99％，且所述蛋白質具有酮酶的酶促性質。
同時，該酮酶序列可以為天然序列，該序列可以如前述通過與其它生物來源的序列同一性比較獲得；或酮酶序列可以是對SEQ ID NO4序列通過合成變異(如氨基酸的替換、插入或缺失)修飾而成的合成序列。
本發明方法的另一個優選實施方案應用編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO48氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO48序列在氨基酸水平上的同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少90％、更優選至少95％、更優選至少97％、更優選至少98％，特別優選至少99％，且所述蛋白質具有酮酶的酶促性質。
同時，該酮酶序列可以為天然序列，該序列可以如前述通過與其它生物來源的序列同一性比較獲得；或酮酶序列可以是對SEQ ID NO48序列通過合成變異(如氨基酸的替換、插入或缺失)修飾而成的合成序列。
在本發明方法的另一個優選實施方案中，插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO58氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO58序列在氨基酸水平上的同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少90％、更優選至少95％、更優選至少97％、更優選至少98％，特別優選至少99％，且所述蛋白質具有酮酶的酶促性質。
同時，該酮酶序列可以為天然序列，該序列可以如前述通過與其它生物來源的序列同一性比較獲得；或酮酶序列可以是對SEQ ID NO58序列通過合成變異(如氨基酸的替換、插入或缺失)修飾而成的合成序列。
在本發明方法的另一個優選實施方案中，插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO60氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO60序列在氨基酸水平上的同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少90％、更優選至少95％、更優選至少97％、更優選至少98％，特別優選至少99％，且所述蛋白質具有酮酶的酶促性質。
同時，該酮酶序列可以為天然序列，該序列可以如前述通過與其它生物來源的序列同一性比較獲得；或酮酶序列可以是對SEQ ID NO60序列通過合成變異(如氨基酸的替換、插入或缺失)修飾而成的合成序列。
對于本說明書中的所有蛋白質，術語“替換”是指一個或多個氨基酸被一個或多個氨基酸所替換。優選進行“保守性取代”，其中替換的氨基酸與原始氨基酸具有相似的性質，如Glu被Asp、Gln被Asn、Val被Ile、Leu被Ile、Ser被Thr所替換。
“缺失”是指一個氨基酸直接被鍵所取代。優選的缺失位置為多肽的末端，以及單獨蛋白質結構域間的連接處。
“插入”是指將氨基酸插入多肽鏈中，其中原直接連接被一個或多個氨基酸所取代。
“兩種蛋白質間的同一性”是指各蛋白質全長中的氨基酸同一性，尤其是使用Informax(USA)提供的vector NTI 7.1版軟件和clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignmentson a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2)151-1)，設定下述參數，通過比較計算出的同一性多重比對參數空位開放罰分(gap opening penalty)10空位擴展罰分(gap extension penalty) 10空位分離罰分范圍 8空位分離罰分(gap separation penalty) 關閉校正延遲的同一性％ 40(％identity for alignment delay)殘基特異性空位(Residae specific gap) 關閉親水殘基空位(Hydrophilic rdsidae gap)關閉轉換權重(transition weighing)0成對比對參數FAST運算法則 使用K-tuple尺寸 1空位罰分 3
窗口尺寸 5最佳對角線數目(Number of best diagonals) 5因此，在氨基酸水平上與序列SEQ ID NO4或48或58或60具有至少70％同一性的蛋白質，是指其序列與SEQ ID NO4或48或58或60的序列相比較(特別是根據上述程序對數)具有至少70％上述設置參數的同一性。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法，獲取合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO3序列的核酸插入植物中。
在另一個特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO48序列的核酸插入植物中。
在另一個特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO58序列的核酸插入植物中。
在另一個特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO60序列的核酸插入植物中。
還可以通過公知的方法，從核苷酸結構單元開始進行化學合成來制備上述所有酮酶基因，例如利用單個重疊互補的雙螺旋核酸結構單元的片段縮合來制備。通過如已知的亞磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley PressNew York，896-897頁)可以化學合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填補空位、連接反應和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloningA laboratory manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。
如上所述，本發明的方法中使用的非人生物與野生型相比具有修飾的酮酶活性以及修飾的β環化酶活性，該修飾的β環化酶活性源于該β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
根據本發明，該方法的實施方案之一使用的起始生物為作為野生型或起始生物已經具有一定β環化酶活性的非人生物。在該實施方案中，遺傳修飾引入了高于野生型或起始生物的β環化酶活性。該增加的β環化酶活性源于該β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
β環化酶活性是指β環化酶的酶活性。
β環化酶是指一種蛋白質，其具有將末端的番茄紅素線性殘基轉化為β-芷香酮環的酶活性。
具體而言，β環化酶指具有將γ-胡蘿卜素轉化成β-胡蘿卜素的酶活性的蛋白質。
因此，β環化酶活性是指在一定時間內由β環化酶蛋白質轉化的γ-胡蘿卜素的量，或生成的β-胡蘿卜素的量。
當β環化酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由β環化酶蛋白質轉化的番茄紅素或γ-胡蘿卜素的量或由番茄紅素生成的γ-胡蘿卜素的量或由γ-胡蘿卜素生成的β-胡蘿卜素的量也因之增加。
優選增加的β環化酶活性至少為野生型β環化酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的β環化酶活性根據Fraser和Sandmann的方法(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)在體外測定β環化酶活性。將作為緩沖液的磷酸鉀(pH 7.6)、作為底物的番茄紅素、及紅辣椒(paprika)基質蛋白質、NADP+、NADPH和ATP加入特定量的生物提取物中。
特別優選在Bouvier、d′Harlingue和Camara(Molecular Analysis ofcarotenoid cyclase inhibition；Arch.Biochem.Biophys.346(1)(1997)53-64)的下述條件測定β環化酶活性在250μl的體積中進行體外測定。反應物含有50mM磷酸鉀(pH 7.6)、不同量的生物提取物、20nM番茄紅素、250μg紅辣椒有色體基質蛋白質、0.2mM NADP+、0.2mM NADPH和1mM ATP。將NADP/NADPH和ATP溶解于含有1mg Tween 80的10ml乙醇后加入孵育介質。30℃下反應60分鐘后，加入氯仿/甲醇(2∶1)終止反應。反應產物經氯仿抽提后通過HPLC分析。
Fraser和Sandmann描述了另一種使用放射性底物的測定(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)。
可以通過多種途徑增加β環化酶的活性，如通過關閉在表達及蛋白質水平的抑制性調節機制或增加編碼β環化酶的核酸相對于野生型的基因表達，所述β環化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列、或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
同樣，有多種途徑可以相對于野生型增加編碼β環化酶核酸的基因表達，例如通過活化劑誘導β環化酶基因，或向生物插入一個或多個β環化酶基因拷貝，即向生物插入至少一個編碼β環化酶的核酸，所述β環化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
根據本發明，增加編碼β環化酶核酸的基因表達也指對該生物自身的內源β環化酶表達的調控，所述β環化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
可以通過如修飾β環化酶編碼基因的啟動子DNA序列來實現這一調控。所述修飾可以通過如DNA序列的缺失或插入來完成，從而提高基因的表達率。
如上所述，可以通過應用外源刺激來改變內源β環化酶的表達。這一點可以通過特定的生理條件(即通過應用外源物質)來實現。
此外，還可以通過使用未轉化生物中不具有的調節蛋白質，與該基因的啟動子相互作用，以修飾或增加內源β環化酶基因的表達。
此類調節物可以是如WO 96/06166所描述的由DNA結合結構域和轉錄激活結構域所組成的嵌合蛋白質。
在優選實施方案中，通過向生物插入至少一個編碼β環化酶的核酸來增加編碼β環化酶核酸的基因表達，所述β環化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
該實施方案中，與野生型相比，本發明的轉基因生物中至少還存在另一個β環化酶基因。該實施方案中，本發明的遺傳修飾的生物優選具有至少一個編碼β環化酶的外源(即異源)核酸，或具有至少兩個編碼β環化酶的內源核酸。
在本發明方法的另一優選實施方案中，使用的起始生物為野生型并不具有β環化酶活性的非人生物。在該次優選的實施方案中，遺傳修飾造成了生物中的β環化酶活性。該實施方案中，與未遺傳修飾的野生型相比，本發明的遺傳修飾的生物具有β環化酶活性，因而優選能夠轉基因表達β環化酶。
在該優選實施方案中，與前述增加編碼β環化酶核酸的基因表達類似，優選通過向起始生物插入編碼β環化酶的核酸造成編碼β環化酶核酸的基因表達。
為此，在兩個實施方案中，原則上可以使用各種β環化酶基因，即編碼β環化酶的各種核酸，所述β環化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列，或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
對于真核生物來源的含有內含子的基因組β環化酶序列，在宿主生物不能或不能通過改造來表達相應β環化酶時，優選使用已經加工的核酸序列，如相應的cDNA。
特別優選的β環化酶為番茄來源的色素細胞特異性β環化酶(AAG21133)(核酸SEQ ID NO1；蛋白質SEQ ID NO2)。
根據本發明，可以使用的β環化酶基因是編碼如下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者與SEQ ID NO2序列在氨基酸水平上的同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有β環化酶的酶促性質。
容易發現可用于本發明方法的β環化酶和β環化酶基因的其他實例，例如如上所述比較數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列與SEQ ID NO2的同一性，可以從多種已知基因組序列的生物中發現其它β環化酶和β環化酶基因。
利用雜交和PCR技術，從多種基因組序列未知生物的SEQ ID NO1序列起始，通過已知的方法可以容易地發現其它β環化酶和β環化酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加β環化酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有SEQ ID NO2序列的β環化酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法，獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子，是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO1序列的核酸插入生物中。
還可以通過公知的方法，從核苷酸結構單元開始進行化學合成來制備上述所有β環化酶基因，例如利用單個重疊互補的雙螺旋核酸結構單元的片段縮合來制備。通過如已知的亞磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897頁)可以化學合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填補空位、連接反應和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloningA laboratory manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。
在優選實施方案中培養非人生物，所述生物與其野生型相比，除了具有修飾的酮酶活性和修飾的β環化酶活性，還具有改良的羥化酶活性。
“與野生型相比改良的羥化酶活性”，在起始生物或野生型不具羥化酶活性的情況下，應優選理解為“與野生型相比造成的羥化酶活性”。
“與野生型相比改良的羥化酶活性”，在起始生物或野生型具有羥化酶活性的情況下，應優選理解為“與野生型相比增加的羥化酶活性”。
因此，在優選實施方案中培養非人生物，所述生物與其野生型相比，除了具有修飾的酮酶活性和修飾的β環化酶活性，還具有造成的或增加的羥化酶活性。
羥化酶活性是指羥化酶的酶活性。
羥化酶是指一種蛋白質，其具有在任選取代的類胡蘿卜素β-芷香酮環上引入羥基的酶活性。
具體而言，羥化酶指具有將β-胡蘿卜素轉化成玉米黃質或將角黃素轉化成蝦青素的酶活性的蛋白質。
據此，羥化酶活性是指在一定時間內由羥化酶蛋白質轉化的β-胡蘿卜素或角黃素的量，或生成的玉米黃質或蝦青素的量。
當羥化酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質羥化酶轉化的β-胡蘿卜素或角黃素的量或生成的玉米黃質或蝦青素的量也因之增加。
優選地，該羥化酶活性的增加至少為野生型羥化酶活性的5％，進一步優選為至少20％，進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％，更優選為至少300％，甚至更優選至少為500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物以及野生型或參照生物的羥化酶活性根據Bouvier等的方法(Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)在體外測定羥化酶活性。將鐵氧化還原蛋白、鐵氧化還原蛋白-NADP氧化還原酶、過氧化氫酶、NADPH和β-胡蘿卜素及單-和雙半乳糖苷甘油加入特定量的生物提取物中。
特別優選在Bouvier、Keller、d′Harlingue和Camara(Xanthophyllbiosynthesismolecular and functional characterization of carotenoidhydroxylases from pepper fruits(Capsicum annuum L.)；Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)的下述條件測定羥化酶活性在0.250ml的體積中進行體外測定。反應物含有50mM磷酸鉀(pH7.6)、0.025mg菠菜鐵氧化還原蛋白、0.5單位鐵氧化還原蛋白-NADP+氧化還原酶、0.25mM NADPH、0.010mg β-胡蘿卜素(在0.1mg Tween 80中乳化)、0.05mM的單/雙半乳糖苷甘油混合物(1∶1)、1單位過氧化氫酶、0.2mg胎牛血清白蛋白和不同體積的生物提取物。將反應混合物在30℃孵育2小時。反應產物經有機溶劑(如丙酮或氯仿/甲醇(2∶1))抽提后通過HPLC測定。
可以通過多種途徑實現羥化酶活性的增加或造成，如通過關閉在表達及蛋白質水平的抑制性調節機制或相對于野生型增加或造成羥化酶編碼核酸的基因表達。
同樣，有多種途徑可以實現羥化酶編碼核酸的基因表達相對于野生型的增加或造成，例如通過活化劑誘導羥化酶基因，或向生物插入一個或多個羥化酶基因拷貝，即向生物插入至少一個編碼羥化酶的核酸。
根據本發明，增加羥化酶編碼核酸的基因表達也指對該生物自身的內源羥化酶表達的調控。
可以通過如修飾羥化酶編碼基因的啟動子DNA序列來實現這一調控。所述修飾可以通過如DNA序列的缺失或插入來完成，從而提高基因的表達率。
如上所述，可以通過應用外源刺激來改變內源β環化酶的表達。這一點可以通過特定的生理條件(即通過應用外源物質)來實現。
此外，還可以通過使用未轉化生物中不具有的調節蛋白質，與該基因的啟動子相互作用，以造成或增加內源羥化酶基因的表達。
此類調節物可以是如WO 96/06166所描述的由一個DNA結合結構域和一個轉錄激活結構域所組成的嵌合蛋白質。
在優選的實施方案中，通過向生物插入至少一個羥化酶編碼核酸來增加或造成羥化酶編碼核酸的基因表達。
為此，原則上可以使用各種羥化酶基因，即編碼羥化酶的各種核酸。
對于真核生物來源的含有內含子的基因組羥化酶序列，在宿主生物不能或不能通過改造來表達相應羥化酶時，優選使用已經加工的核酸序列，如相應的cDNA。
羥化酶基因的實例如雨生紅球藻來源的羥化酶編碼核酸(登陸號AX038729，WO 0061764)；(核酸SEQ ID NO77，蛋白質SEQ ID NO78)。
以及以下登陸號的羥化酶|emb|CAB55626.1、CAA70427.1、CAA70888.1、CAB55625.1、AF499108_1、AF315289_1、AF296158_1、AAC49443.1、NP_94300.1、NP_200070.1、AAG10430.1、CAC06712.1、AAM88619.1、CAC95130.1、AAL80006.1、AF162276_1、AAO53295.1、AAN85601.1、CRTZ_ERWHE、CRTZ_PANAN、BAB79605.1、CRTZ_ALCSP、CRTZ_AGRAU、CAB56060.1、ZP_00094836.1、AAC44852.1、BAC77670.1、NP_745389.1、NP_344225.1、NP_849490.1、ZP_00087019.1、NP_503072.1、NP_852012.1、NP_115929.1、ZP_00013255.1。
此外，特別優選的羥化酶為番茄來源的羥化酶(登陸Y14810)(核酸SEQ ID NO5；蛋白質SEQ ID NO6)。
該優選實施方案中，與野生型相比，本發明的優選轉基因生物中至少還存在另一個羥化酶基因。
該優選實施方案中，遺傳修飾的生物具有如至少一個編碼羥化酶的外源(即異源)核酸，或具有至少兩個編碼羥化酶的內源核酸。
優選地，上述優選實施方案中可以使用的羥化酶基因是編碼如下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO6氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者與SEQ ID NO6序列在氨基酸水平上的同一性為至少70％、優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有羥化酶的酶促性質。
容易發現羥化酶和羥化酶基因的其他實例，例如如上所述比較數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列與SEQ ID NO6的同一性，可以從多種已知基因組序列的生物中發現其它羥化酶和羥化酶基因。
利用雜交和PCR技術，從多種基因組序列未知生物的SEQ ID NO5序列起始，通過已知的方法可以容易地發現其它羥化酶和羥化化酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加羥化酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO6的羥化酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法，獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO5序列的核酸插入生物中。
還可以通過公知的方法，從核苷酸結構單元開始進行化學合成來制備上述所有羥化酶基因，例如利用單個重疊互補的雙螺旋核酸結構單元的片段縮合來制備。通過如已知的亞磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley PressNew York，896-897頁)可以化學合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填補空位、連接反應和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloningA laboratory manual)》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。
特別優選地，本發明的方法使用起始生物時具有β環化酶活性而無酮酶活性的遺傳修飾的非人生物，與野生型相比，遺傳修飾的生物的β環化酶活性有所增加，且具有造成的酮酶活性，其中β環化酶活性增加是由于β環化酶所致，該β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特別優選地，本發明的方法還使用起始生物時缺乏β環化酶活性及酮酶活性的遺傳修飾的非人生物，與野生型相比，遺傳修飾的生物具有造成的β環化酶活性及酮酶活性，其中β環化酶活性的造成是由于β環化酶所致，該β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特別優選地，本發明的方法還使用起始生物時具有β環化酶活性及酮酶活性的遺傳修飾的非人生物，與野生型相比，遺傳修飾的生物的β環化酶活性及酮酶活性均有所增加，其中β環化酶活性的增加是由于β環化酶所致，所述β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特別優選地，本發明的方法還使用起始生物時具有β環化酶活性但不具有酮酶活性及羥化酶活性的遺傳修飾的非人生物，與野生型相比，遺傳修飾的生物的β環化酶活性有所增加，具有造成的酮酶活性及羥化酶活性，其中β環化酶活性的增加是由于β環化酶所致，所述β環化酶含有SEQ IDNO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特別優選地，本發明的方法還使用起始生物時具有β環化酶及羥化酶活性但不具有酮酶活性的遺傳修飾的非人生物，與野生型相比，遺傳修飾的生物的β環化酶活性及羥化酶活性有所增加，具有造成酮酶活性。其中β環化酶活性的增加是由于β環化酶所致，所述β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特別優選地，本發明的方法還使用起始生物時缺乏β環化酶活性、羥化酶活性及酮酶活性的遺傳修飾的非人生物，與野生型相比，遺傳修飾的生物具有造成的β環化酶活性、羥化酶活性及酮酶活性。其中β環化酶活性的造成是由于β環化酶所致，所述β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特別優選地，本發明的方法還使用起始生物時具有β環化酶活性、羥化酶活性及酮酶活性的遺傳修飾的非人生物，與野生型相比，遺傳修飾的生物的β環化酶活性、羥化酶活性及酮酶活性均有所增加。其中β環化酶活性的增加是由于β環化酶所致所述β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
在另一個優選實施方案中，培養遺傳修飾的非人生物，所述生物與野生型相比還具有至少一種選自以下的活性增加HMG-CoA還原酶活性、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性、異戊烯二磷酸酯Δ-異構酶活性、牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、八氫番茄紅素合酶活性、八氫番茄紅素去飽和酶活性、ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性以及MinD活性。
HMG-CoA還原酶活性是指HMG-CoA還原酶(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶)的酶活性。
HMG-CoA還原酶是指一種蛋白質，其具有可將3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉化為甲羥戊酸的酶活性。
據此，HMG-CoA還原酶活性是指一定時間內由HMG-CoA還原酶蛋白質反應的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的量或生成的甲羥戊酸的量。
當HMG-CoA還原酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質HMG-CoA還原酶轉化的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的量或生成的甲羥戊酸的量也因之增加。
優選增加的HMG-CoA還原酶活性至少為野生型HMG-CoA還原酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的HMG-CoA還原酶活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
根據已發表的描述(如Schaller，Grausem，Benveniste，Chye，Tan，Song和Chua，Plant Physiol.109(1995)，761-770；Chappell，Wolf，Proulx，Cuellar和Saunders，Plant Physiol.109(1995)1337-1343)，能夠測定HMG-CoA還原酶活性。可以在冷緩沖液(100mM磷酸鉀(pH 7.0)、4mMMgCl2、5mM DTT)中對生物組織進行勻漿和抽提。將勻漿液在4℃、10 000g離心15分鐘。隨后將上清液以100 000g離心45-60分鐘。測定上清液和微粒體級分的沉淀(重懸于100mM磷酸鉀(pH 7.0)和50mMDTT之后)中HMG-CoA還原酶活性。將溶液和懸浮液(懸浮液中蛋白質含量相當于約1-10μg)的等分試樣于30℃在100mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0，含3mM NADPH和20μM(14C)HMG-CoA(58μCi/μM)，理想體積為26μl)中孵育15-60分鐘。加入5μl甲羥戊酸內酯(1mg/ml)和6NHCl終止反應。隨后將混合物在室溫下孵育15分鐘。加入125μl飽和磷酸鉀溶液(pH 6.0)及300μl乙酸乙酯，以定量反應中形成的(14C)甲羥戊酸。將混合物充分混合并離心。通過閃爍測量測定放射性。
(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶(也稱作lytB或IspH)活性，是指(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的酶活性。
(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶是指一種蛋白質，其具有可將(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯轉化為異戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的酶活性。
據此，(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯活性是指一定時間內由(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶蛋白質反應的(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯的量或生成的異戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基二磷酸酯的量。
當(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶轉化的(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯的量或生成的異戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基二磷酸酯的量也因之增加。
優選增加的(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性至少為野生型(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
通過免疫檢測方法可以測定(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的活性。Rohdich及其同事(Rohdich，Hecht，G_rtner，Adam，Krieger，Amslinger，Arigoni，Bacher和EisenreichStudies on the nonmevalonateterpene biosynthetic pathwaymetabolic role of IspH(LytB)protein，Natl.Acad.Natl.Sci.USA 99(2002)，1158-1163)已經描述了特異性抗體的制備。關于催化活性的測定，Altincicek及其同事(Altincicek，Duin，Reichenberg，Hedderich，Kollas，Hintz，Wagne，Wiesner，Beck和JomaaLytB proteincatalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathway of isoprenoid biosynthesis；FEBS Letters 532(2002)437-440)描述了一種監測(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原為異戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的體外系統。
1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性是指1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的酶活性。
1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶是指一種蛋白質，其具有將羥乙基ThPP和3-磷酸甘油醛轉化為1-脫氧-D-木糖-5-磷酸的酶活性。
據此，1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性是指在一定時間內由1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶蛋白質轉化的羥乙基ThPP和/或3-磷酸甘油醛的量或形成的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸的量。
當1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶轉化的羥乙基ThPP和/或3-磷酸甘油醛的量，或形成的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸的量也因之增加。
優選增加的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性至少為野生型1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性
在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
用于測定D-1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶活性(DXS)的反應混合物(50-200μl)中含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3mM ATP、1mM硫胺素二磷酸酯、0.1％Tween-60、1mM氟化鉀、30μM(2-14C)丙酮酸(0.5μCi)、0.6mM DL-3-磷酸甘油醛。37℃下將生物提取物在反應溶液中孵育1-2小時。隨后加熱至80℃持續3分鐘以終止反應。在13 000轉/分鐘下離心5分鐘后，蒸發上清液，將殘留物重懸于50μl甲醇，鋪于TLC板進行薄層層析(硅膠60，Merck，Darmstadt)，并在正丙醇/乙酸乙酯/水(6∶1∶3；v/v/v)中進行分離。在此過程中，放射性標記的D-1-脫氧木酮糖-5-磷酸(或D-1-脫氧木酮糖)與(2-14C)-丙酮酸得以分離。利用閃爍計數器進行定量。該法描述于Harker和Bramley(FEBS Letters 448(1999)115-119)。另外，測定DXS合酶活性的熒光測定法已由Querol及其同事描述(Analytical Biochemistry 296(2001)101-105)。
1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶(也稱為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶)活性是指1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的酶活性。
1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶是指一種蛋白質，其具有將1-脫氧-D-木糖-5-磷酸轉化為2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的酶活性。
據此，1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性是指在一定時間內由蛋白質1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶轉化的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸的量，或形成的2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的量。
當1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶轉化的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸的量或形成的2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的量也因之增加。
優選增加的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性至少為野生型1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
在下述緩沖液中測定D-1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構酶(DXR)的活性，所述緩沖液含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM MnCl2、0.3mMNADPH和0.3mM 1-脫氧-D-木酮糖-4-磷酸，其中1-脫氧-D-木酮糖-4-磷酸能夠經酶合成(如Kuzuyama，Takahashi，Watanabe和SetoTetrahedonletters 39(1998)4509-4512)。加入生物提取物開始反應。反應體積一般可為0.2至0.5ml；37℃孵育30-60分鐘。此間，用分光光度計在340nm處監控NADPH的氧化。
異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶活性是指異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的酶活性。
異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶是指一種蛋白質，其具有將異戊烯基二磷酸酯轉化為二甲基烯丙基磷酸酯的酶活性。
據此，異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶活性是指在一定時間內由異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶轉化的異戊烯基二磷酸酯的量或形成的二甲基烯丙基磷酸酯的量。
當異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶轉化的異戊烯基二磷酸酯的量或形成的二甲基烯丙基磷酸酯的量也因之增加。
優選增加的異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶活性至少為野生型異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
根據Fraser及其同事公開的方法(Fraser，R_mer，Shipton，Mills，Kiano，Misawa，Drake，Schuch和BramleyEvaluation of transgenictomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specificmanner；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，1092-1097，基于Fraser，Pinto，Holloway和Bramley，Plant Journal 24(2000)，551-558)，可以測定異戊烯基二磷酸酯異構酶(IPP異構酶)的活性。為進行酶測定，在含有1mM DTT、4mM MgCl2、6mM MnCl2、3mM ATP、0.1％Tween-60、1mM氟化鉀的0.4M Tris-HCl(pH 8.0)中(體積為大約150-500μl)，以0.5μCi(1-14C)IPP(異戊烯基焦磷酸酯)(56mCi/mmol，Amersham plc)為底物進行孵育。將提取物與緩沖液混合(例如以1∶1的比例)并在28℃孵育至少5小時。隨后加入約200μl甲醇，并通過加入濃鹽酸(終濃度為25％)在37℃進行約1小時酸水解。然后使用石油醚(與10％二乙醚混合)進行兩次抽提(每次500μl)。利用閃爍計數器測定上層等分試樣中的放射性。通過5分鐘的短期孵育能夠測定特異酶活性，因為短的反應時間抑制反應副產物生成(見Lützow和BeyerThe isopentenyl phosphate Δ-isomeraseand its relation to the phytoene synthase complex in daffodil chromoplasts；Biochim.Biophys.Acta 959(1988)，118-126)。
牻牛兒基二磷酸酯合酶活性是指牻牛兒基二磷酸酯合酶的酶活性。
牻牛兒基二磷酸酯合酶是指一種蛋白質，其具有將異戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基磷酸酯轉化為牻牛兒基二磷酸酯的酶活性。
據此，牻牛兒基二磷酸酯合酶活性是指在一定時間內由牻牛兒基二磷酸酯合酶蛋白質轉化的異戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基磷酸酯的量或形成的牻牛兒基二磷酸酯的量。
當牻牛兒基二磷酸酯合酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質牻牛兒基二磷酸酯合酶轉化的異戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基磷酸酯的量，或形成的牻牛兒基二磷酸酯的量也因之增加。
優選增加的牻牛兒基二磷酸酯合酶活性至少為野生型牻牛兒基二磷酸酯合酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物以及野生型或參照生物的牻牛兒基二磷酸酯合酶的活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
向50mM Tris-HCl(pH 7.6)、10mM MgCl2、5mM MnCl2、2mMDTT、1mMATP、0.2％Tween-20、5μM(14C)IPP和50μM DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸酯)中加入生物提取物，能夠測定牻牛兒基二磷酸酯合酶(GPP合酶)的活性(根據Bouvier，Suire，d’Harlingue，Backhaus和CamaraMolecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentationof monoterpene synthesis in plant cells，Plant Journal 24(2000)241-252)。在如37℃下孵育2小時后，將反應產物去磷酸化(根據Koyama、Fuji和OguraEnzymatic hydrolysis of polyprenyl pyrophosphates，MethodsEnzymol.110(1985)，153-155)，利用薄層層析法和放射性摻入測定法進行分析(Dogbo，Bardat，Quennemet和CamaraMetabolism of plastidterpenoidsIn vitro inhibition of phytoene synthesis by phenethylpyrophosphate derivates，FEBS Letters 219(1987)211-215)。
法呢基二磷酸酯合酶活性是指法呢基二磷酸酯合酶的酶活性。
法呢基二磷酸酯合酶是指一種蛋白質，其具有依次將2分子異戊烯基二磷酸酯與二甲基烯丙基二磷酸酯反應，所生成的牻牛兒基二磷酸酯再轉化為法呢基二磷酸酯的酶活性。
據此，法呢基二磷酸酯合酶活性是指在一定時間內由蛋白質法呢基二磷酸酯合酶轉化的二甲基烯丙基二磷酸酯和/或異戊烯基二磷酸酯的量，或形成的法呢基二磷酸酯的量。
當法呢基二磷酸酯合酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質法呢基二磷酸酯合酶轉化的二甲基烯丙基二磷酸酯和/或異戊烯基二磷酸酯的量，或形成的法呢基二磷酸酯的量也因之增加。
優選增加的法呢基二磷酸酯合酶活性至少為野生型法呢基二磷酸酯合酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的法呢基二磷酸酯合酶的活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
根據Joly和Edwards的方法能夠測定法尼基焦磷酸酯合酶(FPP合酶)的活性(Journal of Biological Chemistry 268(1993)，26983-26989)。即，在含有10mM HEPES(pH 7.2)、1mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇、20μM牻牛兒基焦磷酸酯和40μM(1-14C)異戊烯基焦磷酸酯(4Ci/mmol)的緩沖液中測定酶活性。將反應混合物在37℃孵育；加入2.5N HCl(在含有19μg/ml法呢醇的70％乙醇中)終止反應。隨后通過酸水解在37℃水解反應產物30分鐘。加入10％NaOH中和混合物，并通過與己烷振蕩進行抽提。利用閃爍計數器測量己烷相的等分試樣以確定摻入的放射性。
或者，將生物提取物與放射性標記的IPP孵育之后，在苯/甲醇(9∶1)中通過薄層層析(Silica-Gel SE60，Merck)分離反應產物。洗脫放射性標記的產物并測定其放射活性(根據Gaffe，Bru，Causse，Vidal，Stamitti-Bert，Carde和GallusciLEFPS1，a tomato farnesyl pyrophosphate gene highlyexpressed during early fruit development；Plant Physiology 123(2000)1351-1362)。
牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性是指牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的酶活性。
牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶是指一種蛋白質，其具有將法呢基二磷酸酯和異戊烯基二磷酸酯轉化為牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯的酶活性。
據此，牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性是指在一定時間內由蛋白質牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶轉化的法呢基二磷酸酯和/或異戊烯基二磷酸酯的量，或形成的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯的量。
當牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶轉化的法呢基二磷酸酯和/或異戊烯基二磷酸酯的量，或形成的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯的量也因之增加。
優選增加的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性至少為野生型活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
可以根據Dogbo和Camara所述的方法測定牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸酯合酶(GGPP合酶)的活性(Biochim.Biophys.Acta 920(1987)，140-148Purification of isopentenyl pyrophosphate isomerase and geranylgeranylpyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts by affinitychromatography)。為此，將總體積約為200μl的生物提取物加入緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.6)、2mM MgCl2、1mM MnCl2、2mM二硫蘇糖醇、(1-14C)IPP(0.1μCi、10μM)、15μM DMAPP、GPP或FPP)中。在30℃孵育1-2小時(或更長)。加入0.5ml乙醇和0.1ml 6N HCl終止反應。37℃孵育10分鐘之后，用6N NaOH中和反應混合物，與1ml水混合并用4ml乙醚振蕩進行抽提。利用閃爍計數測定乙醚相等分試樣(如0.2ml)中的放射活性。或者在酸水解之后，可通過在乙醚中振蕩抽提放射性標記的異戊二烯醇，并利用HPLC(25cm Spherisorb ODS-1柱，5μm；用甲醇/水(90∶10；v/v)以1ml/分鐘的流速洗脫)分離，并通過放射活性監測進行定量(Wiedemann，Misawa和SandmannPurification and enzymaticcharacterization of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase fromErwinia uredovora after expression in Escherichia coli；ArchivesBiochemistry and Biophysics 306(1993)，152-157)。
八氫番茄紅素合酶活性是指八氫番茄紅素合酶的酶活性。
具體而言，八氫番茄紅素合酶是指一種具有將牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯轉化為八氫番茄紅素的酶活性的蛋白質。
據此，八氫番茄紅素合酶活性是指在一定時間內由蛋白質八氫番茄紅素合酶轉化的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯的量，或形成的八氫番茄紅素的量。
當八氫番茄紅素合酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質八氫番茄紅素合酶轉化的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯的量，或形成的八氫番茄紅素的量也因之增加。
優選增加的八氫番茄紅素合酶活性至少為野生型八氫番茄紅素合酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的八氫番茄紅素合酶的活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7-4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
根據Fraser及其同事所發表的方法能夠測定八氫番茄紅素合酶(PSY)活性(Fraser，Romer，Shipton，Mills，Kiano，Misawa，Drake，Schuch和BramleyEvaluation of transgenic tomato plants expressing an additionalphytoene synthase in a fruit-specific manner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，1092-1097，基于Fraser，Pinto，Holloway和Bramley，Plant Journal24(2000)551-558)。為測定酶，在含有1mM DTT、4mM MgCl2、6mMMnCl2、3mM ATP、0.1％Tween-60、1mM氟化鉀的0.4M Tris-HCl(pH 8.0)中，以(3H)牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸酯(15mCi/mM，AmericanRadiolabeled Chemicals，St.Louis)為底物進行孵育。將生物提取物與緩沖液混合，例如將295μl緩沖液與提取物混合使總體積為500μl。該混合物在28℃孵育至少5小時。隨后用氯仿兩次(每次500μl)振蕩抽提八氫番茄紅素。通過薄層層析法，在甲醇/水(95∶5；v/v)的二氧化硅板上分離反應中形成的放射性標記的八氫番茄紅素。富碘環境下(通過加熱幾塊碘晶體)可以在二氧化硅板上鑒定八氫番茄紅素。以八氫番茄紅素標準品作為參照。通過閃爍計數器測定法檢測放射性標記產物的量。或者，也可以利用裝有放射性探測器的HPLC定量八氫番茄紅素(Fraser、Albrecht和SandmannDevelopment of high performance liquid chromatographic systems for theseparation of radiolabeled carotenes and precursors formed in specificenzymatic reactions；J.Chromatogr.645(1993)265-272)。
八氫番茄紅素去飽和酶活性是指八氫番茄紅素去飽和酶的酶活性。
八氫番茄紅素去飽和酶是指一種蛋白質，其具有將八氫番茄紅素轉化為六氫番茄紅素和/或將六氫番茄紅素轉化為ζ-胡蘿卜素(zeta-胡蘿卜素)的酶活性。
據此，八氫番茄紅素去飽和酶活性是指在一定時間內由蛋白質八氫番茄紅素去飽和酶轉化的八氫番茄紅素或六氫番茄紅素的量，或形成的六氫番茄紅素或ζ-胡蘿卜素的量。
當八氫番茄紅素去飽和酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質八氫番茄紅素去飽和酶轉化的八氫番茄紅素或六氫番茄紅素的量，或形成的六氫番茄紅素或ζ-胡蘿卜素的量也因之增加。
優選增加的八氫番茄紅素去飽和酶活性至少為野生型八氫番茄紅素去飽和酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的八氫番茄紅素去飽和酶活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
將放射性標記的(14C)-八氫番茄紅素插入不飽和胡蘿卜素中能夠測定八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)的活性(根據R_mer，Fraser，Kiano，Shipton，Misawa，Schuch和Bramley Elevation of the provitamin A content oftransgenic tomato plants；Nature Biotechnology 18(2000)666-669)。可如Fraser所述合成放射性標記的八氫番茄紅素(Fraser，De la Rivas，Mackenzie，BramleyPhycomyces blakesleanus CarB mutantstheir use inassays of phytoene desaturase；Phytochemistry 30(1991)，3971-3976)。可在含有10mM MgCl2和1mM二硫蘇糖醇的100mM MES緩沖液(pH 6.0)(總體積為1ml)中孵育靶組織的質體膜。加入溶于丙酮中的(14C)八氫番茄紅素(每例中每次孵育約100000裂變/分鐘)，其中丙酮濃度不超過5％(v/v)。將混合物在28℃下暗處振蕩孵育約6-7小時。隨后，用約5ml石油醚(與10％乙醚混合)抽提色素三次并通過HPLC法分離并定量。
或者，可根據Fraser等(Fraser，Misawa，Linden，Yamano，Kobayashi和SandmannExpression in Escherichia coli，purification，and reactivationof the recombinant Erwinia uredovora phytoene desaturase，Journal ofBiological Chemistry 267(1992)，19891-19895)的方法，測定八氫番茄紅素去飽和酶的活性。
ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性是指ζ-胡蘿卜素去飽和酶的酶活性。
ζ-胡蘿卜素去飽和酶是指一種蛋白質，其具有將ζ-胡蘿卜素轉化為四氫番茄紅素和/或將四氫番茄紅素轉化為番茄紅素的酶活性。
據此，ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性是指在一定時間內由蛋白質ζ-胡蘿卜素去飽和酶轉化的ζ-胡蘿卜素或四氫番茄紅素的量或形成的四氫番茄紅素或番茄紅素的量。
當ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由蛋白質ζ-胡蘿卜素去飽和酶轉化的ζ-胡蘿卜素或四氫番茄紅素的量，或形成的四氫番茄紅素或番茄紅素的量也因之增加。
優選增加的ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性至少為野生型ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
優選在以下條件下測定本發明中經過遺傳修飾的生物，以及野生型或參照生物的ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性在研缽中加入液氮，通過強烈研磨勻漿冷凍生物材料，并用比率從1∶1至1∶20的提取緩沖液進行抽提。具體的比率取決于可獲得的生物材料中的酶活性，以便能在線性測量的范圍內進行酶活性的測定和量化。通常提取緩沖液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即進行提取。
可在0.2M磷酸鉀(pH 7.8，緩沖液體積大約1ml)中進行測定ζ-胡蘿卜素去飽和酶(ZDS去飽和酶)的分析。其分析方法已由Breitenbach及其同事發表(Breitenbach，Kuntz，Takaichi和SandmannCatalytic propertiesof an expressed and purified higher plant type ζ-carotene desaturase fromCapsicum annuum；European Journal of Biochemistry.265(1)376-383，1999)。每種分析混合物含有3mg懸浮于0.4M磷酸鉀緩沖液(pH 7.8)中的磷脂酰膽堿、5μgζ-胡蘿卜素或四氫番茄紅素、0.02％丁基羥基甲苯、10μl癸基質體醌(1mM甲醇貯存液)及生物提取物。生物提取物的體積需根據存在的ZDS去飽和酶活性進行調節，以便能在線性測量范圍內進行定量。孵育一般在暗處、約28℃下，劇烈振蕩(200轉/分鐘)進行約17小時。加入4ml丙酮在50℃時振蕩10分鐘抽提類胡蘿卜素。將類胡蘿卜素從該混合物轉移至石油醚相(含有10％乙醚)。在氮氣中蒸發乙醚/石油醚相，將類胡蘿卜素重新溶為20μl并通過HPLC法進行分離和定量。
crtISO活性是指crtISO蛋白的酶活性。
crtISO蛋白是指一種蛋白質，其具有將7，9，7’，9’-四順式番茄紅素轉化為全反式番茄紅素的酶活性。
據此，crtISO活性是指在一定時間內由蛋白質crtISO轉化的7，9，7’，9’-四順式番茄紅素的量或形成的全反式番茄紅素的量。
當crtISO活性相對于野生型增加時，與野生型相比，在一定時間內由crtISO蛋白轉化的7，9，7’，9’-四順式番茄紅素的量或形成的全反式番茄紅素的量也因之增加。
優選增加的crtISO活性至少為野生型crtISO活性的5％，進一步優選為至少20％、進一步優選為至少50％、進一步優選為至少100％、更優選為至少300％、甚至更優選為至少500％，特別是至少600％。
FtsZ活性是指FtsZ蛋白的生理學活性。
FtsZ蛋白是指一種蛋白質，其具有促進細胞分裂和質體分裂的活性，且與微管蛋白質同源。
MinD活性是指MinD蛋白的生理學活性。
MinD蛋白是指一種在細胞分裂中具有多功能作用的蛋白質。它是一種膜相關ATP酶并且在細胞內可表現為從一極到另一極的振動運動。
另外，非甲羥戊酸途徑的酶活性的增加能夠導致目的酮類胡蘿卜素終產物的進一步增加。其實例包括，4-二磷酸胞苷(diphosphocytidyl)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶和2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸酯合酶。通過修飾相應基因的基因表達，可以提高所述酶的活性。以標準方式通過抗體和相應印跡技術能夠檢測相應蛋白質的濃度改變。
可以通過多種途徑，增加HMG-CoA還原酶活性和/或(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性和/或異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶活性和/或牻牛兒基二磷酸酯合酶活性和/或法呢基二磷酸酯合酶活性和/或牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性和/或八氫番茄紅素合酶活性和/或八氫番茄紅素去飽和酶活性和/或ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性和/或crtISO活性和/或FtsZ活性和/或MinD活性，例如通過在表達和蛋白質水平關閉抑制性調節機制，或通過提高編碼HMG-CoA還原酶的核酸和/或編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸和/或編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸和/或編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸和/或編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼八氫番茄紅素合酶的核酸和/或編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸和/或編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸和/或編碼crtISO蛋白的核酸和/或編碼FtsZ蛋白的核酸和/或編碼MinD蛋白的核酸相對于野生型的基因表達。
也可通過多種途徑提高編碼HMG-CoA還原酶的核酸和/或編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸和/或編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸和/或編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸和/或編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼八氫番茄紅素合酶的核酸和/或編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸和/或編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸和/或編碼crtISO蛋白的核酸和/或編碼FtsZ蛋白的核酸和/或編碼MinD蛋白的核酸相對于野生型的基因表達，例如通過活化劑誘導HMG-CoA還原酶基因和/或(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因和/或異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶基因和/或牻牛兒基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因和/或八氫番茄紅素合酶基因和/或八氫番茄紅素去飽和酶基因和/或ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因和/或crtISO基因和/或Fts基因和/或MinD基因，或者通過插入一個或多個拷貝的HMG-CoA還原酶基因和/或(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因和/或異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶基因和/或牻牛兒基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因和/或八氫番茄紅素合酶基因和/或八氫番茄紅素去飽和酶基因和/或ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因和/或crtISO基因和/或Fts基因和/或MinD基因，即向植物中插入至少一個編碼HMG-CoA還原酶的核酸和/或至少一個編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸和/或至少一個編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或至少一個編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸和/或至少一個編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸和/或至少一個編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一個編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一個編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一個編碼八氫番茄紅素合酶的核酸和/或至少一個編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸和/或至少一個編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸和/或至少一個編碼crtISO蛋白的核酸和/或至少一個編碼FtsZ蛋白的核酸和/或至少一個編碼MinD蛋白的核酸。
根據本發明，編碼HMG-CoA還原酶的核酸和/或編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸和/或編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸和/或編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸和/或編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或編碼八氫番茄紅素合酶的核酸和/或編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸和/或編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸和/或編碼crtISO蛋白的核酸和/或編碼FtsZ蛋白的核酸和/或編碼MinD蛋白的核酸的基因表達的增加，也指對該生物自身的內源HMG-CoA還原酶和/或(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶和/或異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶和/或牻牛兒基二磷酸酯合酶和/或法呢基二磷酸酯合酶和/或牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶和/或八氫番茄紅素合酶和/或八氫番茄紅素去飽和酶和/或ζ-胡蘿卜素去飽和酶和/或crtISO蛋白和/或FtsZ蛋白和/或MinD蛋白表達的調控。
這一點可以通過如修飾相應啟動子DNA序列來實現。這一修飾可以通過DNA序列的缺失或插入來實現，從而增加該基因的表達率。
在優選實施方案中，編碼HMG-CoA還原酶核酸的基因表達的增加和/或編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶核酸的基因表達的增加和/或編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶核酸的基因表達的增加和/或編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶核酸的基因表達的增加和/或編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶核酸的基因表達的增加和/或編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶核酸的基因表達的增加和/或編碼法呢基二磷酸酯合酶核酸的基因表達的增加和/或編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶核酸的基因表達的增加和/或編碼八氫番茄紅素合酶核酸的基因表達的增加和/或編碼八氫番茄紅素去飽和酶核酸的基因表達的增加和/或編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶核酸的基因表達的增加和/或編碼crtISO蛋白核酸的基因表達的增加和/或編碼FtsZ蛋白核酸的基因表達的增加和/或編碼MinD蛋白核酸的基因表達的增加是通過向植物中插入至少一個編碼HMG-CoA還原酶的核酸和/或至少一個編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸和/或至少一個編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或至少一個編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸和/或至少一個編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸和/或至少一個編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一個編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一個編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一個編碼八氫番茄紅素合酶的核酸和/或至少一個編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸和/或至少一個編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸和/或至少一個編碼crtISO蛋白的核酸和/或至少一個編碼FtsZ蛋白的核酸和/或至少一個編碼MinD蛋白的核酸而實現。
為此，原則上可以使用任何HMG-CoA還原酶基因或(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因或異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶基因或牻牛兒基二磷酸酯合酶基因或法呢基二磷酸酯合酶基因或牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因或八氫番茄紅素合酶基因或八氫番茄紅素去飽和酶基因或ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因或crtISO基因或FtsZ基因或MinD基因。
對于真核生物來源的含有內含子的基因組HMG-CoA還原酶序列或(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶序列或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶序列或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶序列或異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶序列或牻牛兒基二磷酸酯合酶序列或法呢基二磷酸酯合酶序列或牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶序列或八氫番茄紅素合酶序列或八氫番茄紅素去飽和酶序列或ζ-胡蘿卜素去飽和酶序列或crtISO序列或FtsZ序列或MinD序列，在宿主生物不能或不能通過改造來表達相應酮酶時，優選使用已經加工的核酸序列，如相應的cDNA。
該優選的實施方案中，與野生型相比，本發明優選的轉基因生物中至少還存在另一個HMG-CoA還原酶基因和/或(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因和/或異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶基因和/或牻牛兒基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因和/或八氫番茄紅素合酶基因和/或八氫番茄紅素去飽和酶基因和/或ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因和/或crtISO基因和/或FtsZ基因和/或MinD基因。
在該優選實施方案中，遺傳修飾的植物具有，例如至少一個編碼HMG-CoA還原酶的外源核酸或至少兩個編碼HMG-CoA還原酶的內源核酸，和/或至少一個編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的外源核酸或至少兩個編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的內源核酸，和/或至少一個編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的外源核酸或至少兩個編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的內源核酸，和/或至少一個編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的外源核酸或至少兩個編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的內源核酸，和/或至少一個編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的外源核酸或至少一個編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的內源核酸，和/或至少一個編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少兩個編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的內源核酸，和/或至少一個編碼法呢基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少兩個編碼法呢基二磷酸酯合酶的內源核酸，和/或至少一個編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少兩個編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的內源核酸，和/或至少一個編碼八氫番茄紅素合酶的外源核酸或至少一個編碼八氫番茄紅素合酶的內源核酸，和/或至少一個編碼八氫番茄紅素去飽和酶的外源核酸或至少兩個編碼八氫番茄紅素去飽和酶的內源核酸，和/或至少一個編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的外源核酸或至少兩個編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的內源核酸，和/或至少一個編碼crtISO蛋白的外源核酸或至少兩個編碼crtISO蛋白的內源核酸，和/或至少一個編碼FtsZ蛋白的外源核酸或至少兩個編碼FtsZ蛋白的內源核酸，和/或至少一個編碼MinD蛋白的外源核酸或至少兩個編碼MinD蛋白的內源核酸。
HMG-CoA還原酶基因的實例為擬南芥(Arabidopsis thaliana)來源的編碼HMG-CoA還原酶的核酸，登錄號NM_106299(核酸SEQ ID NO7，蛋白質SEQ ID NO8)，還包括其他生物來源的登錄號如下的其他HMG-CoA還原酶基因P54961、P54870、P54868、P54869、O02734、P22791、P54873、P54871、P23228、P13704、P54872、Q01581、P17425、P54874、P54839、P14891、P34135、O64966、P29057、P48019、P48020、P12683、P43256、Q9XEL8、P34136、O64967、P29058、P48022、Q41437、P12684、Q00583、Q9XHL5、Q41438、Q9YAS4、O76819、O28538、Q9Y7D2、P54960、O51628、P48021、Q03163、P00347、P14773、Q12577、Q59468、P04035、O24594、P09610、Q58116、O26662、Q01237、Q01559、Q12649、O74164、O59469、P51639、Q10283、O08424、P20715、P13703、P13702、Q96UG4、Q8SQZ9、O15888、Q9TUM4、P93514、Q39628、P93081、P93080、Q944T9、Q40148、Q84MM0、Q84LS3、Q9Z9N4、Q9KLM0。
(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因的實例為擬南芥來源的編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸(lytB/ISPH)，登錄號AY168881，(核酸SEQ ID NO9，蛋白質SEQ ID NO102)，還包括其他生物來源的登錄號如下的其他(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因T04781、AF270978_1、NP_485028.1、NP_442089.1、NP_681832.1、ZP_00110421.1、ZP_00071594.1、ZP_00114706.1、ISPH_SYNY3、ZP_00114087.1、ZP_00104269.1、AF398145_1、AF398146_1、AAD55762.1、AF514843_1、NP_622970.1、NP_348471.1、NP_562001.1、NP_223698.1、NP_781941.1、ZP_00080042.1、NP_859669.1、NP_214191.1、ZP_00086191.1、ISPH_VIBCH、NP_230334.1、NP_742768.1、NP_302306.1、ISPH_MYCLE、NP_602581.1、ZP_00026966.1、NP_520563.1、NP_253247.1、NP_282047.1、ZP_00038210.1、ZP_00064913.1、CAA61555.1、ZP_00125365.1、ISPH_ACICA、EAA24703.1、ZP_00013067.1、ZP_00029164.1、NP_790656.1、NP_217899.1、NP_641592.1、NP_636532.1、NP_719076.1、NP_660497.1、NP_422155.1、NP_715446.1、ZP_00090692.1、NP_759496.1、ISPH_BURPS、ZP_00129657.1、NP_215626.1、NP_335584.1、ZP_00135016.1、NP_789585.1、NP_787770.1、NP_769647.1、ZP_00043336.1、NP_242248.1、ZP_00008555.1、NP_246603.1、ZP_00030951.1、NP_670994.1、NP_404120.1、NP_540376.1、NP_733653.1、NP_697503.1、NP_840730.1、NP_274828.1、NP_796916.1、ZP_00123390.1、NP_824386.1、NP_737689.1、ZP_00021222.1、NP_757521.1、NP_390395.1、ZP_00133322.1、CAD76178.1、NP_600249.1、NP_454660.1、NP_712601.1、NP_385018.1、NP_751989.1。
1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的實例為食用番茄(Lycopersicon esculentum)來源的編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸，登錄號#AF143812(核酸SEQ ID NO103，蛋白質SEQ IDNO12)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因AF143812_1、DXS_CAPAN、CAD22530.1、AF182286_1、NP_193291.1、T52289、AAC49368.1、AAP14353.1、D71420、DXS_ORYSA、AF443590_1、BAB02345.1、CAA09804.2、NP_850620.1、CAD22155.2、AAM65798.1、NP_566686.1、CAD22531.1、AAC33513.1、CAC08458.1、AAG10432.1、T08140、AAP14354.1、AF428463_1、ZP_00010537.1、NP_769291.1、AAK59424.1、NP_107784.1、NP_697464.1、NP_540415.1、NP_196699.1、NP_384986.1、ZP_00096461.1、ZP_00013656.1、NP_353769.1、BAA83576.1、ZP_00005919.1、ZP_00006273.1、NP_420871.1、AAM48660.1、DXS_RHOCA、ZP_00045608.1、ZP_00031686.1、NP_841218.1、ZP_00022174.1、ZP_00086851.1、NP_742690.1、NP_520342.1、ZP_00082120.1、NP_790545.1、ZP_00125266.1、CAC17468.1、NP_252733.1、ZP_00092466.1、NP_439591.1、NP_414954.1、NP_752465.1、NP_622918.1、NP_286162.1、NP_836085.1、NP_706308.1、ZP_00081148.1、NP_797065.1、NP_213598.1、NP_245469.1、ZP_00075029.1、NP_455016.1、NP_230536.1、NP_459417.1、NP_274863.1、NP_283402.1、NP_759318.1、NP_406652.1、DXS_SYNLE、DXS_SYNP7、NP_440409.1、ZP_00067331.1、ZP_00122853.1、NP_717142.1、ZP_00104889.1、NP_243645.1、NP_681412.1、DXS_SYNEL、NP_637787.1、DXS_CHLTE、ZP_00129863.1、NP_661241.1、DXS_XANCP、NP_470738.1、NP_484643.1、ZP_00108360.1、NP_833890.1、NP_846629.1、NP_658213.1、NP_642879.1、ZP_00039479.1、ZP_00060584.1、ZP_00041364.1、ZP_00117779.1、NP_299528.1。
1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因的實例為擬南芥來源的編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸，登錄號#AF148852，(核酸SEQ ID NO13，蛋白質SEQ ID NO14)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因AF148852、AY084775、AY054682、AY050802、AY045634、AY081453、AY091405、AY098952、AJ242588、AB009053、AY202991、NP_201085.1、T52570、AF331705_1、BAB16915.1、AF367205_1、AF250235_1、CAC03581.1、CAD22156.1、AF182287_1、DXR_MENPI、ZP_00071219.1、NP_488391.1、ZP_00111307.1、DXR_SYNLE、AAP56260.1、NP_681831.1、NP_442113.1、ZP_00115071.1、ZP_00105106.1、ZP_00113484.1、NP_833540.1、NP_657789.1、NP_661031.1、DXR_BACHD、NP_833080.1、NP_845693.1、NP_562610.1、NP_623020.1、NP_810915.1、NP_243287.1、ZP_00118743.1、NP_464842.1、NP_470690.1、ZP_00082201.1、NP_781898.1、ZP_00123667.1、NP_348420.1、NP_604221.1、ZP_00053349.1、ZP_00064941.1、NP_246927.1、NP_389537.1、ZP_00102576.1、NP_519531.1、AF124757_19、DXR_ZYMMO、NP_713472.1、NP_459225.1、NP_454827.1、ZP_00045738.1、NP_743754.1、DXR_PSEPK、ZP_00130352.1、NP_702530.1、NP_841744.1、NP_438967.1、AF514841_1、NP_706118.1、ZP_00125845.1、NP_404661.1、NP_285867.1、NP_240064.1、NP_414715.1、ZP_00094058.1、NP_791365.1、ZP_00012448.1、ZP_00015132.1、ZP_00091545.1、NP_629822.1、NPP_798691.1、NP_231885.1、NP_252340.1、ZP_00022353.1、NP_355549.1、NP_420724.1、ZP_00085169.1、EAA17616.1、NP_273242.1、NP_219574.1、NP_387094.1、NP_296721.1、ZP_00004209.1、NP_823739.1、NP_282934.1、BAA77848.1、NP_660577.1、NP_760741.1、NP_641750.1、NP_636741.1、NP_829309.1、NP_298338.1、NP_444964.1、NP_717246.1、NP_224545.1、ZP_00038451.1、DXR_KITGR、NP_778563.1。
異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶基因的實例為巴勒斯提納側金盞花(Adonis palaestina)克隆ApIPI28來源的編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸(ipiAa1)，登錄號#AF188060，由Cunningham、F.X.Jr.和Gantt，E.發表Identification of multi-gene familiesencoding isopentenyl diphosphate isomerase in plants by heterologouscomplementation in Escherichia coli，Plant Cell Physiol.41(1)、119-123(2000)(核酸SEQ ID NO15，蛋白質SEQ ID NO16)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶基因Q38929、O48964、Q39472、Q13907、O35586、P58044、O42641、O35760、Q10132、P15496、Q9YB30、Q8YNH4、Q42553、O27997、P50740、O51627、O48965、Q8KFR5、Q39471、Q39664、Q9RVE2、Q01335、Q9HHE4、Q9BXS1、Q9KWF6、Q9CIF5、Q88WB6、Q92BX2、Q8Y7A5、Q8TT35 Q9KK75、Q8NN99、Q8XD58、Q8FE75、Q46822、Q9HP40、P72002、P26173、Q9Z5D3、Q8Z3X9、Q8ZM82、Q9X7Q6、O13504、Q9HFW8、Q8NJL9、Q9UUQ1、Q9NH02、Q9M6K9、Q9M6K5、Q9FXR6、O81691、Q9S7C4、Q8S3L8、Q9M592、Q9M6K3、Q9M6K7、Q9FV48、Q9LLB6、Q9AVJ1、Q9AVG8、Q9M6K6、Q9AVJ5、Q9M6K2、Q9AYS5、Q9M6K8、Q9AVG7、Q8S3L7、Q8W250、Q94IE 1、Q9AVI8、Q9AYS6、Q9SAY0、Q9M6K4、Q8GVZ0、Q84RZ8、Q8KZ12、Q8KZ66、Q8FND7、Q88QC9、Q8BFZ6、BAC26382、CAD94476。
牻牛兒基二磷酸酯合酶基因的實例為擬南芥來源的編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸，登錄號#Y17376，Bouvier，F.、Suire，C.、d’Harlingue，A.、Backhaus，R.A.和Camara，B.Molecular cloning of geranyl phosphate synthase and compartmentation ofmonoterpene synthesis in plant cells，Plant J.24(2)，241-252(2000)(核酸SEQ ID NO17，蛋白質SEQ ID NO18)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他牻牛兒基二磷酸酯合酶基因Q9FT89、Q8LKJ2、Q9FSW8、Q8LKJ3、Q9SBR3、Q9SBR4、Q9FET8、Q8LKJ1、Q84LG1、Q9JK86。
法呢基二磷酸酯合酶基因的實例為擬南芥來源的編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸(FPS1)，登錄號#U80605，發表于Cunillera，N.、Arro，M.、Delourme，D.、Karst，E、Boronat，A.和Ferrer，A.Arabidopsis thaliana contains two differentially expressedfarnesyl phosphate synthase genes，J.Biol Chem.271(13)，7774-7780(1996)(核酸SEQ ID NO19，蛋白質SEQ ID NO112)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他法呢基二磷酸酯合酶基因P53799、P37268、Q02769、Q09152、P49351、O24241、Q43315、P49352、O24242、P49350、P08836、P14324、P49349、P08524、O66952、Q08291、P54383、Q45220、P57537、Q8K9A0、P22939、P45204、O66126、P55539、Q9SWH9、Q9AVI7、Q9FRX2、Q9AYS7、Q94IE8、Q9FXR9、Q9ZWF6、Q9FXR8、Q9AR37、O50009，Q94IE9，Q8RVK7、Q8RVQ7、O04882、Q93RA8、Q93RB0、Q93RB4、Q93RB5，Q93RB3、Q93RB1、Q93RB2、Q920E5。
牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因的實例為白芥(Sinapis alba)來源的編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸，登錄號#X98795，發表于Bonk，M.、Hoffmann，B.、Von Lintig，J.、Schledz，M.、Al-Babili，S.、Hobeika，E.、Kleinig，H.和Beyer，P.Chloroplastimport of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveals differentialfates prior to membrane binding and oligomeric assembly，Eur.J.Biochem.247(3)，942-950(1997)(核酸SEQ ID NO21，蛋白質SEQ ID NO114)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因P22873、P34802，P56966、P80042、Q42698、Q92236、O95749、Q9WTN0、Q50727、P24322、P39464、Q9FXR3、Q9AYN2、Q9FXR2、Q9AVG6、Q9FRW4、Q9SXZ5、Q9AVJ7、Q9AYN1、Q9AVJ4、Q9FXR7、Q8LSC5、Q9AVJ6、Q8LSC4、Q9AVJ3、Q9SSU0、Q9SXZ6、Q9SST9、Q9AVJ0、Q9AVI9、Q9FRW3、Q9FXR5、Q94IF0、Q9FRX1、Q9K567、Q93RA9、Q93QX8、CAD95619、EAA31459。
八氫番茄紅素合酶基因的實例為噬夏孢歐文菌(Erwinia uredovora)來源的編碼八氫番茄紅素合酶的核酸，登錄號#D90087，發表于Misawa，N.、Nakagawa，M.、Kobayashi，K.、Yamano，S.、Izawa，Y.、Nakamura，K.和Harashima，K.Elucidation of theErwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysisof gene products expressed in Escherichia coli；J.Bacteriol.172(12)，6704-6712(1990)(核酸SEQ ID NO23，蛋白質SEQ ID NO24)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他八氫番茄紅素合酶基因CAB39693、BAC69364、AAF10440、CAA45350、BAA20384、AAM72615、BAC09112、CAA48922、P_001091、CAB84588、AAF41518、CAA48155、AAD38051、AAF33237、AAG10427、AAA34187、BAB73532、CAC19567、AAM62787、CAA55391、AAB65697、AAM45379、CAC27383、AAA32836、AAK07735、BAA84763、P_000205、AAB60314、P_001163、P_000718、AAB71428、AAA34153、AAK07734、CAA42969、CAD76176、CAA68575、P_000130、P_001142、CAA47625、CAA85775、BAC14416、CAA79957、BAC76563、P_000242、P_000551、AAL02001、AAK15621、CAB94795、AAA91951、P_000448。
八氫番茄紅素去飽和酶基因的實例為
噬夏孢歐文菌來源的編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸，登錄號#D90087；發表于Misawa，N.、Nakagawa，M.、Kobayashi，K.、Yamano，S.、Izawa，Y.、Nakamura，K.和Harashima，K.Elucidation of the Erwiniauredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of geneproducts expressed in Escherichia coli；J.Bacteriol. 172(12)，6704-6712(1990)(核酸SEQ ID NO25，蛋白質SEQ ID NO26)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他八氫番茄紅素去飽和酶基因AAL15300、A39597、CAA42573、AAK51545、BAB08179、CAA48195、BAB82461、AAK92625、CAA55392、AAG10426、AAD02489、AAO24235、AAC12846、AAA99519、AAL38046、CAA60479、CAA75094、ZP_001041、ZP_001163、CAA39004、CAA44452、ZP_001142、ZP_000718、BAB82462、AAM45380、CAB56040、ZP_001091、BAC09113、AAP79175、AAL80005、AAM72642、AAM72043、ZP_000745、ZP_001141、BAC07889、CAD55814、ZP_001041、CAD27442、CAE00192、ZP_001163、ZP_000197、BAA18400、AAG10425、ZP_001119、AAF13698、2121278A、AAB35386、AAD02462、BAB68552、CAC85667、AAK51557、CAA12062、AAG51402、AAM63349、AAF85796、BAB74081、AAA91161、CAB56041、AAC48983、AAG14399、CAB65434、BAB73487、ZP_001117、ZP_000448、CAB39695、CAD76175、BAC69363、BAA17934、ZP_000171、AAF65586、ZP_000748、BAC07074、ZP_001133、CAA64853、BAB74484、ZP_001156、AAF23289、AAG28703、AAP09348、AAM71569、BAB69140、ZP_000130、AAF41516、AAG18866、CAD95940、NP_656310、AAG10645、ZP_000276、ZP_000192、ZP_000186、AAM94364、EAA31371、ZP_000612、BAC75676、AAF65582。
ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因的實例為黃水仙(Narcissus pseudonarcissus)來源的編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸，登錄號#AJ224683，發表于Al-Babili，S.、Oelschlegel，J.和Beyer，P.A cDNA encoding for beta carotene desaturase(Aceession No.AJ224683)from Narcissus pseudonarcissus L..(PGR98-103)，Plant Physiol.117，719-719(1998)(核酸SEQ ID NO119，蛋白質SEQ ID NO28)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因Q9R6X4、Q38893、Q9SMJ3、Q9SE20、Q9ZTP4、O49901、P74306、Q9FV46、Q9RCT2、ZDS_NARPS、BAB68552.1、CAC85667.1、AF372617_1、ZDS_TARER、CAD55814.1、CAD27442.1、2121278A、ZDS_CAPAN、ZDS_LYCES、NP_187138.1、AAM63349.1、ZDS_ARATH、AAA91161.1、ZDS_MAIZE、AAG14399.1、NP_441720.1、NP_486422.1、ZP_00111920.1、CAB56041.1、ZP_00074512.1、ZP_00116357.1、NP_681127.1、ZP_00114185.1、ZP_00104126.1、CAB65434.1、NP_662300.1。
crtISO基因的實例為食用番茄來源的編碼crtISO的核酸；登錄號#AF416727，發表于Isaacson，T.、Ronen，G.、Zamir，D.和Hirschberg，J.Cloning of tangerinefrom tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production ofbeta-carotene and xanthophylls in plants；Plant Cell 14(2)，333-342(2002)(核酸SEQ ID NO29，蛋白質SEQ ID NO122)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他crtISO基因AAM53952FtsZ基因的實例為萬壽菊來源的編碼FtsZ的核酸，登錄號#AF251346，發表于Moehs，C.P.、Tian，L.、Osteryoung，K.W.和Dellapenna，D.Analysis of carotenoidbiosynthetic gene expression during marigold petal development；PlantMol.Biol.45(3)，281-293(2001)(核酸SEQ ID NO31，蛋白質SEQ IDNO32)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他FtsZ基因CAB89286.1、AF205858_1、NP_200339.1、CAB89287.1、CAB41987.1、AAA82068.1、T06774，AF383876_1、BAC57986.1、CAD22047.1、BAB91150.1、ZP_00072546.1、NP_440816.1、T51092、NP_683172.1、BAA85116.1、NP_487898.1、JC4289、BAA82871.1、NP_781763.1、BAC57987.1、ZP_00111461.1、T51088、NP_190843.1、ZP_00060035.1、NP_846285.1、AAL07180.1、NP_243424.1、NP_833626.1、AAN04561.1、AAN04557.1、CAD22048.1、T51089、NP_692394.1、NP_623237.1、NP_565839.1、T51090、CAA07676.1、NP_113397.1、T51087、CAC44257.1、E84778、ZP_00105267.1、BAA82091.1、ZP_00112790.1、BAA96782.1、NP_348319.1、NP_471472.1、ZP_00115870.1、NP_465556.1、NP_389412.1、BAA82090.1、NP_562681.1、AAM22891.1、NP_371710.1、NP_764416.1、CAB95028.1、FTSZ_STRGR、AF120117_1、NP_827300.1、JE0282、NP_626341.1、AAC45639.1、NP_785689.1、NP_336679.1、NP_738660.1、ZP_00057764.1、AAC32265.1、NP_814733.1、FTSZ_MYCKA、NP_216666.1、CAA75616.1、NP_301700.1、NP_601357.1、ZP_00046269.1、CAA70158.1、ZP_00037834.1、NP_268026.1、FTSZ_ENTHR、NP_787643.1、NP_346105.1、AAC32264.1、JC5548、AAC95440.1、NP_710793.1、NP_687509.1、NP_269594.1、AAC32266.1、NP_720988.1、NP_657875.1、ZP_00094865.1、ZP_00080499.1、ZP_00043589.1、JC7087、NP_660559.1、AAC46069.1、AF179611_14、AAC44223.1、NP_404201.1。
MinD基因的實例為萬壽菊來源的編碼MinD的核酸，登錄號#AF251019，發表于Moehs，C.P.、Tian，L.、Osteryoung，K.W.和Dellapenna，D.Analysis of carotenoidbiosynthetic gene expression during marigold petal development；PlantMol.Biol.45(3)，281-293(2001)(核酸SEQ ID NO33，蛋白質SEQ IDNO34)，還包括其他生物體來源的登錄號如下的其他MinD基因NP_197790.1、BAA90628.1、NP_038435.1、NP_045875.1、AAN33031.1、NP_050910.1、CAB53105.1、NP_050687.1、NP_682807.1、NP_487496.1、ZP_00111708.1、ZP_00071109.1、NP_442592.1、NP_603083.1、NP_782631.1、ZP_00097367.1、ZP_00104319.1、NP_294476.1、NP_622555.1、NP_563054.1、NP_347881.1、ZP_00113908.1、NP_834154.1、NP_658480.1、ZP_00059858.1、NP_470915.1、NP_243893.1、NP_465069.1、ZP_00116155.1、NP_390677.1、NP_692970.1、NP_298610.1、NP_207129.1、ZP_00038874.1、NP_778791.1、NP_223033.1、NP_641561.1、NP_636499.1、ZP_00088714.1、NP_213595.1、NP_743889.1、NP_231594.1、ZP_00085067.1、NP_797252.1、ZP_00136593.1、NP_251934.1、NP_405629.1、NP_759144.1、ZP_00102939.1、NP_793645.1、NP_699517.1、NP_460771.1、NP_860754.1、NP_456322.1、NP_718163.1、NP_229666.1、NP_357356.1、NP_541904.1、NP_287414.1、NP_660660.1、ZP_00128273.1、NP_103411.1、NP_785789.1、NP_715361.1、AF149810_1、NP_841854.1、NP_437893.1、ZP_00022726.1、EAA24844.1、ZP_00029547.1、NP_521484.1、NP_240148.1、NP_770852.1、AF345908_2、NP_777923.1、ZP_00048879.1、NP_579340.1、NP_143455.1、NP_126254.1、NP_142573.1、NP_613505.1、NP_127112.1、NP_712786.1、NP_578214.1、NP_069530.1、NP_247526.1、AAA85593.1、NP_212403.1、NP_782258.1、ZP_00058694.1、NP_247137.1、NP_219149.1、NP_276946.1、NP_614522.1、ZP_00019288.1、CAD78330.1。
上述優選的實施方案中優選使用的HMG-CoA還原酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO8氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO8序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有HMG-CoA還原酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現HMG-CoA還原酶和HMG-CoA還原酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ ID NO8的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO7序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它HMG-CoA還原酶和HMG-CoA還原酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加HMG-CoA還原酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO8的HMG-CoA還原酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO7序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO10氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO10序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％，更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶和(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ ID NO10的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO9序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶和(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO10的(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO9序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO12氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ IDNO12序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶和1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ ID NO12的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO11序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶和1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ IDNO12的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO11序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO14氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO14序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶和1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ ID NO14的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO13序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶和1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO14的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO13序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的異戊烯基-D-異構酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO16氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO16序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有異戊烯基-D-異構酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現異戊烯基-D-異構酶和異戊烯基-D-異構酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ IDNO16的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO15序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它異戊烯基-D-異構酶和異戊烯基-D-異構酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加異戊烯基-D-異構酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO16的異戊烯基-D-異構酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子，是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO15序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的牻牛兒基二磷酸酯合酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO18氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO18序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％；且所述蛋白質具有牻牛兒基二磷酸酯合酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現牻牛兒基二磷酸酯合酶和牻牛兒基二磷酸酯合酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQID NO18的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO17序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它牻牛兒基二磷酸酯合酶和牻牛兒基二磷酸酯合酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加牻牛兒基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO18的牻牛兒基二磷酸酯合酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO17序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的法呢基二磷酸酯合酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO20氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO20序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有法呢基二磷酸酯合酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現法呢基二磷酸酯合酶和法呢基二磷酸酯合酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ IDNO20的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO19序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它法呢基二磷酸酯合酶和法呢基二磷酸酯合酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加法呢基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO20的法呢基二磷酸酯合酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO19序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO22氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQID NO22序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶和牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ ID NO22的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO21序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶和牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQID NO22的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO21序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的八氫番茄紅素合酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO24氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO24序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有八氫番茄紅素合酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現八氫番茄紅素合酶和八氫番茄紅素合酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ ID NO24的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO23序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它八氫番茄紅素合酶和八氫番茄紅素合酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加八氫番茄紅素合酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO24的八氫番茄紅素合酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子，是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO23序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的八氫番茄紅素去飽和酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO26氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO26序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有八氫番茄紅素去飽和酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現八氫番茄紅素去飽和酶和八氫番茄紅素去飽和酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQID NO26的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO25序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它八氫番茄紅素去飽和酶和八氫番茄紅素去飽和酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加八氫番茄紅素去飽和酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO26的八氫番茄紅素去飽和酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO25序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO28氨基酸序列，或含有對該序列進行氫基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO28序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有ζ-胡蘿卜素去飽和酶的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現ζ-胡蘿卜素去飽和酶和ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ IDNO28的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO119序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它ζ-胡蘿卜素去飽和酶和ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加ζ-胡蘿卜素去飽和酶的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO28的ζ-胡蘿卜素去飽和酶氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO119序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的CrtISO基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO30氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO30序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有CrtIso的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現CrtISO和CrtISO基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ ID NO30的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO29序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它CrtISO和CrtISO基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加CrtISO的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO30的CrtISO氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO29序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的FtsZ基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO32氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO32序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有FtsZ的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現FtsZn和FtsZ基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ ID NO32的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO31序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它FtsZn和FtsZ基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加FtsZ的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO32的FtsZ氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法，獲取合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO31序列的核酸插入生物中。
上述優選實施方案中優選使用的MinD基因為編碼以下蛋白質的核酸，所述蛋白質中含有SEQ ID NO34氨基酸序列，或含有對該序列進行氨基酸替換、插入或缺失后產生的序列，后者與SEQ ID NO34序列在氨基酸水平上的同一性為至少30％、優選至少50％、更優選至少70％、甚至更優選至少90％、最優選至少95％，且所述蛋白質具有MinD的酶促性質。
可以從多種已知基因組序列的生物中容易地發現MinDn和MinD基因的其他實例，例如如上所述比較含有SEQ IDNO34的數據庫中的氨基酸序列或其相應的反向翻譯核酸序列的同源性。
如上所述，利用雜交和PCR技術，以SEQ ID NO33序列起始，通過已知的方法可以從多種基因組序列未知的生物中容易地發現其它MinDn和MinD基因的實例。
在另一個特別優選的實施方案中，為增加MinD的活性，向生物中插入編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質含有序列SEQ ID NO34的MinD氨基酸序列。
可以通過如根據遺傳密碼反向翻譯多肽序列的方法獲得合適的核酸序列。
優選為此使用的密碼子是根據生物特異性的密碼子使用情況選擇其中頻繁使用者。借助計算機分析相關生物的其他已知基因，可以容易地確定密碼子的使用。
在特別優選的實施方案中，將含有SEQ ID NO33序列的核酸插入生物中。
還可以通過公知的方法，從核苷酸結構單元開始進行化學合成來制備上述所有HMG-CoA還原酶基因、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶基因、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶基因、異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶基因、牻牛兒基二磷酸酯合酶基因、法呢基二磷酸酯合酶基因、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶基因、八氫番茄紅素合酶基因、八氫番茄紅素去飽和酶基因、ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因、crtISO基因、FtsZ基因或MinD基因，例如利用單個重疊互補的雙螺旋核酸結構單元的片段縮合來制備。通過如已知的亞磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897頁)，可以化學合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填補空位、連接反應和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloningA laboratorymanual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press所述。
編碼酮酶的核酸、編碼β-羥化酶的核酸、編碼β環化酶的核酸(含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性)，以及編碼HMG-CoA還原酶的核酸、編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸、編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸、編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸、編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸、編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸、編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸、編碼八氫番茄紅素合酶的核酸、編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸、編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸、編碼crtISO蛋白的核酸、編碼FtsZ蛋白的核酸和/或編碼MinD蛋白的核酸在以下也稱為“作用基因”。
可以通過下述途徑產生遺傳修飾的非人生物，如插入含有一個作用基因的單個核酸構建體(表達盒)、或插入包含上至2個或3個作用基因或多于3個作用基因的多重構建體。
本發明的生物優選指野生型或起始生物時可天然產生或能夠通過遺傳互補和/或代謝途徑的再調節生產類胡蘿卜素(特別是β-胡蘿卜素和/或玉米黃質和/或新葉黃素和/或紫黃質(violaxanthin)和/或葉黃素)的生物。
其他優選的生物在野生型或起始生物時已經具有羥化酶的活性，因此其野生型或起始生物即能產生玉米黃質。
優選生物為植物或微生物，例如，細菌、酵母、藻類或真菌。
使用的細菌可以是由于插入產類胡蘿卜素生物的類胡蘿卜素生物合成基因而能合成葉黃素的細菌(例如含有例如歐文氏菌(Erwinia)來源的crt基因的埃希氏桿菌屬(Escherichia)細菌)，以及自身即能夠合成葉黃素的細菌(如歐文氏菌屬、農桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、產堿菌屬、副球菌屬、念珠藻屬的細菌或集胞藻屬的藍細菌(Cyanobacteria))。
優選的細菌為大腸桿菌(Escherichia coli)、草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)、噬夏孢歐文氏菌、橙黃農桿菌、產堿菌屬種PC-1、黃桿菌屬種R1534菌株、集胞藻屬藍細菌PCC6803、Paracoccus marcusii或Paracoccus carotinifaciens。
優選的酵母為假絲酵母(Candida)、酵母(Saccharomyces)、漢遜酵母(Hansenula)、畢赤酵母(Pichia)或法夫酵母(Phaffia)。特別優選的酵母為Xanthophyllomyces dendrorhous或Phaffia rhodozyma。
優選的真菌為曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、阿舒嚢霉(Ashbya)、脈孢菌(Neurospora)、布拉霉(特別是Blakeslea trispora)、須霉(Phycomyces)、鐮孢霉(Fusarium)或如Indian Chem.Engr.B部分卷37，No.1，2(1995)15頁，表6中描述的其它真菌。
優選的藻類有綠藻，如紅球藻屬(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、團藻屬(Volvox)或杜氏藻屬(Dunaliella)的藻類。特別優選的藻類有雨生紅球藻或杜氏藻屬巴德成藻(Dunaliellabardawil)。
其它可用于實施本發明方法的微生物及其生產，公開于如此處引用作為參考的DE-A-199 16 140。
特別優選的植物選自莧科(Amaranthaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夾竹桃科(Apocynaceae)、紫菀科(Asteraceae)、鳳仙花科(Balsaminaceae)、秋海棠科(Begoniaceae)、小檗科(Berberidaceae)、十字花科(Brassicaceae)、大麻科(Cannabaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、十字花科(Cruciferae)、大戟屬(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、龍膽科(Gentianaceae)、牻牛兒苗科(Geraniaceae)、禾本科(Graminae)、Illiaceae、唇形科(Labiatae)、薄荷科(Lamiaceae)、豆科(Leguminosae)、百合科(Liliaceae)、亞麻科(Linaceae)、山梗菜屬(Lobeliaceae)、錦葵科(Malvaceae)、木犀科(Oleaceae)、蘭科(Orchidaceae)、罌粟科(Papaveraceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、禾本科(Poaceae)、花荵科(Polemoniaceae)、報春花科(Primulaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、薔薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、旱金蓮科(Tropaeolaceae)、傘狀花科(Umbelliferae)、毛蕊花科(Verbanaceae)、葡萄科(Vitaceae)及紫羅蘭科(Violaceae)。
極其優選的植物選自萬壽菊屬(Marigold、萬壽菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、金合歡屬(Acacia)、烏頭屬(Aconitum)、側金盞花屬(Adonis)、阿尼菊屬(Arnica)、耬斗菜屬(Aquilegia)、紫菀屬(Aster)、黃芪屬(Astragalus)、紫葳屬(Bignonia)、金盞花屬(Calendula)、驢蹄草屬(Caltha)、風鈴草屬(Campanula)、美人蕉屬(Canna)、矢車菊屬(Centaurea)、桂竹香屬(Cheiranthus)、茼蒿屬(Chrysanthemum)、柑桔屬(Citrus)、還陽參屬(Crepis)、番紅花屬(Crocus)、南瓜屬(Curcurbita)、金雀兒屬(Cytisus)、Delonia屬、翠雀屬(Delphinium)、石竹屬(Dianthus)、康乃馨屬(Dimorphotheca)、多榔菊屬(Doronicum)、花菱草屬(Eschscholtzia)、連翹屬(Forsythia)、Fremontia屬、勛章菊屬(Gazania)、鉤吻屬(Gelsemium)、染料木屬(Genista)、龍膽屬(Gentiana)、老鸛草屬(Geranium)、非洲菊屬(Gerbera)、路邊青屬(Geum)、銀樺屬(Grevillea)、堆心菊屬(Helenium)、向日葵屬(Helianthus)、細辛屬(Hepatica)、獨活屬(Heracleum)、木槿屬(Hisbiscus)、賽菊芋屬(Heliopsis)、金絲桃屬(Hypericum)、黃金菊屬(Hypochoeris)、鳳仙花屬(Impatiens)、鳶尾屬(Iris)、藍花楹屬(Jacaranda)、棣堂屬(Kerria)、毒豆屬(Laburnum)、山黧豆屬(Lathyrus)、貓耳草屬(Leontodon)、百合屬(Lilium)、亞麻屬(Linum)、百脈根屬(Lotus)、番茄屬(Lycopersicon)、珍珠菜屬(Lysimachia)、Maratia屬、苜蓿屬(Medicago)、溝酸漿屬(Mimulus)、水仙屬(Narcissus)、月見草屬(Oenothera)、木犀屬(Osmanthus)、碧冬茄屬(Petunia)、石楠屬(Photina)、酸漿屬(Physalis)、牧根草屬(Phyteuma)、委陵草屬(Potentilla)、火棘屬(Pyracantha)、毛茛屬(Raunculus)、杜鵑花屬(Rhododendron)、薔薇屬(Rosa)、金光菊屬(Rudbeckia)、千里光屬(Senecio)、蠅子草屬(Silene)、松香草屬(Silphium)、Sinapsis屬、花楸屬(Sorbus)、鷹爪豆屬(Spartium)、黃鐘花屬(Tecoma)、蝴蝶草屬(Torenia)、婆羅們參屬(Tragopogon)、金蓮花屬(Trollius)、旱金蓮屬(Tropaeolum)、郁金香屬(Tulipa)、款冬屬(Tussilago)、荊豆屬(Ulex)、堇菜屬(Viola)或百日草屬(Zinnia)植物，特別優選萬壽菊屬(Marigold)、萬壽菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetespatula)、番茄屬(Lycopersicon)、薔薇屬(Rosa)、金盞花屬(Calendula)、酸漿屬(Physalis)、苜蓿屬(Medicago)、向日葵屬(Helianthus)、茼蒿屬(Chrysanthemum)、紫菀屬(Aster)、郁金香屬(Tulipa)、水仙屬(Narcissus)、碧冬茄屬(Petunia)、老鸛草屬(Geranium)、旱金蓮屬(Tropaeolum)或側金盞花屬(Adonis)植物之一。
在本發明制備酮類式胡蘿卜素的方法中，優選在培養遺傳修飾的生物之后收獲生物、并進一步優選從生物中分離酮類胡蘿卜素。
可以通過眾所周知的適合特定生物的方式收獲生物。在液體營養培養基中發酵培養的微生物(如細菌、酵母、藻類或真菌)或植物細胞，可以通過例如離心、潷析或過濾分離。通過已知的方式將植物生長于營養培養基中并適當時收獲。
優選在有氧、至少約20℃的培養溫度(例如20℃到40℃)、pH約6-9的條件下培養遺傳修飾的微生物。對于遺傳修飾的微生物，優選先在有氧、合成培養基(如TB或LB培養基)中、約20℃或更高溫度的培養溫度、pH約6至9的條件下培養，直到達到足夠的細胞密度。為了能更好地控制氧化反應，優選使用可誘導的啟動子。誘導酮酶表達后繼續在有氧條件下培養如12小時到3天。
可以通過已知的方式從收獲的生物質中分離酮類胡蘿卜素，如通過抽提，并適當時經進一步的化學或物理純化方法，例如沉淀法、結晶、熱分離法(如精餾法)或物理分離法(如層析)。
可如下所述在本發明遺傳修飾的植物中特異地產生酮類胡蘿卜素，優選在多種植物組織中產生，如種子、葉、果實、花，特別是花瓣。
可以通過已知的方式從收集的花瓣中分離酮類胡蘿卜素，例如通過干燥并隨后抽提，以及適當時進一步利用化學或物理純化方法，例如沉淀法、結晶、熱分離法(如精餾法)或物理分離法(如層析)。例如，優選使用有機溶劑(如丙酮、己烷、乙醚或叔-甲基丁基醚)從花瓣中分離酮類胡蘿卜素。
其他分離酮類胡蘿卜素(特別是從花瓣中分離)的方法描述于如Egger和Kleinig(Phytochemistry(1967)6，437-440)以及Egger(Phytochemistry(1965)4，609-618)中。
優選的酮類胡蘿卜素選自蝦青素、角黃素、海膽酮、3-羥基海膽酮、3’-羥基海膽酮、金盞花玉紅質和金盞花黃質。
特別優選的酮類胡蘿卜素為蝦青素。
取決于使用生物的不同，獲取的酮類胡蘿卜素為游離的或脂肪酸酯或二葡萄糖苷形式。
利用本發明方法從植物花瓣中獲得的酮類胡蘿卜素為其與脂肪酸形成的單酯或二酯的形式。一些檢測到的脂肪酸的實例為肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸和月桂酸(Kamata和Simpson(1987)Comp.Biochem.Physio.卷86B(3)，587-591)。
酮類胡蘿卜素的生產可以在整個植物中進行，或在優選實施方案中，特定在含有有色體的植物組織中進行。優選的植物組織例如根、種子、葉、果實、花，特別是蜜腺和花瓣。
在本發明方法的一個特別優選的實施方案中，使用了在花中酮酶表達速率最高的遺傳修飾植物。
優選使用花特異性的啟動子控制酮酶基因表達來實現這一點。例如，為此可如下文詳細描述的，向植物中與花特異性啟動子功能性連接的核酸構建體中插入前述核酸。
在本發明方法的另一特別優選的實施方案中，使用了在果實中酮酶表達速率最高的遺傳修飾植物。
優選使用果實特異性的啟動子控制酮酶基因表達來實現這一點。例如，為此可如下文詳細描述的，向植物中與果實特異性啟動子功能性連接的核酸構建體中插入前述核酸。
在本發明方法的另一特別優選的實施方案中，使用了在種子中酮酶表達速率最高的遺傳修飾植物。
優選使用種子特異性的啟動子控制酮酶基因表達來實現這一點。例如，為此可如下文詳細描述的，向植物中與種子特異性啟動子功能性連接的核酸構建體中插入前述核酸。
通過功能性連接的質體轉運肽可以實現對有色體的靶向定位。
以下通過實施例描述遺傳修飾植物的產生，所述遺傳修飾的植物具有增加的或造成的酮酶活性，以及增加的或造成的β環化酶活性(其修飾的β環化酶活性是由于該β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ IDNO2序列至少有70％的同一性)。
其他活性，如羥化酶活性、HMG-CoA還原酶活性、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性、異戊烯二磷酸酯Δ-異構酶活性、牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、八氫番茄紅素合酶活性、八氫番茄紅素去飽和酶活性、ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性和/或MinD活性，可以通過使用相應的作用基因，得到類似的增加。
在組合的遺傳修飾中，轉化可以逐個進行，或通過多重構建體完成。
優選使用含有上述的編碼酮酶及編碼β環化酶核酸的核酸構建體轉化起始植物來產生轉基因植物，所述核酸與一個或多個確保在植物中轉錄和翻譯的調節信號功能性連接；所述核酸編碼的β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
另外，也優選使用兩個核酸構建體轉化起始植物來產生轉基因植物。一個核酸構建體含有至少一個上述編碼酮酶的核酸，其與一個或多個確保在植物中轉錄和翻譯的調節信號功能性連接。另一個核酸構建體含有至少一個上述編碼β環化酶的核酸，其與一個或多個確保在植物中轉錄和翻譯的調節信號功能性連接，所述核酸編碼的β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
以下也將這些作用基因與一個或多個確保在植物中轉錄和翻譯的調節信號功能性連接的核酸構建體稱為表達盒。
優選調節信號含有一個或多個確保在植物中轉錄和翻譯的啟動子。
表達盒含有調節信號，即控制作用基因在宿主細胞中表達的調節性核酸序列。根據優選實施方案之一，表達盒包含上游啟動子(即位于編碼序列5’端)和下游多腺苷酸化信號(即位于編碼序列3’端)，并在適當時還含有與至少一個上述基因有效連接的其它調節元件，其中作用基因的編碼序列存在于所述調節元件中。“有效連接”是指啟動子、編碼序列、終止子和適當時的其它調節元件以各調節元件能夠在編碼序列的表達中發揮其預期功能的方式依次排列。
以下舉例描述了優選的用于植物的核酸構建體、表達盒和載體，以及產生轉基因植物的方法及轉基因植物自身。
用于有效連接的優選序列(但并不僅限于此)為確保在質外體、液泡、質體、線粒體、內質網(ER)、細胞核、油質體或其它區室中亞細胞定位的靶向序列，以及翻譯增強子(如煙草花葉病毒來源的5’前導序列)(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。
原則上能夠控制外源基因在植物中表達的任何啟動子都適合用作表達盒啟動子。
“組成型”啟動子是指在植物發育過程中的相對長時期(優選植物發育的全部時期)，確保在許多組織(優選所有組織)中表達的啟動子。
具體而言，優選使用植物啟動子或植物病毒來源的啟動子。特別優選花椰菜嵌合病毒35S轉錄物的CaMV啟動子(Franck等(1980)Cell 21285-294；Odell等(1985)Nature 313810-812；Shewmaker等(1985)Virology 140281-288；Gardner等(1986)Plant Mol Biol 6221-228)、19SCaMV啟動子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等(1989)EMBO J 82195-2202)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)來源的丙糖磷酸轉運蛋白(TPT)啟動子(Acc.No.AB006698，堿基對53242至55281，起始于bp 55282的基因被注釋為“磷酸/丙糖磷酸轉運蛋白”)，或玄參(figwort)嵌合病毒來源的34S啟動子(Acc.No.X16673，堿基對1到554)。
其他合適的組成型啟動子為pds啟動子(Pecker等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 894962-4966)或核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基(SSU)啟動子(US 4,962,028)、豆球蛋白B啟動子(GenBank Acc.No.X03677)、農桿菌胭脂堿合成酶啟動子、TR雙重啟動子、農桿菌OCS(章魚堿合成酶)啟動子、泛素啟動子(Holtorf S等(1995)Plant Mol Biol 29637-639)、泛素1啟動子(Christensen等(1992)Plant Mol Biol 18675-689；Bruce等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)、Smas啟動子、桂醇脫氫酶啟動子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亞基的啟動子或小麥來源富含脯氨酸的蛋白質的啟動子(WO 91/13991)、Pnit啟動子(Y07648.L，Hillebrand等(1998)，Plant.Mol.Biol.36，89-99，Hillebrand等(1996)，Gene，170，197-200)，以及本領域技術人員已知的在植物中組成型表達的其它基因的啟動子。
表達盒也可以含有化學誘導型啟動子(綜述文章Gatz等(1997)AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通過這種啟動子可以在某一特定時間點控制作用基因在植物中的表達。該類啟動子，例如PRP1啟動子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、水楊酸誘導的啟動子(WO95/19443)、苯磺酰胺誘導的啟動子(EP 0 388 186)、四環素誘導的啟動子(Gatz等(1992)Plant J 2397-404)、脫落酸誘導的啟動子(EP 0 335 528)或乙醇或環己酮誘導的啟動子(WO 93/21334)也同樣可使用。
優選的啟動子還有為生物或非生物應激所誘導的啟動子，例如病原體誘導的PRP1基因啟動子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22361-366)，熱誘導的番茄hsp70或hsp80啟動子(US 5,187,267)、冷誘導的馬鈴薯α-淀粉酶啟動子(WO 96/12814)、光誘導的PPDK啟動子或損傷誘導的pinII啟動子(EP375091)。
病原體誘導的啟動子包括受病原體攻擊誘導產生的基因的啟動子，如PR蛋白質、SAR蛋白質、β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶等的基因的啟動子(例如Redolfi等(1983)Neth J Plant Pathol 89245-254；Uknes等(1992)ThePlant Cell 4645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral 4111-116；Marineau等(1987)Plant Mol Biol 9335-342；Matton等(1987)MolecularPlant-Microbe Interactions 2325-342；Somssich等(1986)Proc Natl AcadSci USA 832427-2430；Somssich等(1988)Mol Gen Genetics 293-98；Chen等(1996)Plant J 10955-966；Zhang和Sing(1994)Proc Natl AcadSci USA 912507-2511；Warner等(1993)Plant J 3191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1961-968(1989))。
也包括損傷誘導的啟動子，如pinII基因啟動子(Ryan(1990)Ann RevPhytopath 28425-449；Duan等(1996)Nat Biotech 14494-498)、wun1和wun2基因啟動子(US 5,428,148)、win1和win2基因啟動子(Stanford等(1989)Mol Gen Genet 215200-208)、系統素(systemin)基因啟動子(McGurl等(1992)Science 2251570-1573)、WIP1基因啟動子(Rohmeier等(1993)Plant Mol Biol 22783-792；Ekelkamp等(1993)FEBS Letters 32373-76)、MPI基因啟動子(Corderok等(1994)The Plant J 6(2)141-150)等。
其它合適的啟動子有如果實成熟特異性啟動子，例如番茄果實成熟特異性啟動子(WO 94/21794、EP 409 625)。發育依賴的啟動子部分地包括組織特異性啟動子，因為個體組織的天然形成依賴于發育。
此外，特別優選那些確保在組織或植物部位中表達(例如生物合成酮類胡蘿卜素或其前體)的啟動子。優選啟動子有花藥、子房、花瓣、萼片、花、葉、莖、種子和根以及其組合特異性的啟動子。
球莖、塊莖、貯藏根或根特異性啟動子，例如I類patatin啟動子(B33)或馬鈴薯組織蛋白酶D抑制物啟動子。
葉特異性啟動子例如馬鈴薯胞質FBP酶啟動子(WO 97/05900)、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU啟動子(小亞基)或馬鈴薯ST-LSI啟動子(Stockhaus等(1989)EMBO J 82445-2451)。
花特異性啟動子例如八氫番茄紅素合成酶啟動子(WO 92/16635)或P-rr基因啟動子(WO 98/22593)、擬南芥AP3啟動子、CHRC啟動子(黃瓜(Cucumis sativus)來源的有色體特異的類胡蘿卜素相關蛋白質(CHRC)基因啟動子，Acc.No.AF099501，堿基對1至1532)、EPSP合成酶啟動子(碧冬茄(Petunia hybrida)來源的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因啟動子Acc.No.M37029，堿基對1至1788)、PDS啟動子(番茄(SolanumLycopersicum)來源的八氫番茄紅素去飽和酶基因啟動子Acc.No.U46919，堿基對1至2078)、DFR-A啟動子(碧冬茄來源的二氫黃酮醇4-還原酶基因A啟動子，Acc.No.X79723，堿基對32至1902)，或FBP1啟動子(碧冬茄來源的花結合蛋白1基因啟動子，Acc.No.L10115，堿基對52至1069)。
花藥特異性啟動子例如5126啟動子(US 5,689,049、US 5,689,051)、glob-I啟動子或g-玉米醇溶蛋白啟動子。
種子特異性啟動子，例如ACP05啟動子(酰基載體蛋白基因，WO9218634)、擬南芥屬AtS1和AtS3啟動子(WO 9920775)、蠶豆(Vicia faba)LeB4啟動子(WO 9729200和US 06403371)、歐洲油菜(Brassica napus)啟動子(US 5608152；EP 255378；US 5420034)、蠶豆SBP啟動子(DE 9903432)或玉米End1和End2啟動子(WO 0011177)。
其它適合在植物中表達的啟動子如Rogers等(1987)Meth in Enzymol153253-277；Schardl等(1987)Gene 611-11和Berger等(1989)Proc NatlAcad Sci USA 868402-8406中所述。
本發明方法中特別優選種子特異性、果實特異性、花特異性、特別是花瓣特異性的組成型啟動子。
優選通過如T.Maniatis、E.F.Fritsch和J.Sambrook，《MolecularCloningA Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)及T.J.Silhavy、M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusiohs，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，《Current Protocols inMolecular Biology》，G reene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述的常規重組和克隆技術，將合適的啟動子與至少一個上述作用基因融合并優選在啟動子與核酸序列之間插入的編碼質體特異性轉運肽的核酸及多腺苷酸化信號，來生成表達盒。
優選插入的編碼質體轉運肽的核酸能確保在質體(特別是有色體)中的定位。
也可以使用其核酸序列編碼作用基因產物融合蛋白的表達盒，其中融合蛋白質的一部分為控制多肽易位的轉運肽。優選有色體特異的轉運肽，其在作用基因轉移進有色體之后，可被酶解從作用基因產物部分中除去。
特別優選的轉運肽來自煙草(Nicotiana tabacum)質體轉酮酶或其它轉運肽(如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基(rbcS)的轉運肽或鐵氧還蛋白-NADP氧化還原酶的轉運肽，以及異戊烯-焦磷酸異構酶2的轉運肽)或其功能等價物。
特別優選三種煙草質體轉酮酶質體轉運肽盒的核酸序列，其以KpnI/BamHI片段的形式處于三個讀碼框中，其中ATG密碼子位于NcoI切割位點pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGG-GATCC_BamHI
pTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG-GATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGG-GATCC_BamHI其它質體轉運肽的實例有擬南芥質體異戊烯-焦磷酸異構酶2(IPP-2)的轉運肽，以及豌豆來源的核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)的轉運肽(Guerineau，F，Woolston，S，Brooks，L，Mullineaux，P(1988)An expressioncassette for targeting foreign proteins into the chloroplasts.Nucl.Acids Res.1611380)。
本發明核酸可以合成制備或從天然獲得，或者可以包含合成及天然核酸組分的混合物，并可以由多種生物來源的多個異源基因部分組成。
如上所述，優選具有植物優選密碼子的合成核苷酸序列。這些植物優選的密碼子，可以從大多數目的植物物種表達蛋白質時出現頻率最高的密碼子中確定。
在制備表達盒時，可以利用多種DNA片段以便獲得便于從正確方向閱讀并帶有正確閱讀框的核苷酸序列。可以在片段上附加連接子或接頭，將DNA片段彼此相連。
方便起見，以轉錄的方向提供具有接頭或多聚接頭的啟動子和終止子區域，所述接頭含有用于插入該核酸序列的一個或多個限制位點。一般地，接頭含有1至10，通常1至8，優選2至6個限制位點。接頭在調節區內的大小一般小于100bp，常常小于60bp，但至少長5bp。對于宿主植物而言，啟動子可以是天然的(或同源的)或外源的(或異源的)。表達盒優選以5’-3’轉錄方向含有啟動子、編碼核酸序列或核酸構建體，以及轉錄終止區。不同的終止區可以按需要互換。
終止子的實例有35S終止子(Guerineau等(1988)Nucl Acids Res.1611380)、nos終止子(Depicker A，Stachel S，Dhaese P，Zambryski P，Goodman HM.Nopaline synthasetranscript mapping and DNA sequence.J Mol Appl Genet.1982；1(6)561-73)或ocs終止子(Gielen，J，deBeuckeleer，M，Seurinck，J，Debroek，H，de Greve，H，Lemmers，M，vanMontagu，M，Schell，J(1984)The complete sequence of the TL-DNA of theAgrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5.EMBO J.3835-846)。
此外還可以進行操作，以提供適當的限制性切割位點，或刪除冗余DNA或限制性切割位點。可能進行插入、缺失或替換(如轉換和顛換)時，可以使用如體外誘變、引物修補、限制性酶切或連接的方法。
通過適當的操作(如限制性酶切、回嚼(chewing back)或將突出端填補成平端)，可提供進行連接的片段互補末端。
優選的多腺苷酸化信號是植物多腺苷酸化信號，優選那些基本上與根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)來源的T-DNA多腺苷酸化信號對應的信號，特別是Ti質粒pTiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835 ff)的T-DNA(章魚堿合成酶)基因3的多腺苷酸化信號或其功能等價物。
將外源基因轉移進植物基因組稱為轉化。
為此，可以使用已知的轉化和從植物組織或植物細胞再生植物的方法，以進行瞬時或穩定轉化。
適于轉化植物的方法有通過聚乙二醇誘導DNA攝取的原生質體轉化、使用基因槍的生物轟擊法——“粒子轟擊”法、電穿孔、在含有DNA的溶液中孵育干胚、顯微注射及上文所述農桿菌介導的基因轉移。所述方法描述于例如B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，《Transgenic Plants》，卷1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu編輯，AcademicPress(1993)，128-143和Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225。
優選將要表達的構建體克隆入適于轉化根癌農桿菌的載體，如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)，或特別優選pSUN2、pSUN3、pSUN4或pSUN5(WO 02/00900)。
用表達質粒轉化的農桿菌可以通過已知的方式用于轉化植物，例如在農桿菌溶液中浸浴損傷的葉子或葉子的碎片，并隨后培養在適當的培養基中。
為了優選制備遺傳修飾的植物(下文也稱為轉基因植物)，將融合表達盒克隆入適于在根癌農桿菌中轉化的載體，如pBin19，或特別是pSUN5和pSUN3。此后將通過已知方式將這種載體轉化的農桿菌用于轉化植物(特別是農作物)，例如，通過在農桿菌溶液中浸浴損傷的葉子或葉子的碎片，并隨后在適當的培養基中培養。
利用農桿菌進行植物轉化特別公開于F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；《Transgenic Plants》，卷1中“Engineering andUtilization”，S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press，1993，15-38頁。可以通過已知的方式從損傷的葉子或葉片段的轉化細胞進行轉基因植物再生，所述轉基因植物含有整合入表達盒的一個或多個基因。
為了用一個或多個本發明的作用基因轉化宿主植物，將表達盒插入其DNA中含有額外功能調節信號(如用于復制或整合的序列)的重組載體。合適的載體特別描述于《Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology》(CRC Press)，6/7章，71-119頁(1993)。
使用上文引用的重組和克隆技術，可以將表達盒克隆進能夠在如大腸桿菌中復制的適當載體中。合適的克隆載體有例如pJIT117(Guerineau等(1988)Nucl.Acids Res.1611380)、pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。特別合適的是能夠在大腸桿菌和農桿菌中復制的二元載體。
以下將通過實施例更為詳細地描述本發明中遺傳修飾微生物的產生，所述遺傳修飾的微生物具有增加的或造成的酮酶活性，以及增加的或造成的β環化酶活性(其修飾的β環化酶活性是由于該β環化酶含有SEQ IDNO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性)。
其他活性，如羥化酶活性、HMG-CoA還原酶活性、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性、異戊烯二磷酸酯Δ-異構酶活性、牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、八氫番茄紅素合酶活性、八氫番茄紅素去飽和酶活性、ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性和/或MinD活性，可以通過使用相應的作用基因得到類似的增加。
優選將上述編碼酮酶、β-羥化酶或β環化酶的核酸，以及編碼HMG-CoA還原酶的核酸、編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸、編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸、編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸、編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸、編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸、編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸、編碼八氫番茄紅素合酶的核酸、編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸、編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸、編碼crtISO蛋白的核酸、編碼FtsZ蛋白的核酸和/或編碼MinD蛋白的核酸插入表達構建體及載體中，其中所述構建體含有處在調節性核酸序列遺傳控制下的編碼本發明中酶的核酸序列，所述載體至少含有一個這類表達構建體。
優選本發明的這類構建體含有，位于特定編碼序列5’上游端的啟動子和3’端下游的終止子序列，并在適當時還含有每種情況下與作用基因有效連接的其它常規調節元件。“有效連接”指的是啟動子、編碼序列、終止子及適當時其它調節元件以各調節元件能夠在編碼序列的表達中發揮其預期功能的方式依次排列。
有效連接的序列的實例有靶向序列和翻譯增強子、增強子、多腺苷酸化信號等等。其它的調節元件包括選擇性標記、擴增信號、復制起點等等。
除了人工調節序列之外，在實際的作用基因前仍可以存在天然的調節序列。通過遺傳修飾可在需要時關閉這一天然調節作用，并增加或降低基因的表達。然而基因構建體也可以具有更簡單的結構，即在結構基因的前面沒有插入額外的調節信號，也沒有除去天然啟動子及其調節作用。反之則可以突變天然的調節序列使其不再產生調節作用，從而增加或降低基因表達。基因構建體中可以具有一個或多個拷貝的此類核酸序列。
可以使用的微生物啟動子有例如在革蘭氏陰性細菌中優先使用的cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc、ara-、SP6-、λ-PR-或λ-PL-啟動子，及革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2或酵母啟動子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH。特別優選使用可誘導的啟動子，如光、特別是溫度誘導的啟動子(如PrPl啟動子)。
原則上可以使用所有天然的啟動子及其調節序列。此外，也可以有利地使用合成的啟動子。
所述調節序列可使核酸序列的選擇性表達及蛋白質的表達成為可能。這可能意味著(例如取決于宿主生物的不同)基因只在誘導后表達或過表達，或是立即表達和/或過表達。
既然如此，可優選調節序列或因子使其正面影響表達，從而增加或降低之。因此，通過使用如啟動子和/或增強子之類的強轉錄信號，可以在轉錄水平上有利的實現調節元件的增強作用。然而，也可以例如通過提高mRNA的穩定性，增強翻譯。
通過將適當的啟動子與以上描述的編碼酮酶、β-羥化酶、β環化酶、HMG-CoA還原酶、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶、異戊烯二磷酸酯Δ-異構酶、牻牛兒基二磷酸酯合酶、法呢基二磷酸酯合酶、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶、八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶、ζ-胡蘿卜素去飽和酶、crtISO蛋白質、FtsZ蛋白質和/或MinD蛋白質的核酸序列，以及終止子或多腺苷酸化信號融合以產生表達盒。為此可使用如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，《Molecular CloningA LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，《Current Protocols in Molecular Biology》，GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)的常規重組和克隆技術。
為了在合適的宿主生物中表達，將重組核酸構建體或基因構建體有利的插入能使基因在宿主中最佳表達的宿主特異性載體。載體是本領域技術人員所熟知的，并可見于如《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等，編輯，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)。載體不僅指質粒，也指本領域技術人員已知的所有其它載體，如噬菌體、病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒)、轉座子、IS元件、質粒、粘粒和線性或環狀DNA。這些載體可以在宿主生物中自主復制或隨染色體復制。
可以提及的合適的表達載體的實例為常規融合表達載體，如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT 5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中重組目的蛋白質分別與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E-結合蛋白和A蛋白融合。
非融合蛋白表達載體，如pTrc(Amann等，(1988)Gene 69301-315)和pET 11d(Studier等Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)，或pBluescript及pUC載體。
用于在釀酒酵母中表達的酵母表達載體，如pYepSecl(Baldari等，(1987)Embo J.6229-234)、pMFα(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
適合用于其它真菌(如絲狀真菌)的載體以及構建載體的方法包括，van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)″Gene transfer systemsand vector development for filamentous fungi″，《Applied MolecularGenetics of Fungi》，J.F.Peberdy等編輯，1-28頁，Cambridge UniversityPressCambridge中詳細描述的載體和方法。
可用于在培養的昆蟲細胞(如Sf9細胞)中表達蛋白質的桿狀病毒載體，包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
其它合適的原核和真核細胞表達系統描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，《Molecular cloningA Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N Y，1989的第16和17章。
借助于本發明的表達構建體或載體，可以利用如至少一種本發明的載體進行轉化，制備遺傳修飾的生物。
將上述的本發明重組構建體有利的引入合適的宿主系統，并加以表達。這一步中，優選使用本領域技術人員熟悉的克隆和轉染方法(如共沉淀、原生質體融合、電穿孔、逆轉錄病毒轉染等)，以在特定表達系統中表達所述核酸。合適的系統如《Current Protocols in Molecular Biology》，F.Ausub等編輯，Wiley Interscience，New York 1997中所述。
可以通過同樣存在于載體或表達盒中的標記基因來挑選成功轉化的生物。這類標記基因的實例如抗生素耐藥基因及催化成色反應(使轉化細胞染色)的酶基因。然后可以通過自動細胞分選進行選擇。
可以通過含有適當抗生素的培養基或營養培養基來選擇被載體成功轉化的微生物，所述載體具有適當抗生素耐藥基因(如G418或潮霉素)。存在于細胞表面的標記蛋白質可用于親和層析法進行選擇。
宿主生物與適用于該生物的載體(如質粒、病毒或噬菌體，如具有RNA聚合酶/啟動子系統的質粒、噬菌體8或其它溫和噬菌體或轉座子)和/或其它有利的調節序列的組合形成了表達系統。
本發明還涉及遺傳修飾的非人生物，其中該遺傳修飾A對于已經具有酮酶活性的野生型生物，與野生型相比增加其酮酶活性，且
B對于不具有酮酶活性的野生型生物，與野生型相比造成酮酶活性，且其中該遺傳修飾C對于已經具有β環化酶活性的野生型生物，與野生型相比增加其β環化酶活性，且D對于不具有β環化酶活性的野生型生物，與野生型相比造成β環化酶活性，而C中增加的β環化酶活性或D中造成的β環化酶活性源于以下β環化酶，該β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
如上所述，優選通過提高編碼酮酶的核酸的基因表達，以相對于野生型增加(A中)或造成(B中)酮酶活性。
在另一個優選實施方案中，通過將編碼酮酶的核酸引入生物，提高編碼酮酶的核酸的基因表達。
該實施方案中，與野生型相比，本發明的轉基因生物中至少還存在一個酮酶基因。該實施方案中，本發明的遺傳修飾的生物優選具有至少一個編碼酮酶的外源(＝異源)核酸，或具有至少兩個編碼酮酶的內源核酸。
為此，原則上可以使用任何酮酶基因，即編碼酮酶的任何核酸。
優選的編碼酮酶的核酸如上面本發明方法所述。
如上所述，優選通過相對于野生型提高編碼β環化酶的核酸的基因表達，以增加或造成β環化酶活性，所述β環化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
在優選實施方案中，通過向生物中插入至少一個編碼β環化酶的核酸，提高編碼β環化酶的核酸的基因表達，所述β環化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
該實施方案中，與野生型相比，本發明的轉基因生物中至少還存在一個β環化酶基因。該實施方案中，本發明的遺傳修飾的生物優選具有至少一個編碼β環化酶的外源(＝異源)核酸，或具有至少兩個編碼β環化酶的內源核酸。
為此，原則上可以使用任何β環化酶基因，即編碼β環化酶的任何核酸，所述β環化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
優選的β環化酶如上所述。
如上所述，特別優選的遺傳修飾生物還具有相對于野生型生物增加或造成的羥化酶活性。其他優選實施方案如上面本發明方法所述。
此外，如上所述，特別優選的遺傳修飾的非人生物相對于野生型還具有選自HMG-CoA還原酶活性、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性、異戊烯二磷酸酯Δ-異構酶活性、牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、八氫番茄紅素合酶活性、八氫番茄紅素去飽和酶活性、ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性及MinD活性中至少一種增加的活性。其他優選實施方案如上面本發明方法所述。
本發明的生物優選指野生型或起始生物可天然產生或能夠通過遺傳互補和/或代謝途徑的再調節生產類胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素和/或玉米黃質和/或新葉黃素和/或紫黃質和/或葉黃素的生物。
其他優選的生物，野生型或起始生物已經具有羥化酶的活性，因此其野生型或起始生物即能產生玉米黃質。
優選生物為植物或微生物，例如，細菌、酵母、藻類或真菌。
使用的細菌可以是由于插入生產類胡蘿卜素的生物的類胡蘿卜素生物合成基因而能合成葉黃素的細菌(例如含有例如歐文氏菌來源的crt基因的埃希氏桿菌屬細菌)，以及自身即能夠合成葉黃素的細菌(如歐文氏菌屬、農桿菌屬、黃桿菌屬、產堿菌屬、副球菌屬、念珠藻屬的細菌或集胞藻屬的藍細菌)。
優選的細菌為大腸桿菌、草生歐文氏菌、噬夏孢歐文氏菌、橙黃農桿菌、產堿菌屬種PC-1、黃桿菌屬種R1534菌株、集胞藻屬藍細菌PCC6803、Paracoccus marcusii或Paracoccus carotinifaciens。
優選的酵母為假絲酵母、酵母、漢遜酵母、畢赤酵母)或法夫酵母。特別優選的酵母為Xanthopyvllomyces dendrorhous或Phaffia rhodozyma。
優選的真菌為曲霉、木霉、阿舒囊霉、脈孢菌、布拉霉(特別是Blakesleatrispora)、須霉、鐮孢霉或如Indian Chem.Engr.B部分卷37，No.1，2(1995)15頁表6中描述的其它真菌。
優選的藻類有綠藻，如紅球藻屬、三角褐指藻、團藻屬或杜氏藻屬的藻類。特別優選的藻類有雨生紅球藻或杜氏藻屬巴德成藻。
其它可用于實施本發明方法的微生物及其生產，公開于如，此處引用作為參考的DE-A-19916140。
特別優選的植物選自莧科、石蒜科、夾竹桃科、紫菀科、鳳仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫蘆科、十字花科、大戟屬、豆科、龍膽科、牻牛兒苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亞麻科、山梗菜屬、錦葵科、木犀科、蘭科、罌粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、報春花科、毛茛科、薔薇科、茜草科、玄參科、茄科、旱金蓮科、傘狀花科、毛蕊花科、葡萄科及紫羅蘭科。
極其優選的植物選自萬壽菊屬、萬壽菊、孔雀草、金合歡屬、烏頭屬、側金盞花屬、阿尼菊屬、耬斗菜屬、紫菀屬、黃芪屬、紫葳屬、金盞花屬、驢蹄草屬、風鈴草屬、美人蕉屬、矢車菊屬、桂竹香屬、苘蒿屬、柑桔屬、還陽參屬、番紅花屬、南瓜屬、金雀兒屬、Delonia屬、翠雀屬、石竹屬、康乃馨屬、多榔菊屬、花菱草屬、連翹屬、Fremontia屬、勛章菊屬、鉤吻屬、染料木屬、龍膽屬、老鸛草屬、非洲菊屬、路邊青屬、銀樺屬、堆心菊屬、向日葵屬、細辛屬、獨活屬、木槿屬、賽菊芋屬、金絲桃屬、黃金菊屬、鳳仙花屬、鳶尾屬、藍花楹屬、棣堂屬、毒豆屬、山黧豆屬、貓耳草屬、百合屬、亞麻屬、百脈根屬、番茄屬、珍珠菜屬、Maraia屬、苜蓿屬、溝酸漿屬、水仙屬、月見草屬、木犀屬、碧冬茄屬、石楠屬、酸漿屬、牧根草屬、委陵草屬、火棘屬、毛茛屬、杜鵑花屬、薔薇屬、金光菊屬、千里光屬、蠅子草屬、松香草屬、Sinapsis屬、花楸屬、鷹爪豆屬、黃鐘花屬、蝴蝶草屬、婆羅們參屬、金蓮花屬、旱金蓮屬、郁金香屬、款冬屬、荊豆屬、堇菜屬或百日草屬植物，特別優選萬壽菊屬、萬壽菊、孔雀草、番茄屬、薔薇屬、金盞花屬、酸漿屬、苜蓿屬、向日葵屬、苘蒿屬、紫菀屬、郁金香屬、水仙屬、碧冬茄屬、老鸛草屬、旱金蓮屬或側金盞花屬植物之一。
極其特別優選的遺傳修飾的植物選自萬壽菊屬、萬壽菊、孔雀草、側金盞花屬、番茄屬、薔薇屬、金盞花屬、酸漿屬、苜蓿屬、向日葵屬、茼蒿屬、紫菀屬、郁金香屬、水仙屬、碧冬茄屬、老鸛草屬或旱金蓮屬，遺傳修飾的植物含有至少一個編碼酮酶的轉基因核酸。
本發明還涉及轉基因植物、其繁殖物質以及其植物細胞、組織或部分，特別是其果實、種子、花及花瓣。
如上所述，遺傳修飾的植物可用于產生酮類胡蘿卜素，特別是蝦青素。
可以被人或動物食用的的本發明遺傳修飾生物，特別是植物或植物的部分(例如特別是酮類胡蘿卜素(特別是蝦青素)含量增加的花瓣)，也可以直接或經過已知的方式加工后用作食品和飼料或食品和飼料的添加劑。
此外，遺傳修飾生物也可以用于制備含有酮類胡蘿卜素的生物提取物和/或制備食品和飼料添加劑。
與野生型相比，遺傳修飾生物的酮類胡蘿卜素含量增加。
酮類胡蘿卜素含量的增加通常指酮類胡蘿卜素總含量的增加。
然而，酮類胡蘿卜素含量的增加也特別指優選的酮類胡蘿卜素含量的改變，而總的類胡蘿卜素含量不一定增加。
在特別優選的實施方案中，相對于野生型，本發明遺傳修飾的植物的蝦青素含量增加。
在這種情況下，增加的含量也指造成的酮類胡蘿卜素(如蝦青素)的含量。
通過以下的實施例(但并不僅限于此)對本發明進行說明。
一般實驗條件重組DNA序列分析根據Sanger的方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467)，利用Licor激光熒光DNA測序儀(MWG Biotech，Ebersbach所售)對重組DNA分子測序。
實施例1擴增念珠藻屬PCC 7120來源的編碼NOST酮酶的完整一級序列DNA通過PCR從念珠藻屬PCC 7120(″Pasteur Culture Collection ofCyanobacterium″菌株)中擴增編碼念珠藻屬PCC 7120的NOST酮酶DNA。
為了從念珠藻屬PCC 7120懸浮培養物制備基因組DNA，將細胞離心收集，冷凍于液氮，并在研缽中碾磨成粉。所述懸浮培養物在25℃、連續光照且恒定振蕩(150rpm)條件下于BG 11培養基(1.5g/l NaNO3、0.04g/lK2PO4×3H2O、0.075g/l MgSO4×H2O、0.036g/l CaCl2×2H2O、0.006g/l檸檬酸、0.006g/l檸檬酸鐵銨、0.001g/l EDTA二鈉鎂、0.04g/l Na2CO3、1ml痕量金屬混合物A5+Co(2.86g/l H3BO3、1.81g/l MnCl2×4H2O、0.222g/lZnSO4×7H2O、0.39g/l NaMoO4×2H2O、0.079g/l CuSO4×5H2O、0.0494g/lCo(NO3)2×6H2O))中生長1周。
從念珠藻PCC 7120中分離DNA的方法在8000rpm離心10分鐘，從10ml液體培養物中沉淀細菌細胞。然后用研缽在液氮中粉碎并碾磨細胞。將細胞材料重懸浮于1ml 10mM TrisHCl(pH 7.5)，并轉移至Eppendorf反應試管(容積2ml)內。加入100μl蛋白酶K(濃度20mg/ml)后，將細胞懸浮液在37℃孵育3小時。隨后用500μl苯酚抽提懸浮液。在13000rpm離心5分鐘后，將上層水相轉移到新的2ml Eppendorf反應試管中。用苯酚反復抽提3次。加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH 5.2)和0.6體積的異丙醇沉淀DNA，然后用70％的乙醇洗滌。在室溫干燥DNA沉淀，加入25μl水，并加熱至65℃溶解。
通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用正義特異引物(NOSTF，SEQ ID NO79)和反義特異引物(NOSTG SEQ ID NO80)從念珠藻屬PCC 7120中擴增編碼念珠藻屬PCC 7120酮酶的核酸。
使用的PCR條件如下在50μl反應混合物中用PCR擴增編碼由完整一級序列組成的酮酶蛋白質的DNA，所述混合物含有-1μl念珠藻屬PCC 7120 DNA(如上述制備)-0.25mM dNTP-0.2mM NOSTF(SEQ ID NO.79)-0.2mM NOSTG(SEQ ID NO80)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8μl蒸餾水在以下循環條件下進行PCR1X94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘55℃ 1分鐘72℃ 3分鐘1X72℃ 10分鐘利用SEQ ID NO.79和SEQ ID NO80進行PCR擴增產生了805bp的片段，所述片段編碼由完整一級序列組成的蛋白質(SEQ ID NO81)。使用標準方法，將擴增子克隆進PCR克隆載體pGEM-T(Promega)，獲得pNOSTF-G克隆。
使用M 13F和M 13R引物對pNOSTF-G克隆的測序確證了與數據庫條目AP003592的88,886-89,662之DNA序列一致的序列。此核苷酸序列在獨立的擴增實驗中可以重復，因此代表使用的念珠藻屬PCC 7120中的核苷酸序列。
因此，該pNOSTF-G克隆被用于克隆進表達載體pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。通過從pNOSTF-G分離799bp SphI片段并連接進SphI切割的pJIT117載體，完成這一克隆。以正確方向含有念珠藻屬PCC 7120酮酶的克隆被稱為pJNOST，其中酮酶的N-末端與rbcS轉運肽翻譯融合。
實施例2構建質粒pMCL-CrtYIBZ/idi/gps，用于在大腸桿菌中合成玉米黃質。
經中間體pMCL-CrtYIBZ和pMCL-CrtYIBZ/idi，通過3個步驟構建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps。使用的載體是與高拷貝數載體相容的pMCL200質粒(Nakano，Y.，Yoshida，Y.，Yamashita，Y.和Koga，T.；Construction of a series of pACYC-derived plasmid vectors；Gene 162(1995)，157-158)。
實施例2.1構建pMCL-CrtYIBZ生物合成基因crtY、crtB、crtI和crtZ來自噬夏孢歐文氏菌，并通過PCR方法擴增。噬夏孢歐文氏菌(DSM 30080)的基因組DNA由GermanCollection of Microorganisms and Cell Culture(DSMZ，Brunswick，Germany)作為提供的服務而制備。根據制造商提供的詳細信息進行PCR(Roche，Long Template PCRProcedure for amplification of 5-20kbtargets with the expand long template PCR system)。擴增噬夏孢歐文氏菌生物合成簇的PCR條件如下Master Mix 1-1.75μl dNTP(終濃度350μM)-0.3μM引物Crt1(SEQ ID NO82)-0.3μM引物Crt2(SEQ ID NO83)-250-500ng DSM 30080基因組DNA
加蒸餾水至總體積50μlMaster Mix 2-5μl 10x PCR緩沖液1(終濃度1x，含1.75mM Mg2+)-10x PCR緩沖液2(終濃度1x，含2.25mM Mg2+)-10x PCR緩沖液3(終濃度1x，含2.25mM Mg2+)-0.75μl Expand Long Template Enzyme Mix(終濃度2.6單位)加蒸餾水至總體積50μl用移液器將兩種混合物“Master Mix 1”和“Master Mix 2”混合。在50μl總體積中以如下循環條件進行PCR1X 94℃ 兩分鐘30X 94℃ 30秒58℃ 1分鐘68℃ 4分鐘1X 72℃ 10分鐘使用SEQ ID NO82和SEQ ID NO83進行PCR擴增產生了編碼基因CrtY(蛋白質SEQ ID NO85)、CrtI(蛋白質SET NID NO.86)、crtB(蛋白質SEQ ID NO87)和CrtZ(iDNA)的片段(SEQ ID NO84)。使用標準方法，將擴增子克隆進PCR克隆載體pCR2.1(Invitrogen)，獲得pCR2.1-CrtYIBZ克隆。
用SalI和HindIII切割pCR2.1-CrtYIBZ質粒，分離所產生的SalI/HindIII片段，并通過連接將其轉移進SalI/HindIII切割的pMCL200載體。克隆入pMCL 200的pCR2.1-CrtYIBZ SalI/HindIII片段長度為4624bp，編碼CrtY、CrtI、crtB和CrtZ基因，對應D90087中2295位點到6918位點的序列(SEQ ID NO84)。通過CrtZ基因內源性啟動子，逆CrtY、CrtI和CrtB基因的閱讀框方向轉錄該基因。產生的克隆被稱為pMCL-CrtYIBZ。
實施例2.2構建pMCL-CrtYIBZ/idi
通過PCR方法從大腸桿菌中擴增idi(異戊烯二磷酸異構酶；IPP異構酶)基因。使用正義特異引物(5′-idi SEQ ID NO88)和反義特異引物(3′-idi SEQ ID NO89)，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，從大腸桿菌中擴增包含idi啟動子和核糖體結合位點的編碼完整idi基因的核酸。
PCR條件如下擴增DNA的PCR在50μl反應混合物中進行，其中含有-1μl大腸桿菌TOP10懸浮液-0.25mM dNTP-0.2mM 5′-idi(SEQ ID NO88)-0.2mM 3′-idi(SEQ ID NO89)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸餾水以下循環條件中進行PCR1X94℃ 2分鐘20X 94℃ 1分鐘62℃ 1分鐘72℃ 1分鐘1X72℃ 10分鐘利用SEQ ID NO88和SEQ ID NO89進行PCR擴增產生679bp的片段，該片段編碼由完整一級序列(SEQ ID NO90)組成的蛋白質。使用標準方法，將擴增子克隆進PCR克隆載體pCR2.1(Invitrogen)，獲得pCR2.1-idi克隆。
對pCR2.1-idi克隆的測序確證了與發表的AE000372序列8774到9440位置無異的序列。這一區域包括啟動子區域、可能的核糖體結合位點和完整的IPP異構酶開放閱讀框。由于在idi基因的5，端插入了XhoI切割位點、3’端插入了SalI切割位點，克隆進pCR2.1-idi的片段總長為679bp。
因此，使用該克隆將idi基因克隆進pMCL-CrtYIBZ載體。通過從pCR2.1-idi分離XhoI/SalI片段并連接進XhoI/SalI切割的pMCL-CrtYIBZ載體完成這一克隆。產生的克隆被稱為pMCL-CrtYIBZ/idi。
實施例2.3.構建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps通過PCR方法從嗜超高溫硫酸根還原古細菌(Archaeglobus fulgidus)中擴增gps(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶；GGPP合酶)基因。使用正義特異引物(5′-gps SEQ ID NO92)和反義特異引物(5′-gps SEQ ID NO93)，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增嗜超高溫硫酸根還原古細菌gps基因。
嗜超高溫硫酸根還原古細菌DNA由German Collection ofMicroorganisms and Cell Culture(DSMZ，Brunswick，Germany)作為提供的服務而制備。PCR條件如下在50μl反應混合物中用PCR擴增編碼由完整一級序列組成的GGPP合酶蛋白質的DNA，所述混合物含有-1μl嗜超高溫硫酸根還原古細菌DNA-0.25mM dNTP-0.2mM 5′-gps(SEQ ID NO92)-0.2mM 3′-gps(SEQ ID NO93)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸餾水在以下循環條件進行PCR1X 94℃ 2分鐘20X94℃ 1分鐘56℃ 1分鐘72℃ 1分鐘1X 72℃ 10分鐘用已知方法從瓊脂糖凝膠中洗脫利用PCR和SEQ ID NO92及SEQID NO93引物擴增的DNA片段，并用限制酶NcoI和HindIII切割之。由此產生編碼由完整一級序列(SEQ ID NO94)組成蛋白質的962bp片段。使用標準方法，將NcoI/HindIII切割的擴增子克隆進pCB97-30載體，獲得pCB-gps克隆。
對pCB-gps克隆的測序確證了與發表的AF120272序列有一個核苷酸差異的A.fulgidus GGPP合酶序列。在gps基因中引入一個NcoI切割位點，改變GGPP合酶的第二個密碼子。在發表的AF120272序列中，CTG(4-6位點)編碼亮氨酸。使用SEQ ID NO92和SEQ ID NO93兩種引物的擴增將此第二密碼子改變為編碼纈氨酸的GTG。
因此，使用pCB-gps克隆將gps基因克隆進pMCL-CrtYIBZ/idi載體。通過從pCB-gps中分離KpnI/XhoI片段并連接進用KpnI和XhoI切割的pMCL-CrtYIBZ/idi載體完成這一克隆。克隆的KpnI/XhoI片段(SEQ IDNO94)帶有Prrn 16啟動子和rbcL的最小5’UTR序列、延伸GGPP合酶N末端的前6個rbcL密碼子和gps基因3’端的psbA序列。因此該GGPP合酶的N末端具有改變的氨基酸序列Met-Thr-Pro-Gln-Thr-Ala-Met-Val-Lys-Glu，而不是天然氨基酸序列Met-Leu-Lys-Glu(AF120272的1到4位氨基酸)。這使得重組GGPP合酶從位點3(在AF120272中)的Lys開始在氨基酸序列上具有同一性，并且沒有更多改變。參考Eibl等(Plant J.19.(1999)，1-13)使用rbcL和psbA序列。產生的克隆被稱為pMCL-CrtYIBZ/idi/gps。
實施例3在重組大腸桿菌菌株中生物轉化玉米黃質為進行玉米黃質的生物轉化，通過異源互補制備能產生玉米黃質的重組大腸桿菌菌株。大腸桿菌TOP10菌株作為宿主細胞，用于用質粒pNOSTF-G和pMCL-CrtYIBZ/idi/gps的互補實驗。
為了制備可合成高濃度玉米黃質的大腸桿菌菌株，構建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps質粒。該質粒帶有噬夏孢歐文氏菌的生物合成基因crtY、crtB、crtI和crtY、嗜超高溫硫酸根還原古細菌的gps(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶)基因和大腸桿菌idi(異戊烯二磷酸異構酶)基因。該構建體解除了類胡蘿卜素以及其生物合成前體大量聚積的限速步驟。這一點已由Wang等之前使用若干質粒以相似的方式描述(Wang，C.-W.，Oh，M.-K.和Liao，J.C.；Engineered isoprenoid pathway enhances astaxanthinproduction in Escherichia coli，Biotechnology and Bioengineering 62(1999)，235-241)。
使用pNOSTF-G和pMCL-CrtYIBZ/idi/gps兩種質粒，以已知的方式轉化大腸桿菌TOP 10培養物，并在30℃或37℃的LB培養基培養過夜。同樣通過已知的方式加入氨芐青霉素(50μg/ml)、氯霉素(50μg/ml)和異丙基-β-硫代半乳糖苷(1mmol)培養過夜。
為從重組菌株中分離類胡蘿卜素，用丙酮抽提細胞，將有機溶劑蒸干，并通過HPLC方法在C30柱上分離類胡蘿卜素。條件設置如下。
分離柱Prontosil C30柱、250×4.6mm(Bischoff，Leonberg)流速1.0ml/min洗脫液洗脫液A-100％甲醇洗脫液B-80％甲醇、0.2％醋酸胺洗脫液C-100％叔丁基甲基醚梯度曲線

檢測300-500nm使用光(電)二極管矩陣檢測器直接從洗脫峰檢測光譜。
通過與標準樣品比較吸收光譜和保留時間，鑒定分離的物質。
實施例4與先前的實施例類似，制備表達雨生紅球藻Flotow em.Wille來源的酮酶大腸桿菌菌株。為此，擴增編碼雨生紅球藻Flotow em.Wille酮酶完整一級序列的cDNA，并將此cDNA克隆進與實施例1相同的表達載體中。
通過對雨生紅球藻(″Collection of algal cultures of the University ofG_ttingen″的192.80菌株)懸浮培養物進行PCR，擴增編碼雨生紅球藻酮酶的cDNA。為了從雨生紅球藻(192.80菌株)懸浮培養物中制備總RNA，收集細胞，在液氮中冷凍，并在研缽中碾磨成粉，所述懸浮培養物在室溫間接日光條件下于紅球藻培養基(1.2g/l醋酸鈉、2g/l酵母提取物、0.2g/lMgCl2×6H2O、0.02CaCl2×2H2O；pH 6.8；高壓滅菌后加入400mg/l L-天冬酰胺、10mg/1FeSO4×H2O)中生長兩周。隨后將100mg冷凍的藻類細胞研磨粉末轉移到反應試管內，并加入0.8ml Trizol緩沖液(LifeTechnologies)。用0.2ml氯仿抽提懸浮液。12000g離心15分鐘后，將水相上清液轉移到新的反應試管內，并用一體積的乙醇抽提。用一體積異丙醇沉淀RNA，用75％的乙醇洗滌并將沉淀溶解于DEPC水(用1/1000體積焦碳酸二乙酯水在室溫孵育過夜，然后高壓滅菌)。通過分光光度法測定RNA濃度。
為合成cDNA，將2.5μg總RNA在60℃變性10分鐘，冰上冷卻2分鐘，并按照制造商說明，使用反義特異引物PR1(gcaagctcga cagctacaaa cc)，通過cDNA試劑盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)轉錄成cDNA。
利用正義特異引物PR2(gaagcatgca gctagcagcgacag)和反義特異引物PR1，對雨生紅球藻進行聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增編碼雨生紅球藻(192.80菌株)酮酶的核酸。
PCR條件如下在50μl反應混合物中用PCR擴增編碼由完整一級序列組成的酮酶蛋白質的DNA，所述混合物含有-4ml雨生紅球藻cDNA(如上述制備)-0.25mM dNTP-0.2mM PR1-0.2mM PR2-5ml 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8ml蒸餾水在以下循環條件進行PCR1X 94℃ 2分鐘35X94℃ 1分鐘53℃ 2分鐘72℃ 3分鐘1X 72℃ 10分鐘利用PR1和PR2進行PCR擴增產生編碼由完整一級序列組成蛋白質的1155bp片段gaagcatgca gctagcagcg acagtaatgt tggagcagct taccggaagc gctgaggcac 60tcaaggagaa ggagaaggag gttgcaggca gctctgacgt gttgcgtaca tgggcgaccc120agtactcgct tccgtcagag gagtcagacg cggcccgccc gggactgaag aatgcctaca180agccaccacc ttccgacaca aagggcatca caatggcgct agctgtcatc ggctcctggg240ccgcagtgtt cctccacgcc atttttcaaa tcaagcttcc gacctccttg gaccagctgc300actggctgcc cgtgtcagat gccacagctc agctggttag cggcagcagc agcctgctgc360acatcgtcgt agtattcttt gtcctggagt tcctgtacac aggccttttt atcaccacgc420atgatgctat ccatggcacc atcgccatga gaaacaggca gcttaatgac ttcttgggca480gagtatgcat ctccttgtac gcctggtttg attacaacat gctgcaccgc aagcattggg540agcaccacaa ccacactggc gaggtgggca aggaccctga cttccacagg ggaaaccctg600gcattgtgcc ctggtttgcc agcttcatgt ccagctacat gtcgatgtgg cagtttgcgc660gcctcgcatg gtggacggtg gtcatgcagc tgctgggtgc gccaatggcg aacctgctgg720tgttcatggc ggccgcgccc atcctgtccg ccttccgctt gttctacttt ggcacgtaca780tgccccacaa gcctgagcct ggcgccgcgt caggctcttc accagccgtc atgaactggt840ggaagtcgcg cactagccag gcgtccgacc tggtcagctt tctgacctgc taccacttcg900acctgcactg ggagcaccac cgctggccct ttgccccctg gtgggagctg cccaactgcc960gccgcctgtc tggccgaggt ctggttcctg cctagctgga cacactgcag tgggccctgc 1020tgccagctgg gcatgcaggt tgtggcagga ctgggtgagg tgaaaagctg caggcgctgc 1080tgccggacac gctgcatggg ctaccctgtg tagctgccgc cactagggga gggggtttgt 1140agctgtcgag cttgc使用標準方法，將擴增子克隆進PCR克隆載體pGEM-Teasy(Promega)，獲得pGKETO2克隆。
表10

表10中的數據表明，當3種整合酶中的每種整合酶與IHF和切除酶遞送時，它都介導植物染色質中的分子內L/R重組。
VI.煙草中的定向整合A.利用農桿菌介導的轉化遞送的供體序列和Int1.陽性對照雙元載體的構建實施例72用整合酶體外處理質粒CMPSVLucB/P以形成CMPSVLucIntronAttL，一種含有具有attL位點的內含子的陽性對照螢光素酶構建體利用來源于Gateway克隆試劑盒(Invitrogen)的酶和緩沖液，將約300ng質粒VCMLucB/P(2μl)與10μl水，4μl BP緩沖液和4μl BP克隆酶混合，并且在25℃溫育1.5小時。用一半反應混合物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α。通過用Asp718I和BglII消化小量制備物鑒定分子內反應產物CMPSVLucIntronAttL。
2.靶序列的構建在這里所述的示例性構建體中，用于將靶序列插入到煙草中的質粒<p>從點形念珠藻ATCC 29133中分離DNA的方法在8000rpm離心10分鐘，從10ml液體培養物中沉淀細菌細胞。然后用研缽在液氮中粉碎并碾磨細菌細胞。將細胞材料重懸浮于1ml 10mMTris HCI(pH7.5)，并轉移至Eppendorf反應試管(容積2ml)。加入100μl蛋白酶K(濃度20mg/ml)后，將細胞懸浮液在37℃孵育3小時。隨后用500μl苯酚抽提懸浮液。在13000rpm離心5分鐘后，將上層水相轉移到新的2ml Eppendorf反應試管中。用苯酚反復抽提3次。加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH 5.2)和0.6體積的異丙醇沉淀DNA，然后用70％的乙醇洗滌。在室溫干燥DNA沉淀，加入25μl水，并加熱至65℃溶解。
通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用正義特異引物(NP196-1，SEQ ID NO100)和反義特異引物(NP196-2SEQ ID NO101)從點形念珠藻ATCC29133中擴增編碼點形念珠藻ATCC 29133酮酶的核酸。
PCR條件如下在50μl反應混合物中用PCR擴增編碼由完整一級序列組成的酮酶蛋白質的DNA，所述混合物含有-1μl點形念珠藻ATCC29133DNA(如上述制備)-0.25mM dNTP-0.2mM NP196-1(SEQ ID NO100)-0.2mM NP196-2(SEQ ID NO101)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8μl蒸餾水在以下循環條件下進行PCR1X 94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘55℃ 1分鐘72℃ 3分鐘1X 72℃ 10分鐘利用SEQ ID NO100和SEQ ID NO101進行PCR擴增產生792bp的片段，所述片段編碼由完整一級序列(NP196，SEQ ID NO102)組成的蛋白質。使用標準方法，將擴增子克隆進PCR克隆載體pCR 2.1(Invitrogen)，獲得pNP196克隆。
使用引物M13F和M13R對pNP196克隆的測序確證了與數據庫NZ AABC01000196條目140,571-139,810的DNA序列一致的序列(與發表的數據庫條目方向相反)，只是其中140,571位點的G被A取代以產生標準的起始密碼子ATG。該核苷酸序列在獨立擴增實驗中可以重復，因此代表所用的點形念珠藻ATCC 29133中的核苷酸序列。
因此，該pNP196克隆被用于克隆進表達載體pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。
用根癌農桿菌Ti質粒pTi15955的OCS終止子(章魚堿合酶)(數據庫條目X00493，12,541-12,350位點，Gielen等(1984)EMBO J.3835-846)替換35S終止子，對pJIT117進行修飾。
使用質粒pHELLSGATE(數據庫條目AJ311874，Wesley等(2001)Plant J.27581-590，用標準方法從大腸桿菌中分離)以及引物OCS-1(SEQ ID NO133)和OCS-2(SEQ ID NO134)，通過PCR方法制備含有OCT終止子區域的DNA片段。
PCR條件如下在50μl反應混合物中進行擴增含有章魚堿合酶(OCS)終止子區域DNA(SEQ ID NO106)的PCR，所述混合物中含有-100ng pHELLSGATE質粒DNA-0.25mM dNTP-0.2mM OCS-1(SEQ ID NO104)-0.2mM OCS-2(SEQ ID NO105)-5μl 10X PCR緩沖液(Stratagene)-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸餾水在以下循環條件下進行PCR1X 94℃ 2分鐘35X94℃ 1分鐘50℃ 1分鐘72℃ 1分鐘1X 72℃ 10分鐘使用標準方法，將210bp擴增子克隆進PCR克隆載體pCR 2.1(Invitrogen)，獲得pOCS質粒。
對pOCS克隆測序確證了與根癌農桿菌Ti質粒pTi15955(數據庫條目X00493)上12,541-12,350位點對應的序列部分。
從pOCS分離210bp的SalI-XhoI片段并將其連入SalI-XhoI切割的pJIT117載體，完成這一克隆。
該克隆被稱為pJO，并用于克隆進表達載體pJONP196。
從pNP196分離782bp的SphI片段，并將其連入SphI切割的pJO載體，從而完成克隆。以正確方向含有點形念珠藻NP196酮酶的克隆被稱為pJONP196，其中酮酶的N-末端與rbcS轉運肽翻譯融合。
實施例6制備用于在食用番茄和萬壽菊中組成性表達點形念珠藻ATCC 29133來源的NP196酮酶的表達載體食用番茄和萬壽菊中點形念珠藻NP196酮酶的表達，是在擬南芥來源的組成型啟動子FNR(鐵氧還蛋白NADPH氧化還原酶，數據庫條目AB011474，70127到69493位；WO 03/006660)控制下進行的。FNR基因起始于69492堿基對，并被命名為“鐵氧還蛋白-NADP+還原酶”。使用豌豆轉運肽rbcS(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)進行表達。
使用基因組DNA(通過標準方法從擬南芥中分離)及引物FNR-1(SEQID NO107)和FNR-2(SEQ ID NO108)，通過PCR方法制備含有擬南芥FNR啟動子區域的DNA片段。
PCR條件如下在50μl反應混合物中進行擴增含有FNR啟動子片段FNR的DNA(SEQ ID NO109)的PCR，所述混合物含有-100ng擬南芥基因組DNA-0.25mM dNTP-0.2mM FNR-1(SEQ ID NO107)-0.2mM FNR-2(SEQ ID NO108)-5μl 10X PCR緩沖液(Stratagene)-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸餾水在以下循環條件下進行PCR1X 94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘50℃ 1分鐘72℃ 1分鐘IX 72℃ 10分鐘使用標準方法將652bp擴增子克隆進PCR克隆載體pCR 2.1(Invitrogen)，獲得pFNR質粒。
對pFNR克隆的測序確證了與擬南芥5號染色體上70127到69493位點(數據庫條目AB011474)對應的序列片段。
該克隆被稱為pFNR，并因此被用于克隆進表達載體pJONP196(如實施例5所述)。
從pFNR分離644bp的SmaI-HindIII片段，并將其連入Ecl136II-HindIII切割的pJONP196載體來完成克隆。含有FNR啟動子而非原始d35S啟動子且以正確方向含有NP196片段的克隆被稱為pJOFNRNP196，所述NP196片段的N-末端與rbcS轉運肽融合。
使用二元載體pSUN3(WO 02/00900)制備用于農桿菌介導下向食用番茄轉化念珠藻NP196酮酶的表達盒。
為制備表達載體MSP105，將來自pJOFNRNP196的1839bpEcoRI-XhoI片段與EcoRI-XhoI切割的pSUN3載體相連。表達載體MSP105含有FNR啟動子片段--FNR啟動子(635bp)、rbcS TP FRA GMENT片段--豌豆rbcS轉運肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--編碼點形念珠藻NP196酮酶、OCS終止子片段(192bp)--章魚堿合酶的多聚腺苷酸化信號。
使用二元載體pSUN5(WO 02/00900)制備用于農桿菌介導下向萬壽菊轉化含有點形念珠藻NP196酮酶的表達載體的表達盒。
為制備萬壽菊表達載體MSP106，將來自pJOFNR:NP196的1839bp的EcoRI-XhoI片段與EcoRI-XhoI切割的pSUN5載體相連。MSP106含有FNR啟動子片段--FNR啟動子(635bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS轉運肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--編碼點形念珠藻NP196酮酶、OCS終止子片段(192bp)--章魚堿合酶的多聚腺苷酸化信號。
實施例7制備用于在食用番茄和萬壽菊中花特異性表達點形念珠藻ATCC29133來源的NP196酮酶的表達載體使用豌豆rbcS轉運肽(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)，在食用番茄和萬壽菊中表達點形念珠藻NP196酮酶。該表達在碧冬茄來源的花特異性啟動子EPSPS(數據庫條目M37029；核苷酸區域7-1787；Benfey等(1990)Plant Cell 2849-856)的控制下進行。
使用基因組DNA(通過標準方法從碧冬茄中分離)及引物EPSPS-1(SEQ ID NO110)和EPSPS-2(SEQ ID NO111)，通過PCR方法制備含有碧冬茄EPSPS啟動子區域的DNA片段(SEQ ID NO112)。
PCR條件如下在50μl反應混合物中進行擴增含有EPSPS啟動子片段(數據庫條目M37029核苷酸區域7-1787)DNA的PCR，所述混合物含有-100ng擬南芥基因組DNA
-0.25mM dNTP-0.2mM EPSPS-1(SEQ ID NO110)-0.2mM EPSPS-2(SEQ ID NO111)-5μl 10X PCR緩沖液(Stratagene)-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸餾水在以下循環條件下進行PCR1X 94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘50℃ 1分鐘72℃ 2分鐘1X 72℃ 10分鐘使用標準方法將1773bp擴增子克隆進PCR克隆載體pCR 2.1(Invitrogen)，獲得pEPSPS質粒。
對pEPSPS克隆的測序確證了與發表的EPSPS序列(數據庫條目M37029核苷酸區域7-1787)僅相差兩個缺失(M37029序列46-58位點的ctaagtttcagga堿基；M37029序列1422-1429位點的aaaaatat堿基)及堿基置換(T替換M37029序列1447位點的G；A替換M37029序列1525位點的C；A替換M37029序列1627位點的G)的序列。這兩個缺失和M37029序列1447及1627位點的兩個堿基置換在獨立擴增實驗中可以重復，因此代表實際所用的碧冬茄植物的核苷酸序列。
因此，pEPSPS克隆被用于克隆進pJONP196表達載體(如實施例5所述)。
通過從pEPSPS分離1763bp的SacI-HindIII片段，并將其連接進SacI-HindIII切割的JONP196載體來完成克隆。含有EPSPS啟動子而非原始d35S啟動子的克隆被稱為pJOESP:NP196。該表達盒以正確方向含有NP196片段，所述片段的N-末端與rbcS轉運肽融合。
使用二元載體pSUN3(WO 02/00900)制備用于農桿菌介導下向食用番茄轉化EPSPS控制的點形念珠藻ATCC 29133 NP196酮酶的表達載體。
為制備表達載體MSP107，將來自pJOESP:NP196的2961KBbpSachI-XhoI片段與SacI-XhoI切割的pSUN3載體相連。表達載體MSP107含有EPSPS片段--EPSPS啟動子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS轉運肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--編碼點形念珠藻NP196酮酶、OCS終止子片段(192bp)--章魚堿合酶的多聚腺苷酸化信號。
使用二元載體pSUN5(WO 02/00900)制備用于農桿菌介導下向萬壽菊轉化EPSPS控制的點形念珠藻NP196酮酶的表達載體。
為制備表達載體MSP108，將來自pJOESP:NP196的2961 KBbp的SachI-XhoI片段與SacI-XhoI切割的pSUN5載體相連。表達載體MSP108含有EPSPS片段--EPSPS啟動子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS轉運肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--編碼點形念珠藻NP196酮酶、OCS終止子片段(192bp)--章魚堿合酶的多聚腺苷酸化信號。
實施例8擴增編碼點形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶完整一級序列的DNA通過PCR方法，從點形念珠藻ATCC 29133(美國典型培養物保藏中心菌株)擴增編碼點形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶的DNA。從點形念珠藻ATCC 29133的懸浮培養物中制備基因組DNA已在實施例5中描述。
使用正義特異引物(NP195-1，SEQ ID NO113)和反義特異引物(NP195-2SEQ ID NO114)，通過聚合酶鏈式反應(PCR)從點形念珠藻ATCC 29133中擴增編碼點形念珠藻ATCC 29133酮酶的核酸。
PCR條件如下在50μl反應混合物中用PCR擴增編碼由完整一級序列組成的酮酶蛋白質的DNA，所述混合物含有-1μl點形念珠藻ATCC 29133 DNA(如上述制備)
-0.25mM dNTP-0.2mM NP195-1(SEQ ID NO113)-0.2mM NP195-2(SEQ ID NO114)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8μl蒸餾水在以下循環條件下進行PCR1X 94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘55℃ 1分鐘72℃ 3分鐘1X 72℃ 10分鐘利用SEQ ID NO113和SEQ ID NO114進行PCR擴增產生819bp的片段，所述片段編碼由完整一級序列(NP195，SEQ ID NO115)組成的蛋白質。使用標準方法，將擴增子克隆進PCR克隆載體pCR 2.1(Invitrogen)，獲得pNP195克隆。
使用M13F和M13R引物對pNP195克隆的測序確證了與數據庫NZ AABC010001965條目55,604-56,392的DNA序列一致的序列，只是其中55,604位點的T被A替換以產生標準的起始密碼子ATG。該核苷酸序列在獨立擴增實驗中可以重復，因此代表所用的點形念珠藻ATCC 29133中的核苷酸序列。
因此，該pNP195克隆被用于克隆進表達載體pJO(如實施例5所述)。通過從pNP195分離809bp的SphI片段，并將其連入SphI切割的pJO載體來完成克隆。以正確方向含有點形念珠藻NP195酮酶的克隆被稱為pJONP195，其中所述酮酶的N-末端與rbcS轉運肽翻譯融合。
實施例9制備用于在食用番茄和萬壽菊中組成性表達點形念珠藻ATCC 29133來源的NP195酮酶的表達載體食用番茄和萬壽菊中點形念珠藻NP195酮酶的表達是在擬南芥來源的組成型啟動子FNR(鐵氧還蛋白NADPH氧化還原酶，數據庫條目AB011474，70127到69493位；WO 03/006660)的控制進行的。FNR基因起始于69492堿基對，并被命名為“鐵氧還蛋白-NADP+還原酶”。使用豌豆轉運肽rbcS(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)進行表達。
因此，將pFNR克隆(如實施例6所述)用于克隆進表達載體pJONP195(如實施例8所述)。
通過從pFNR分離644bp的Sma-HindIII片段，并將其連入Ecl136II-HindIII切割的pJONP195載體來完成克隆。含有FNR啟動子而非原始d35S啟動子并以正確方向含有NP195片段的克隆被稱為pJOFNR:NP195，所述NP195片段的N-末端與rbcS轉運肽融合。
使用二元載體pSUN3(WO 02/00900)制備用于農桿菌介導下向食用番茄轉化點形念珠藻NP195酮酶的表達盒。
為制備表達載體MSP109，將來自pJOFNR:NP195的1866bpEcoRI-XhoI片段與EcoRI-XhoI切割的pSUN3載體相連。表達載體MSP109含有FNR啟動子片段--FNR啟動子(635bp)、rbcS TPFRAGMENT片段--豌豆rbcS轉運肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--編碼點形念珠藻NP195酮酶、OCS終止子片段(192bp)--章魚堿合酶的多聚腺苷酸化信號。
使用二元載體pSUN5(WO 02/00900)制備用于通過農桿菌介導下向萬壽菊轉化含有點形念珠藻NP195酮酶的表達載體的表達盒。
為制備MSP110萬壽菊表達載體，將來自pJOFNR:NP195的1866bp的EcoRI-XhoI片段與EcoRI-XhoI切割的pSUN5載體相連。表達載體MSP110含有FNR啟動子片段--FNR啟動子(635bp)、rbcS TPFRAGMENT片段--豌豆rbcS轉運肽(194bp)、NP195KETO CDS片段(789bp)--編碼點形念珠藻NP195酮酶、OCS終止子片段(192bp)--章魚堿合酶的多聚腺苷酸化信號。
實施例10制備用于在食用番茄和萬壽菊中花特異性表達點形念珠藻ATCC29133來源的NP195酮酶的表達載體使用豌豆rbcS轉運肽(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)在食用番茄和萬壽菊中表達點形念珠藻NP195酮酶。該表達在碧冬茄來源的花特異性啟動子EPSPS(數據庫條目M37029；核苷酸區域7-1787；Benfey等(1990)Plant Cell 2849-856)的控制下進行。
因此，將pEPSPS克隆(如實施例7所述)用于克隆進表達載體pJONP195(如實施例8所述)。
通過從pEPSPS分離1763bp的SacI-HindIII片段，并將其連入SacI-HindIII切割的pJONP195載體來完成克隆。含有EPSPS啟動子而非原始d35S啟動子的克隆被稱為pJOESP:NP195。該表達盒以正確方向含有NP195片段，所述片段的N-末端與rbcS轉運肽融合。
使用二元載體pSUN3(WO 02/00900)制備用于通過農桿菌介導下向食用番茄轉化EPSPS控制的點形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶的表達載體。
為制備MSP111表達載體，將來自pJOESP:NP195的2988KB bp的SachI-XhoI片段與SacI-XhoI切割的pSUN3載體相連。表達載體MSP111含有EPSPS片段--EPSPS啟動子(1761bp)、rbcS TPFRAGMENT片段--豌豆rbcS轉運肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--編碼點形念珠藻NP195酮酶、OCS終止子片段(192bp)--章魚堿合酶的多聚腺苷酸化信號。
使用二元載體pSUN5(WO 02/00900)制備用于農桿菌介導下向萬壽菊轉化EPSPS控制的點形念珠藻NP195酮酶的表達載體。
為制備MSP112表達載體，將來自pJOESP:NP195的2988KBbp的SachI-XhoI片段與SacI-XhoI切割的pSUN5載體相連。表達載體MSP112含有EPSPS片段--EPSPS啟動子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS轉運肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--編碼點形念珠藻NP195酮酶、OCS終止子片段(192bp)--章魚堿合酶的多聚腺苷酸化信號。
實施例11制備用于花特異性過量表達食用番茄色素體特異的β-羥化酶的表達盒在矮牽牛的花特異性啟動子EPSPS(實施例7)的控制下，進行萬壽菊中食用番茄色素體特異的β-羥化酶的表達。使用蠶豆(Vicia faba)來源的LB3為終止子元件。通過分離RNA、反轉錄和PCR制備色素體特異的β-羥化酶的序列。
為了制備蠶豆LB3終止子序列，按照標準方法從蠶豆組織中分離基因組DNA，并利用引物PR206和PR207對其進行基因組PCR。在50μl反應混合物中進行PCR擴增該LB3DNA片段，所述混合物含有-1μl cDNA(如上述制備)-0.25mM dNTP-0.2μM PR206(SEQ ID NO116)-0.2μM PR207(SEQ ID NO117)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸餾水利用PR206和PR207進行PCR擴增得到含有LB終止子的0.3kb片段。將擴增子克隆到克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13測序確證了與序列SEQ ID NO118一致的序列。該克隆被命名為pTA-LB3，并因此用于克隆到載體pJIT117中(見下文)。
從番茄制備總RNA，以制備β-羥化酶序列。為此，將100mg冰凍粉碎的花轉移到反應試管中，并加入0.8ml Trizol緩沖液(Life Technologies)。用0.2ml氯仿抽提懸浮液。以12000g離心15分鐘后，將水相上清液取出并轉移到新反應試管中并用1體積乙醇抽提。用1體積異丙醇沉淀RNA，以75％乙醇洗滌之，并將沉淀溶于DEPC水(水與1/1000體積焦碳酸二乙酯在室溫下過夜孵育，然后高壓滅菌)中。通過光度法測定RNA濃度。為合成cDNA，將2.5μg總RNA在60℃變性10分鐘，冰上冷卻2分鐘并根據生產商詳細說明使用cDNA試劑盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)、利用反義特異引物(PR215 SEQ ID NO119)轉錄成cDNA。
隨后的PCR條件如下在50μl反應混合物中進行PCR擴增編碼β-羥化酶的VPR203-PR215DNA片段，所述混合物含有-1μl cDNA(如上述制備)-0.25mM dNTP-0.2μM VPR203(SEQ ID NO120)-0.2μM PR215(SEQ ID NO119)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸餾水利用VPR203和PR215進行PCR擴增得到編碼β-羥化酶的0.9kb片段。將擴增子克隆到克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13的測序確證了與序列SEQ ID NO121一致的序列。該克隆被命名為pTA-CrtR-b2，并因此用于克隆到載體pCSP02中(見下文)。
使用質粒MSP107(見實施例7)以及引物VPR001和VPR002，通過PCR擴增制備來自矮牽牛的EPSPS啟動子序列。在50μl反應混合物中進行PCR擴增該EPSPS DNA片段，所述混合物含有-1μl cDNA(如上述制備)-0.25mM dNTP-0.2μM VPR001(SEQ ID NO122)-0.2μM VPR002(SEQ ID NO123)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)
-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸餾水利用 VPR001和PR002進行PCR擴增得到編碼EPSPS啟動子的1.8kb片段。將擴增子克隆到克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13的測序確證了與序列SEQ ID NO124一致的序列。該克隆被命名為pTA-EPSPS，并因此用于克隆到載體pCSP03中(見下文)。
從衍生自克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-LB3中分離0.3kbPR206-PR207EcoRI-XhoI片段，并與EcoRI-XhoI切割的載體pJIT117連接，進行克隆第一步。該含有0.3kb終止子LB3的克隆被命名為pCSP02。
從衍生自克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-CrtR-b2分離0.9kb VPR003-PR215EcoRI-HindIII片段，并與EcoRI-HindIII切割的載體pCSP02連接進行克隆第二步。該含有0.9kbβ-羥化酶片段CrtR-b2的克隆被命名為pCSP03。通過連接，在終止子LB3和β-羥化酶片段CrtR-b2間形成了轉錄融合。
從衍生自克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-EPSPS上分離1.8kb VPR001-VPR002 NcoI-SacI片段，并與NcoI-SacI切割的載體pCSP03連接完成克隆第三步。該含有1.8kb EPSPS啟動子片段的克隆被命名為pCSP04。通過連接，在EPSPS啟動子和β-羥化酶片段CrtR-b2之間形成了轉錄融合。pCSP04含有片段EPSPS(1792bp)--EPSPS啟動子、片段crtRb2(929bp)--β-羥化酶CrtRb2、LB3片段(301bp)--LB3終止子。
為將該β-羥化酶過量表達盒克隆到用于農桿菌介導下轉化萬壽菊的表達載體中，以3103bp Ecl136II-XhoI片段分離β-羥化酶盒。通過標準方法(Klenow填補)補平3’末端(30℃，30分鐘)。
該表達載體被命名為pCSEbhyd。
實施例12制備用于在啟動子P76控制下花特異性表達食用番茄色素體特異的番茄紅素β環化酶以及在EPSPS啟動子控制下花特異性表達點形念珠藻ATCC 29133酮酶NP196的表達載體通過PCR，以擬南芥基因組DNA為模板分離啟動子P76(SEQ ID NO125)。
為此使用寡核苷酸引物P76for(SEQ ID NO126)和P76rev(SEQ IDNO127)。在合成過程中，提供具有5’-磷酸殘基的寡核苷酸。
P76for 5’-CCCGGGTGCCAAAGTAACTCTTTAT-3’P76rev 5’-GTCGACAGGTGCATGACCAAGTAAC-3’如已描述的(Galbiati M等，Funct.Integr.Genomics 2000，20125-34)從擬南芥分離基因組DNA。
如下進行PCR擴增80ng基因組DNA1x Expand Long Template PCR緩沖液2.5mM MgCl2dATP、dCTP、dGTP、dTTp各350μM300nM各引物2.5單位Expand Long Template聚合酶終體積為25μl使用下面的溫度程序94℃120秒1個循環94℃ 10秒，48℃ 30秒，68℃ 3分鐘35個循環68℃ 10分鐘1個循環。
通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，并通過凝膠洗脫分離1032bp片段。
用限制性內切酶EcoRV消化載體pSUN5，也同樣用瓊脂糖凝膠電泳純化和凝膠洗脫回收。
將純化的PCR產物克隆到如此處理的載體中。
將該構建體命名為p76。對代表擬南芥啟動子P76的長為1032bp的片斷(SEQ ID NO131)進行測序。
使用限制性內切酶Kpn1和SmaI消化，從pJIT117得到35ST終止子。用瓊脂糖凝膠電泳純化該法所得的969bp片段，并以凝膠洗脫分離。
同樣用限制性內切酶Kpn1和SmaI消化載體p76。用瓊脂糖凝膠電泳純化所得的7276bp片段，并以凝膠洗脫分離。
將所得35ST片段克隆到如此處理的p76中。
所得載體被命名為p7635ST。
以食用番茄的基因組DNA為模板，通過PCR方法分離Bgene(SEQ IDNO128)。
為此使用寡核苷酸引物BgeneFor(SEQ ID NO129)和BgeneRev(SEQ ID NO130)。在合成過程中，提供了具有5’-磷酸殘基的寡核苷酸。
SEQ ID NO 129Bgenefor5’-CTATTGCTAGATTGCCAATCAG-3’SEQ ID NO 130Bgeneves5’-ATGGAAGCTCTTCTCAAG-3’如已描述的(Galbiati M等，Funct.Integr.Genomics 2000，20125-34)從食用番茄分離基因組DNA。
如下進行PCR擴增80ng基因組DNA1x Expand Long Template PCR緩沖液2.5mM MgCl2dATP、dCTP、dGTP、dTTp各350μM300nM各引物2.5單位Expand Long Template聚合酶終體積為25μl使用下面的溫度程序94℃120秒1個循環94℃ 10秒，48℃ 30秒，68℃ 3分鐘35個循環68℃ 10分鐘1個循環。
利用瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產物，并通過凝膠洗脫分離1665bp片段。
用限制性內切酶SmaI消化載體p7635ST，并同樣通過瓊脂糖凝膠電泳純化和凝膠洗脫回收。
將純化的PCR產物克隆到如此處理的載體中。
該構建體被命名為pB。對代表番茄Bgene的長為1486bp的片斷進行測序，其核苷酸序列與數據庫條目AF254793(SEQ ID NO1)一致。
使用限制性內切酶PmeI和SspI消化pB，并通過瓊脂糖凝膠電泳純化和凝膠洗脫回收含有啟動子P76、Bgene和35ST的3906bp片段。
用限制性內切酶Ecl126II消化MSP108(實施例7)，通過瓊脂糖凝膠電泳純化和凝膠洗脫回收。
將純化的來自pB的含有啟動子P76、Bgene和35ST的3906bp片段克隆到如此處理的載體MSP108中。
該構建體被命名為pMKP1。
實施例13轉基因食用番茄植物的制備和分析根據Ling等發表的方法(Plant Cell Reports(1998)，17843-847)轉化并再生番茄植物。對于品種Microtom，使用更高濃度的卡那霉素(100mg/l)進行選擇。
使用Microtom系的7到10天齡幼苗的子葉和下胚軸作為轉化用的起始外植體。萌發使用Murashige和Skoog所述含2％蔗糖、pH 6.1的培養基(1962Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant 15,473-)。在21℃、低光照(20-100μE)的條件下進行萌發。7到10天后，橫向分割子葉并將下胚軸切成約5-10mm長的節段，并置于一天前預先涂布懸浮培養番茄細胞的MSBN培養基(MS，pH 6.1，3％蔗糖+1mg/1BAP、0.1mg/l NAA)上。所述番茄細胞用無菌濾紙無氣泡覆蓋。在上述培養基上將外植體預培養3到5天。分別用質粒獨立轉化根癌農桿菌LBA4404株細胞。每一次，將用二元載體轉化的各農桿菌菌株在28℃含卡那霉素(20mg/l)的YEB培養基中過夜培養，并離心細胞。將細菌沉淀重懸浮于液體MS培養基(3％蔗糖、pH 6.1)，并調節到光密度為0.3(600nm處)。將預培養的外植體轉移到懸浮液中，并在室溫溫和振蕩的條件下孵育30分鐘。隨后，用無菌濾紙干燥外植體，并重置于其預培養基進行3天共培養(21℃)。
共培養后，將外植體轉移到MSZ2培養基(MS pH 6.1+3％蔗糖、2mg/l玉米素、100mg/l卡那霉素、160mg/l替曼汀(timentin))并儲存，以在21℃、弱光條件(20-100μE、光節律16h/8h)下選擇性再生。在芽形成以前每兩到3周轉移一次外植體。可以從外植體上分離小芽，并使其在MS(pH 6.1+3％蔗糖)、160mg/l替曼汀、30mg/l卡那霉素、0.1mg/l IAA上生根。將生根的植物轉移到溫室。
根據上述轉化方法，用以下表達構建體獲得了如下株系用MSP105獲得MSP105-1、MSP105-2、MSP105-3用MSP107獲得MSP107-1、MSP107-2、MSP107-3用MSP109獲得MSP109-1、MSP109-2、MSP109-3用MSP111獲得MSP111-1、MSP111-2、MSP111-3實施例14轉基因萬壽菊植物的制備將萬壽菊種子滅菌并置于萌發培養基(MS培養基；Murashige和Skoog，Physio.Plant.15(1962)，473-497)pH 5.8，2％蔗糖)上。萌發的溫度/光照/時間間隔為18-28℃/20-200μE/3-16周，但是優選在21℃、20-70μE、持續4-8周。
到時收獲體外發育的植物的所有葉子，并從中部橫切。制備過程中將由此得到的10-60mm2大小的葉外植體儲存于室溫下的液體MS培養基中最多兩小時。
過夜培養任何一種所需的根癌農桿菌菌株，并用于與葉子材料共培養，其中優選超毒力菌株，如具有適當二元質粒的EHA 105，所述二元質粒可以攜帶選擇性標記基因(優選bar或pat)和一種或多種性狀或報告基因。可以如下培養細菌菌株將適當菌株的單菌落接種于具有25mg/l卡那霉素的YEB(0.1％酵母提取物、0.5％牛肉膏、0.5％蛋白胨、0.5％蔗糖、0.5％硫酸鎂x7H2O)，并在28℃培養16到20小時。然后以6000g離心10分鐘收獲細菌懸浮液，并以產生約0.1到0.8的OD600的方式重懸浮于液體MS培養基。這一懸浮液用于與葉子材料共培養。
緊鄰共培養之前，用細菌懸浮液替換儲存葉子的MS培養基。室溫及溫和振蕩下在農桿菌懸浮液中孵育葉子30分鐘。然后將感染的外植體置于用瓊脂(如0.8％的植物瓊脂(Duchefa，NL))固化的具有生長調節劑(如3mg/l的芐氨基嘌呤(BAP)和1mg/l吲哚乙酸(IAA))的MS培養基上。葉子在培養基上的方向并不重要。外植體的培養進行1到8天，但優選6天，此過程中可使用以下條件光強度30-80μmol/m2x秒，溫度22-24℃，16/8小時明/暗交替。然后，將共培養的外植體轉移到新鮮MS培養基，優選具有相同生長調節劑，此第二培養基額外含有抑制細菌生長的抗生素。濃度為200到500mg/l的替曼汀特別適合這一目的。使用可用于選擇成功轉化的第二選擇性組分。1到5mg/l濃度的膦絲菌素選擇特別有效，但是也可以根據所用方法考慮其它選擇性組分。
每次在1到3周后，將外植體轉移到新鮮培養基直至形成胚芽和小芽，此后將其轉移以植根于相同基礎培養基，所述培養基含有替曼汀和PPT或替代組分，以及生長調節劑(即如0.5mg/l的吲哚丁酸(IBA)和0.5mg/l的赤霉酸GA3)。已生根的芽可以被轉移到溫室。
除所述方法外，可以進行以下有利的修改●在用細菌感染外植體以前，可以將其于上述共培養用的培養基上預孵育1到12天(優選3-4天)。然后如上述進行感染、共培養和選擇性再生。
●再生的pH值(通常為5.8)可降為5.2。這樣能改善對農桿菌生長的控制。
●向再生培養基加入AgNO3(3-10mg/l)能改善包括再生自身在內的培養條件。
●技術人員所知的減少苯酚形成的組分(如檸檬酸、抗壞血酸、PVP和許多其它組分)對于培養有利。
●整個過程可以使用液體培養基。也可以將培養物孵育在置于液體培養基上的可購支持物上。
根據上述轉化方法，用以下表達構建體獲得了下述株系用MSP106獲得MSP106-1、MSP106-2、MSP106-3用MSP108獲得MSP108-1、MSP108-2、MSP108-3用MSP110獲得MSP110-1、MSP110-2、MSP110-3用MSP112獲得MSP112-1、MSP112-2、MSP112-3用pCSEbhyd獲得csebhyd-1、csebhyd1-2、csebhyd1-3用pMKP1獲得mkp-1、mkp1-2、mkp1-3實施例15植物材料來源的類胡蘿卜素酯的脂酶催化水解以及類胡蘿卜素的鑒定一般方法a)用100％的丙酮抽提(3次500μl；每次振蕩約15分鐘)在研缽中碾磨的植物材料(濕重30-100mg)。將溶劑蒸發。然后將類胡蘿卜素溶解于495μl丙酮，加入4.95ml磷酸鉀緩沖液(100mM，pH 7.4)后充分混合溶液。然后加入約17mg膽汁鹽(Sigma)以及149μl NaCl/CaCl2溶液(3MNaCl和75mM CaCl2)。將懸浮液在37℃孵育30分鐘。為了酶促水解類胡蘿卜素酯，加入595μl脂酶溶液(50mg/ml皺褶假絲酵母(Candidarugosa)來源的7型脂酶(Sigma))并在37℃振蕩下孵育。約21小時后，再次加入595μl脂酶在37℃再孵育至少5小時。然后在溶液中溶解約700mgNa2SO4。加入1800μl石油醚后，通過劇烈振蕩將類胡蘿卜素抽提至有機相。重復這一振蕩抽提直至有機相變為無色。合并石油醚級分并蒸發掉石油醚。用100-120μl丙酮吸收游離的類胡蘿卜素。通過HPLC和C30反相柱方法，根據滯留時間和UV-VIS光譜鑒定游離的類胡蘿卜素。
所用的膽汁鹽或膽酸鹽為膽酸鹽與脫氧膽酸鹽1∶1的混合物。
b)當植物材料中僅存在少量類胡蘿卜素酯時采用的方法另外，也可以利用薄層層析法分離的皺褶假絲酵母來源的脂酶水解類胡蘿卜素酯。為此，用約750μl丙酮抽提50-100mg植物材料3次。將溶劑抽提物在旋轉蒸發器的真空中濃縮(可耐受升高溫度至40-50℃)。隨后加入300ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)并充分混合。然后將懸浮物離心(1-2分鐘)沉淀。將上層相轉移到新的反應試管中。殘留物再次用200ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)抽提并離心去除懸浮物。將兩次抽提物混合(體積500ul)并蒸發掉溶劑。殘余物在30ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)中重懸浮并鋪在薄層板上(silica gel 60，Merck)。如果為制備/分析目的需要使用一次以上，每次應當按照薄層層析法分離所述的方法準備濕重為50-100mg的若干等分試樣。
薄層板在石油醚∶丙酮(比例5∶1)中展開。可根據其顏色肉眼鑒別類胡蘿卜素條帶。刮下單個類胡蘿卜素條帶，并可為制備/分析目的而富集。用丙酮將類胡蘿卜素從硅材料上洗脫；將溶劑在真空中蒸發。為水解類胡蘿卜素酯，將殘留物溶解于495μl丙酮中，并加入17mg膽汁鹽(Sigma)、4.95ml 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)以及149μl 3M NaCl+75mM CaCl2。充分混合后，將溶液在37℃平衡30分鐘。隨后加入595μl皺褶假絲酵母脂酶(Sigma，5mM CaCl2貯藏液中50mg/ml)，并在37℃時振蕩孵育過夜。約21小時后，再次加入等量的脂酶；將此混合物在37℃時再次振蕩孵育至少5小時。然后加入約700mg Na2SO4(無水)，加入1800μl石油醚振蕩抽提該混合物約1分鐘并在3500轉/分鐘下離心5分鐘。將上層相轉移到新的反應試管中，重復振蕩抽提直至上層相變為無色。合并石油醚相在真空中濃縮(溫度可以為40-50℃)。殘余物溶解于120μl丙酮中，如需要可使用超聲。利用C30柱通過HPLC方法分離溶解的類胡蘿卜素，并借助參照物質定量。
實施例16游離類胡蘿卜素的HPLC分析在以下條件下分析根據實施例15的工作步驟獲取的樣品設定了以下HPLC條件。
分離柱Prontosil C30柱，250×4.6mm，(Bischoff，Leonberg，Germany)流速1.0ml/min洗脫液洗脫液A-100％甲醇洗脫液B-80％甲醇、0.2％乙酸銨洗脫液C-100％叔丁基甲基醚檢測300-530nm梯度曲線

某些根據本發明形成的類胡蘿卜素特征性的遲滯時間為，例如，紫黃質11.7分鐘，蝦青素17.7分鐘，金盞花黃質19分鐘，金盞花玉紅質19.9分鐘，玉米黃質21分鐘。
序列表序列表&lt;110&gt;太陽基因有限公司&lt;120&gt;在遺傳修飾的非人類生物中制備酮式類胡蘿卜素的方法&lt;130&gt;PF 55340&lt;160&gt;131&lt;170&gt;PatentIn版本3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;1666&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;食用番茄&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(1)..(1494)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;1atg gaa gct ctt ctc aag cct ttt cca tct ctt tta ctt tcc tct cct 48Met Glu Ala Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ser Pro1 5 10 15
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1 5 10 15Thr Pro His Arg Ser Ile Phe Gln Gln Asn Pro Ser Phe Leu Ser Pro20 25 30Thr Thr Lys Lys Lys Ser Arg Lys Cys Leu Leu Arg Asn Lys Ser Ser35 40 45Lys Leu Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Thr Ser Lys Pro Glu50 55 60Ser Leu Asp Val Asn Ile Ser Trp Val Asp Pro Asn Ser Asn Arg Ala65 70 75 80Gln Phe Asp Val Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Arg Leu85 90 95Ala Glu Gln Val Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Val Cys Cys Val Asp Pro100 105 110Ser Pro Leu Ser Met Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu115 120 125Phe Glu Asn Leu Gly Leu Glu Asn Cys Leu Asp His Lys Trp Pro Met130 135 140Thr Cys Val His Ile Asn Asp Asn Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Arg Pro145 150 155 160Tyr Gly Arg Val Ser Arg Lys Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ser165 170 175Cys Val Glu Asn Arg Val Lys Phe Tyr Lys Ala Lys Val Trp Lys Val180 185 190Glu His Glu Glu Phe Glu Ser Ser Ile Val Cys Asp Asp Gly Lys Lys195 200 205
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405 410 415Ser Phe Gly Met Glu Thr Leu Leu Lys Leu Asp Leu Lys Gly Thr Arg420 425 430Arg Leu Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Gly435 440 445Phe Leu Ser Ser Arg Leu Ser Val Lys Glu Leu Gly Leu Leu Ser Leu450 455 460Cys Leu Phe Gly His Gly Ser Asn Met Thr Arg Leu Asp Ile Val Thr465 470 475 480Lys Cys Pro Leu Pro Leu Val Arg Leu Ile Gly Asn Leu Ala Ile Glu485 490 495Ser Leu&lt;210&gt;3&lt;211&gt;1771&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;雨生紅球藻&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(166)..(1155)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;3ggcacgagct tgcacgcaag tcagcgcgcg caagtcaaca cctgccggtc cacagcctca 60
aataataaag agctcaagcg tttgtgcgcc tcgacgtggc cagtctgcac tgccttgaac 120ccgcgagtct cccgccgcac tgactgccat agcacagcta gacga atg cag cta gca 177Met Gln Leu Ala1gcg aca gta atg ttg gag cag ctt acc gga agc gct gag gca ctc aag 225Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys5 10 15 20gag aag gag aag gag gtt gca ggc agc tct gac gtg ttg cgt aca tgg 273Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp25 30 35gcg acc cag tac tcg ctt ccg tca gaa gag tca gac gcg gcc cgc ccg 321Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro40 45 50gga ctg aag aat gcc tac aag cca cca cct tcc gac aca aag ggc atc 369Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly Ile55 60 65aca atg gcg cta cgt gtc atc ggc tcc tgg gcc gca gtg ttc ctc cac 417Thr Met Ala Leu Arg Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His70 75 80gcc att ttt caa atc aag ctt ccg acc tcc ttg gac cag ctg cac tgg 465Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp85 90 95 100ctg ccc gtg tca gat gcc aca gct cag ctg gtt agc ggc acg agc agc 513Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Thr Ser Ser105 110 115ctg ctc gac atc gtc gta gta ttc ttt gtc ctg gag ttc ctg tac aca 561Leu Leu Asp Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr120 125 130ggc ctt ttt atc acc acg cat gat gct atg cat ggc acc atc gcc atg 609Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Met135 140 145aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga gta tgc atc tcc ttg 657Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys Ile Ser Leu150 155 160tac gcc tgg ttt gat tac aac atg ctg cac cgc aag cat tgg gag cac 705Tyr Ala Trp phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His165 170 175 180
cac aac cac act ggc gag gtg ggc aag gac cct gac ttc cac agg gga753His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly185 190 195aac cct ggc att gtg ccc tgg ttt gcc agc ttc atg tcc agc tac atg801Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met200 205 210tcg atg tgg cag ttt gcg cgc ctc gca tgg tgg acg gtg gtc atg cag849Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln215 220 225ctg ctg ggt gcg cca atg gcg aac ctg ctg gtg ttc atg gcg gcc gcg897Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala230 235 240ccc atc ctg tcc gcc ttc cgc ttg ttc tac ttt ggc acg tac atg ccc945pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro245 250 255 260cac aag cct gag cct ggc gcc gcg tca ggc tct tca cca gcc gtc atg993His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met265 270 275aac tgg tgg aag tcg cgc act agc cag gcg tcc gac ctg gtc agc ttt1041Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe280 285 290ctg acc tgc tac cac ttc gac ctg cac tgg gag cac cac cgc tgg ccc1089Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro295 300 305ttc gcc ccc tgg tgg gag ctg ccc aac tgc cgc cgc ctg tct ggc cga1137Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg310 315 320ggt ctg gtt cct gcc tag ctggacacac tgcagtgggc cctgctgcca 1185Gly Leu Val Pro Ala325gctgggcatg caggttgtgg caggactggg tgaggtgaaa agctgcaggc gctgctgccg 1245gacacgctgc atgggctacc ctgtgtagct gccgccacta ggggaggggg tttgtagctg 1305tcgagcttgc cccatggatg aagctgtgta gtggtgcagg gagtacaccc acaggccaac 1365acccttgcag gagatgtctt gcgtcgggag gagtgttggg cagtgtagat gctatgattg 1425tatcttaatg ctgaagcctt taggggagcg acacttagtg ctgggcaggc aacgccctgc 1485
aaggtgcagg cacaagctag gctggacgag gactcggtgg caggcaggtg aagaggtgcg 1545ggagggtggt gccacaccca ctgggcaaga ccatgctgca atgctggcgg tgtggcagtg 1605agagctgcgt gattaactgg gctatggatt gtttgagcag tctcacttat tctttgatat 1665agatactggt caggcaggtc aggagagtga gtatgaacaa gttgagaggt ggtgcgctgc 1725ccctgcgctt atgaagctgt aacaataaag tggttcaaaa aaaaaa 1771&lt;210&gt;4&lt;211&gt;329&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;雨生紅球藻&lt;400&gt;4Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala1 5 10 15Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val20 25 30Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp35 40 45Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp50 55 60Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Arg Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala65 70 75 80Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp85 90 95Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser
100 105 110Gly Thr Ser Ser Leu Leu Asp Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu115 120 125Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly130 135 140Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val145 150 155 160Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys165 170 175His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp180 185 190Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met195 200 205Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr210 215 220Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe225 230 235 240Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly245 250 255Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser260 265 270Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp275 280 285Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His290 295 300
His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg305 310 315 320Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala325&lt;210&gt;5&lt;211&gt;1163&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;食用番茄&lt;220&gt;
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&lt;400&gt;5att cgg cac gag att tca gcc tcc gct agt tcc cga acc att cgc ctc 48Ile Arg His Glu Ile Ser Ala Ser Ala Ser Ser Arg Thr Ile Arg Leu1 5 10 15cgt cat aac ccg ttt ctc agt cca aaa tcc gcc tca acc gcc ccg ccg 96Arg His Asn Pro Phe Leu Ser Pro Lys Ser Ala Ser Thr Ala Pro Pro20 25 30gtt ctg ttc ttc tct ccg tta act cgc aat ttt ggc gca att ttg ctg 144Val Leu Phe Phe Ser pro Leu Thr Arg Asn Phe Gly Ala Ile Leu Leu35 40 45tct aga aga aag ccg aga ttg gcg gtt tgt ttt gtg ctg gag aat gag 192Ser Arg Arg Lys Pro Arg Leu Ala Val Cys Phe Val Leu Glu Asn Glu50 55 60aaa ttg aat agt act atc gaa agt gag agt gaa gta ata gag gat cgg 240Lys Leu Asn Ser Thr Ile Glu Ser Glu Ser Glu Val Ile Glu Asp Arg65 70 75 80
ata caa gta gag att aat gag gag aag agt tta gct gcc agt tgg ctg288Ile Gln Val Glu Ile Asn Glu Glu Lys Ser Leu Ala Ala Ser Trp Leu85 90 95gcg gag aaa ttg gcg agg aag aaa tcg gag agg ttt act tat ctt gtg336Ala Glu Lys Leu Ala Arg Lys Lys Ser Glu Arg Phe Thr Tyr Leu Val100 105 110gca gct gtg atg tct agt ttg ggg att act tct atg gcg att ttg gcg384Ala Ala Val Met Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ser Met Ala Ile Leu Ala115 120 125gtt tat tac aga ttt tca tgg caa atg gag ggt gga gaa gtg cct ttt432Val Tyr Tyr Arg Phe Ser Trp Gln Met Glu Gly Gly Glu Val Pro Phe130 135 140tct gaa atg tta gct aca ttc act ctc tcg ttt ggc gct gcc gta gga480Ser Glu Met Leu Ala Thr Phe Thr Leu Ser Phe Gly Ala Ala Val Gly145 150 155 160atg gag tac tgg gcg aga tgg gct cat aga gca cta tgg cat gct tct528Met Glu Tyr Trp Ala Arg Trp Ala His Arg Ala Leu Trp His Ala Ser165 170 175tta tgg cac atg cac gag tcg cac cat aga cca aga gaa gga cct ttt576Leu Trp His Met His Glu Ser His His Arg Pro Arg Glu Gly Pro Phe180 185 190gag atg aac gac gtt ttc gcc ata aca aat gct gtt cca gct ata ggt624Glu Met Asn Asp Val Phe Ala Ile Thr Asn Ala Val Pro Ala Ile Gly195 200 205ctt ctt tcc tac ggt ttc ttc cat aaa ggg atc gtc cct ggc ctc tgt672Leu Leu Ser Tyr Gly Phe Phe His Lys Gly Ile Val Pro Gly Leu Cys210 215 220ttc ggc gct gga ttg ggg atc aca gta ttt ggg atg gct tac atg ttc720Phe Gly Ala Gly Leu Gly Ile Thr Val Phe Gly Met Ala Tyr Met Phe225 230 235 240gtt cac gat gga ctg gtt cat aag aga ttt ccc gta ggg cct att gcc768Val His Asp Gly Leu Val His Lys Arg Phe pro Val Gly Pro Ile Ala245 250 255aac gtg cct tac ttt cgg agg gta gct gca gca cat cag ctt cat cac816Asn Val Pro Tyr Phe Arg Arg Val Ala Ala Ala His Gln Leu His His260 265 270
tcg gac aaa ttt gat ggt gtc cca tat ggc ttg ttt cta gga cct aag864Ser Asp Lys Phe Asp Gly Val Pro Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Pro Lys275 280 285gaa ttg gaa gaa gta gga gga ctt gaa gag tta gaa aag gaa gtc aac912Glu Leu Glu Glu Val Gly Gly Leu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Val Asn290 295 300cga agg att aaa att tct aag gga tta tta tgatcaaaag atacgtctga 962Arg Arg Ile Lys Ile Ser Lys Gly Leu Leu305 310taataataaa atgcgattgt atttaggctg tagattatta ttgggaaaaa gatagaaaga 1022tatatatatg aatataatat aaaatgcaac aagctttcta tggagaagac cttttctttt 1082ttggtacctg tacgtaaaag gtgaacaatt tgatgtccta gtacttgttg acaaaccaga 1142agaacgataa ttcaaaacaa a 1163&lt;210&gt;6&lt;211&gt;314&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;食用番茄&lt;400&gt;6Ile Arg His Glu Ile Ser Ala Ser Ala Ser Ser Arg Thr Ile Arg Leu1 5 10 15Arg His Asn pro Phe Leu Ser Pro Lys Ser Ala Ser Thr Ala Pro Pro20 25 30Val Leu phe phe Ser Pro Leu Thr Arg Asn Phe Gly Ala Ile Leu Leu35 40 45Ser Arg Arg Lys Pro Arg Leu Ala Val Cys Phe Val Leu Glu Asn Glu50 55 60
Lys Leu Asn Ser Thr Ile Glu Ser Glu Ser Glu Val Ile Glu Asp Arg65 70 75 80Ile Gln Val Glu Ile Asn Glu Glu Lys Ser Leu Ala Ala Ser Trp Leu85 90 95Ala Glu Lys Leu Ala Arg Lys Lys Ser Glu Arg Phe Thr Tyr Leu Val100 105 110Ala Ala Val Met Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ser Met Ala Ile Leu Ala115 120 125Val Tyr Tyr Arg Phe Ser Trp Gln Met Glu Gly Gly Glu Val Pro Phe130 135 140Ser Glu Met Leu Ala Thr Phe Thr Leu Ser Phe Gly Ala Ala Val Gly145 150 155 160Met Glu Tyr Trp Ala Arg Trp Ala His Arg Ala Leu Trp His Ala Ser165 170 175Leu Trp His Met His Glu Ser His His Arg Pro Arg Glu Gly Pro Phe180 185 190Glu Met Asn Asp Val Phe Ala Ile Thr Asn Ala Val Pro Ala Ile Gly195 200 205Leu Leu Ser Tyr Gly Phe Phe His Lys Gly Ile Val pro Gly Leu Cys210 215 220Phe Gly Ala Gly Leu Gly Ile Thr Val Phe Gly Met Ala Tyr Met phe225 230 235 240Val His Asp Gly Leu Val His Lys Arg Phe Pro Val Gly Pro Ile Ala245 250 255Asn Val Pro Tyr Phe Arg Arg Val Ala Ala Ala His Gln Leu His His
260 265 270Ser Asp Lys Phe Asp Gly Val Pro Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Pro Lys275 280 285Glu Leu Glu Glu Val Gly Gly Leu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Val Asn290 295 300Arg Arg Ile Lys Ile Ser Lys Gly Leu Leu305 310&lt;210&gt;7&lt;211&gt;1779&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;擬南芥&lt;220&gt;
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&lt;400&gt;7atg gat ctc cgt cgg agg cct cct aaa cca ccg gtt acc aac aac aac48Met Asp Leu Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Pro Val Thr Asn Asn Asn1 5 10 15aac tcc aac gga tct ttc cgt tct tat cag cct cgc act tcc gat gac96Asn Ser Asn Gly Ser Phe Arg Ser Tyr Gln Pro Arg Thr Ser Asp Asp20 25 30gat cat cgt cgc cgg gct aca aca att gct cct cca ccg aaa gca tcc144Asp His Arg Arg Arg Ala Thr Thr Ile Ala Pro Pro Pro Lys Ala Ser35 40 45gac gcg ctt cct ctt ccg tta tat ctc aca aac gcc gtt ttc ttc acg192Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr
50 55 60ctc ttc ttc tcc gtc gcg tat tac ctc ctc cac cgg tgg cgt gac aag240Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys65 70 75 80atc cgt tac aat acg cct ctt cac gtc gtc act atc aca gaa ctc ggc288Ile Arg Tyr Asn Thr Pro Leu His Val Val Thr Ile Thr Glu Leu Gly85 90 95gcc att att gct ctc atc gct tcg ttt atc tat ctc cta ggg ttt ttt336Ala Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe100 105 110ggt att gac ttt gtt cag tca ttt atc tca cgt gcc tct ggt gat gct384Gly Ile Asp Phe Val Gln Ser Phe Ile Ser Arg Ala Ser Gly Asp Ala115 120 125tgg gat ctc gcc gat acg atc gat gat gat gac cac cgc ctt gtc acg432Trp Asp Leu Ala Asp Thr Ile Asp Asp Asp Asp His Arg Leu Val Thr130 135 140tgc tct cca ccg act ccg atc gtt tcc gtt gct aaa tta cct aat ccg480Cys Ser Pro Pro Thr Pro Ile Val Ser Val Ala Lys Leu Pro Asn Pro145 150 155 160gaa cct att gtt acc gaa tcg ctt cct gag gaa gac gag gag att gtg528Glu Pro Ile Val Thr Glu Ser Leu Pro Glu Glu Asp Glu Glu Ile Val165 170 175aaa tcg gtt atc gac gga gtt att cca tcg tac tcg ctt gaa tct cgt576Lys Ser Val Ile Asp Gly Val Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg180 185 190ctc ggt gat tgc aaa aga gcg gcg tcg att cgt cgt gag gcg ttg cag624Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Arg Glu Ala Leu Gln195 200 205aga gtc acc ggg aga tcg att gaa ggg tta ccg ttg gat gga ttt gat672Arg Val Thr Gly Arg Ser Ile Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp210 215 220tat gaa tcg att ttg ggg caa tgc tgt gag atg cct gtt gga tac att720Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Ile225 230235240cag att cct gtt ggg act gct ggt cca ttg ttg ctt gat ggt tat gag768Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Tyr Glu245 250 255
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Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser450 455 460gct gta ttc ata gct act ggc caa gat cca gct caa aac gtg gag agt1440Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser465 470 475 480tct caa tgc atc acc atg atg gaa gct att aat gac ggc aaa gat atc1488Ser Gln Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Ile Asn Asp Gly Lys Asp Ile485 490 495cat atc tca gtc act atg cca tct atc gag gtg ggg aca gtg gga gga1536His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly500 505 510gga aca cag ctt gca tct caa tca gcg tgt tta aac ctg ctc gga gtt1584Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val515 520 525aaa gga gca agc aca gag tcg ccg gga atg aac gca agg agg cta gcg1632Lys Gly Ala Ser Thr Glu Ser Pro Gly Met Asn Ala Arg Arg Leu Ala530 535 540
acg atc gta gcc gga gca gtt tta gct gga gag tta tct tta atg tca1680Thr Ile Val Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser545 550 555 560gca att gca gct gga cag ctt gtg aga agt cac atg aaa tac aat aga1728Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Arg Ser His Met Lys Tyr Asn Arg565 570 575tcc agc cga gac atc tct gga gca acg aca acg aca aca aca aca aca1776Ser Ser Arg Asp Ile Ser Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr580 585 590tga1779&lt;210&gt;8&lt;211&gt;592&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;擬南芥&lt;400&gt;8
Met Asp Leu Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Pro Val Thr Asn Asn Asn1 5 10 15Asn Ser Asn Gly Ser Phe Arg Ser Tyr Gln Pro Arg Thr Ser Asp Asp20 25 30Asp His Arg Arg Arg Ala Thr Thr Ile Ala Pro Pro Pro Lys Ala Ser35 40 45Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr50 55 60Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys65 70 75 80Ile Arg Tyr Asn Thr Pro Leu His Val Val Thr Ile Thr Glu Leu Gly85 90 95Ala Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe100 105 110Gly Ile Asp Phe Val Gln Ser Phe Ile Ser Arg Ala Ser Gly Asp Ala115 120 125Trp Asp Leu Ala Asp Thr Ile Asp Asp Asp Asp His Arg Leu Val Thr130 135 140Cys Ser Pro Pro Thr Pro Ile Val Ser Val Ala Lys Leu Pro Asn Prol45 1S0 155 160Glu Pro Ile Val Thr Glu Ser Leu Pro Glu Glu Asp Glu Glu Ile Val165 170 175Lys Ser Val Ile Asp Gly Val Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg180 185 190Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Arg Glu Ala Leu Gln
195 200 205Arg Val Thr Gly Arg Ser Ile Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp210 215 220Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Ile225 230 235 240Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Tyr Glu245 250 255Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr260 265 270Asn Arg Gly Cys Lys Ala Met Phe Ile Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr275 280 285Val Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ala Ser290 295 300Ala Arg Arg Ala Ser Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asn Pro Glu Asn305 310 315 320Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg325 330 335Leu Gln Ser Val Lys Cys Thr Ile Ala Gly Lys Asn Ala Tyr Val Arg340 345 350Phe Cys Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys355 360 365Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Tyr Leu Thr Asp Asp Phe Pro Asp Met370 375 380Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala385 390 395 400
Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala405 410 415Val Ile Arg Gly Glu Ile Val Asn Lys Val Leu Lys Thr Ser Val Ala420 425 430Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Val435 440 445Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser450 455 460Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser465 470 475 480Ser Gln Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Ile Asn Asp Gly Lys Asp Ile485 490 495His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly500 505 510Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val515 520 525Lys Gly Ala Ser Thr Glu Ser Pro Gly Met Asn Ala Arg Arg Leu Ala530 535 540Thr Ile Val Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser545 550 555 560Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Arg Ser His Met Lys Tyr Asn Arg565 570 575Ser Ser Arg Asp Ile Ser Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr580 585 590
&lt;210&gt;9&lt;21l&gt;1401&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;擬南芥ISPH&lt;220&gt;
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Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala450 455 460Asn Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala465 470 475&lt;210&gt;15&lt;211&gt;884&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;巴勒斯提納側金盞花克隆ApIPI28&lt;220&gt;
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&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(99)..(827)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;39ctgcaggccg ggcccggtgg ccaatggtcg caaccggcag gactggaaca ggacggcggg 60ccggtctagg ctgtcgccct acgcagcagg agtttcgg atg tcc gga cgg aag cct 116Met Ser Gly Arg Lys Pro1 5ggc aca act ggc gac acg atc gtc aat ctc ggt ctg acc gcc gcg atc164Gly Thr Thr Gly Asp Thr Ile Val Asn Leu Gly Leu Thr Ala Ala Ile10 15 20ctg ctg tgc tgg ctg gtc ctg cac gcc ttt acg cta tgg ttg cta gat212Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe Thr Leu Trp Leu Leu Asp25 30 35gcg gcc gcg cat ccg ctg ctt gcc gtg ctg tgc ctg gct ggg ctg acc260Ala Ala Ala His Pro Leu Leu Ala Val Leu Cys Leu Ala Gly Leu Thr40 45 50tgg ctg tcg gtc ggg ctg ttc atc atc gcg cat gac gca atg cac ggg308Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala His Asp Ala Met His Gly55 60 65 70tcc gtg gtg ccg ggg cgg ccg cgc gcc aat gcg gcg atc ggg caa ctg356Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn Ala Ala Ile Gly Gln Leu75 80 85gcg ctg tgg ctc tat gcg ggg ttc tcg tgg ccc aag ctg atc gcc aag404Ala Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp Pro Lys Leu Ile Ala Lys90 95 100cac atg acg cat cac cgg cac gcc ggc acc gac aac gat ccc gat ttc452His Met Thr His His Arg His Ala Gly Thr Asp Asn Asp Pro Asp Phe105 110 115ggt cac gga ggg ccc gtg cgc tgg tac ggc agc ttc gtc tcc acc tat500Gly His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Gly Ser Phe Val Ser Thr Tyr120 125 130
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actggctgga ccgcctgaag ccgatcaggc gtggcgactg gcccgatcag gaggtgcggt 1557tcccagacca ttcgcgaagg ctccgggccg gatatggctc gatcgacggg cgggggctga 1617tgcgtgcggt gacc1631&lt;210&gt;40&lt;211&gt;242&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;產堿菌屬&lt;400&gt;40Met Ser Gly Arg Lys Pro Gly Thr Thr Gly Asp Thr Ile Val Asn Leu1 5 10 15Gly Leu Thr Ala Ala Ile Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe20 25 30Thr Leu Trp Leu Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Leu Leu Ala Val Leu35 40 45Cys Leu Ala Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala50 55 60His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn65 70 75 80Ala Ala Ile Gly Gln Leu Ala Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Set Trp85 90 95Pro Lys Leu Ile Ala Lys His Met Thr His His Arg His Ala Gly Thr100 105 110Asp Asn Asp Pro Asp Phe Gly His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Gly115 120 125
Ser Phe Val Ser Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro130 135 140Val Ile Val Thr Thr Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr145 150 155 160Val Ile Phe Trp Pro Val Pro Ala Val Leu Ala Ser Ile Gln Ile Phe165 170 175Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Asp Phe Pro180 185 190Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Thr Gly Ile Gly Asp Pro Leu Ser Leu195 200 205Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His210 215 220Pro His Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly225 230 235 240Arg Ala&lt;210&gt;41&lt;211&gt;729&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Paracoccus marcusii&lt;220&gt;
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His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn65 70 75 80Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp85 90 95Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr100 105 110Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala115 120 125Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro130 135 140Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr145 150 155 160Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe165 170 175Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro180 185 190Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu195 200 205Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His210 215 220Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp225 230 235 240Thr Ala&lt;210&gt;43
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Ala His Ile Ala Thr Tyr Ser Pro Arg Asp Ala Glu Lys Tyr Arg Gln115 120 125Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Leu Leu Asn Ala Val Gln Pro Ala Phe130 135 140Asn Ala Pro Pro Gln Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Asn Tyr Gly Trp145 150 155 160Glu Asn Leu Lys Ser Val Leu Ala Ile Ala Gly Ser Lys Thr Lys Ala165 170 175Lau Asp Phe Ile Arg Thr Met Ile Gly Ser Pro Glu Asp Val Leu Asn180 185 190Glu Trp Phe Asp Ser Glu Arg Val Lys Ala Pro Leu Ala Arg Leu Cys195 200 205Ser Glu Ile Gly Ala Pro Pro Ser Gln Lys Gly Ser Ser Ser Gly Met210 215 220Met Met Val Ala Met Arg His Leu Glu Gly Ile Ala Arg Pro Lys Gly225 230 235 240Gly Thr Gly Ala Leu Thr Glu Ala Leu Val Lys Leu Val Gln Ala Gln245 250 255Gly Gly Lys Ile Leu Thr Asp Gln Thr Val Lys Arg Val Leu Val Glu260 265 270Asn Asn Gln Ala Ile Gly Val Glu Val Ala Asn Gly Glu Gln Tyr Arg275 280 285Ala Lys Lys Gly Val Ile Ser Asn Ile Asp Ala Arg Arg Leu Phe Leu290 295 300Gln Leu Val Glu Pro Gly Ala Leu Ala Lys Val Asn Gln Asn Leu Gly305 310 315 320
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cag ccg agt tgc tca agc tgg gtg gca aat gag ttc agc cct cag gcc 96Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala20 25 30ctc aaa ggg ttg gct ctg gct ggt ctg att gga tca gcc tgg ctg ctc144Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu35 40 45tcc ctg ggc ctg agc tac acc ctg cca ctt gat cag acg cct ggg ctg192Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu50 55 60ttg att ggc agc ttg att ctg ctc aga gca ttt ctg cac acc ggg ctg240Leu Ile Gly Ser Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Leu His Thr Gly Leu65 70 75 80ttc atc gtt gcc cac gat tcc atg cac gcc agt ctg gtt ccg ggt cat288Phe Ile Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His85 90 95ccc gga ttg aac cgc tgg atc ggc aaa gtg tat ttg ttg gtg tat gca336Pro Gly Leu Asn Arg Trp Ile Gly Lys Val Tyr Leu Leu Val Tyr Ala100 105 110ggc ttg tct tat gag cgt tgt tcc cgc aac cac aga cgt cat cac ctg384Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Leu115 120 125gca ccg gag acg ttc cag gat cct gac tac caa cgt tgc acc aat aac432Ala Pro Glu Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn130 135 140aac atc cta gat tgg tat gtt cac ttc atg ggc aac tat ctg ggc atg480Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met145 150 155 160cgg caa ctg tta aat cta agc tgt ctt tgg ctg gcg cta atc att ctc528Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu165 170 175aac ggt tct gat ctc cct gct cag atc atg cat ctg ctg ttg ttc agc576Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser180 185 190gtt ctg ccg ttg atc atc agt tcc tgt caa ttg ttt cta gtg gga acc624Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr195 200 205
tgg tta ccc cac cga cgt ggg gcc acg aca cga ccg ggc gtg aca acg672Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr210 215 220cgc agc ctg gct ttg cat cca gcc ctc tct ttc gca gct tgt tac aac720Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn225 230 235 240ttt ggc tat cat cgt gaa cat cat gaa tcg cct tcc aca ccc tgg ttt768Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe245 250 255cag ctg cca caa ctt cga aat gaa tca ttc act tga804Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr260 265&lt;210&gt;76&lt;211&gt;267&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;聚球藻WH8102&lt;400&gt;76Met Lys Thr Thr Arg Ser Ile Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His1 5 10 15Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala20 25 30Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu35 40 45Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu50 55 60Leu Ile Gly Ser Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Leu His Thr Gly Leu65 70 75 80
Phe Ile Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His85 90 95Pro Gly Leu Asn Arg Trp Ile Gly Lys Val Tyr Leu Leu Val Tyr Ala100 105 110Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Leu115 120 125Ala Pro Glu Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn130 135 140Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met145 150 155 160Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu165 170 175Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser180 185 190Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr195 200 205Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr210 215 220Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn225 230 235 240Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe245 250 255Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr260 265&lt;210&gt;77
&lt;211&gt;1608&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;雨生紅球藻&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(3)..(971)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;77ct aca ttt cac aag ccc gtg agc ggt gca agc gct ctg ccc cac atc 47Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile1 5 10 15ggc cca cct cct cat ctc cat cgg tca ttt gct gct acc acg atg ctg 95Gly Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu20 25 30tcg aag ctg cag tca atc agc gtc aag gcc cgc cgc gtt gaa cta gcc143Ser Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala35 40 45cgc gac atc acg cgg ccc aaa gtc tgc ctg cat gct cag cgg tgc tcg191Arg Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser50 55 60tta gtt cgg ctg cga gtg gca gca cca cag aca gag gag gcg ctg gga239Leu Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly65 70 75acc gtg cag gct gcc ggc gcg ggc gat gag cac agc gcc gat gta gca287Thr Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala80 85 90 95ctc cag cag ctt gac cgg gct atc gca gag cgt cgt gcc cgg cgc aaa335Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys100 105 110
cgg gag cag ctg tca tac cag gct gcc gcc att gca gca tca att ggc383Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly115 120 125gtg tca ggc att gcc atc ttc gcc acc tac ctg aga ttt gcc atg cac431Val Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His130 135 140atg acc gtg ggc ggc gca gtg cca tgg ggt gaa gtg gct ggc act ctc479Met Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu145 150 155ctc ttg gtg gtt ggt ggc gcg ctc ggc atg gag atg tat gcc cgc tat527Leu Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr160 165 170 175gca cac aaa gcc atc tgg cat gag tcg cct ctg ggc tgg ctg ctg cac575Ala His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His180 185 190aag agc cac cac aca cct cgc act gga ccc ttt gaa gcc aac gac ttg623Lys Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu195 200 205ttt gca atc atc aat gga ctg ccc gcc atg ctc ctg tgt acc ttt ggc671Phe Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly210 215 220ttc tgg ctg ccc aac gtc ctg ggg gcg gcc tgc ttt gga gcg ggg ctg719Phe Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu225 230 235ggc atc acg cta tac ggc atg gca tat atg ttt gta cac gat ggc ctg767Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu240 245 250 255gtg cac agg cgc ttt ccc acc ggg ccc atc gct ggc ctg ccc tac atg815Val His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met260 265 270aag cgc ctg aca gtg gcc cac cag cta cac cac agc ggc aag tac ggt863Lys Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly275 280 285ggc gcg ccc tgg ggt atg ttc ttg ggt cca cag gag ctg cag cac att911Gly Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile290 295 300
cca ggt gcg gcg gag gag gtg gag cga ctg gtc ctg gaa ctg gac tgg 959Pro Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp305 310 315tcc aag cgg tag ggtgcggaac caggcacgct ggtttcacac ctcatgcctg 1011Ser Lys Arg320tgataaggtg tggctagagc gatgcgtgtg agacgggtat gtcacggtcg actggtctga1071tggccaatgg catcggccat gtctggtcat cacgggctgg ttgcctgggt gaaggtgatg1131cacatcatca tgtgcggttg gaggggctgg cacagtgtgg gctgaactgg agcaqttgtc1191caggctggcg ttgaatcagt gagggtttgt gattggcggt tgtgaagcaa tgactccgcc1251catattctat ttgtgggagc tgagatgatg gcatgcttgg gatgtgcatg gatcatggta1311gtgcagcaaa ctatattcac ctagggctgt tggtaggatc aggtgaggcc ttgcacattg1371catgatgtac tcgtcatggt gtgttggtga gaggatggat gtggatggat gtgtattctc1431agacgtagac cttgactgga ggcttgatcg agagagtggg ccgtattctt tgagagggga1491ggctcgtgcc agaaatggtg agtggatgac tgtgacgctg tacattgcag gcaggtgaga1551tgcactgtct cgattgtaaa atacattcag atgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1608&lt;210&gt;78&lt;211&gt;322&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;雨生紅球藻&lt;400&gt;78Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile Gly1 5 10 15Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu Ser20 25 30
Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala Arg35 40 45Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser Leu50 55 60Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly Thr65 70 75 80Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala Leu85 90 95Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys Arg100 105 110Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly Val115 120 125Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His Met130 135 140Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu Leu145 150 155 160Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr Ala165 170 175His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His Lys180 185 190Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe195 200 205Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly Phe210 215 220Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly225 230 235 240
Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu Val245 250 255His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met Lys260 265 270Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly Gly275 280 285Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile Pro290 295 300Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp Ser305 310 315 320Lys Arg&lt;210&gt;79&lt;211&gt;33&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
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&lt;400&gt;79gcatgctcta gaccttataa agatattttg tga33
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&lt;221&gt;primer_bind&lt;222&gt;(1)..(33)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;80gcatgcatct agaaatggtt cagtgtcaac cat 33&lt;210&gt;81&lt;211&gt;805&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;念珠藻屬Pcc7120株&lt;220&gt;
&lt;221&gt;variation&lt;222&gt;(1)..(805)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;81gcatgcatct agaaatggtt cagtgtcaac catcatctct gcattcagaa aaactggtgt 60tattgtcatc gacaatcaga gatgataaaa atattaataa gggtatattt attgcctgct120
ttatcttatt tttatgggca attagtttaa tcttattact ctcaatagat acatccataa180ttcataagag cttattaggt atagccatgc tttggcagac cttcttatat acaggtttat240ttattactgc tcatgatgcc atgcacggcg tagtttatcc caaaaatccc agaataaata300attttatagg taagctcact ctaatcttgt atggactact cccttataaa gatttattga360aaaaacattg gttacaccac ggacatcctg gtactgattt agaccctgat tattacaatg420gtcatcccca aaacttcttt ctttggtatc tacattttat gaagtcttat tggcgatgga480cgcaaatttt cggattagtg atgatttttc atggacttaa aaatctggtg catataccag540aaaataattt aattatattt tggatgatac cttctatttt aagttcagta caactatttt600attttggtac atttttgcct cataaaaagc tagaaggtgg ttatactaac ccccattgtg660cgcgcagtat cccattacct cttttttggt cttttgttac ttgttatcac ttcggctacc720acaaggaaca tcacgaatac cctcaacttc cttggtggaa attacctgaa gctcacaaaa780tatctttata aggtctagag catgc 805&lt;210&gt;82&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
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&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(128)..(1267)&lt;223&gt;
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature
&lt;222&gt;(1288)..(2766)&lt;223&gt;
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(2802)..(3689)&lt;223&gt;
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(3631)..(4158)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;84gtcgactttc agcagcgcat ggcgaaaatc cagacagccc ttcgtttggc agggggcacc 60atggccgctg ccgatatcat tgagcaggtt atgtgcaccg gtcagcctgt cttaagtggg 120agcggct atg caa ccg cat tat gat ctg att ctc gtg ggg gct gga ctc169Met Gln Pro His Tyr Asp Leu Ile Leu Val Gly Ala Gly Leu1 5 10gcg aat ggc ctt atc gcc ctg cgt ctt cag cag cag caa cct gat atg217Ala Asn Gly Leu Ile Ala Leu Arg Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asp Met15 20 25 30cgt att ttg ctt atc gac gcc gca ccc cag gcg ggc ggg aat cat acg265Arg Ile Leu Leu Ile Asp Ala Ala Pro Gln Ala Gly Gly Asn His Thr35 40 45tgg tca ttt cac cac gat gat ttg act gag agc caa cat cgt tgg ata313Trp Ser Phe His His Asp Asp Leu Thr Glu Ser Gln His Arg Trp Ile50 55 60gct ccg ctg gtg gtt cat cac tgg ccc gac tat cag gta cgc ttt ccc361Ala Pro Leu Val Val His His Trp Pro Asp Tyr Gln Val Arg Phe Pro65 70 75
aca cgc cgt cgt aag ctg aac agc ggc tac ttt tgt att act tct cag409Thr Arg Arg Arg Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Phe Cys Ile Thr Ser Gln80 85 90cgt ttc gct gag gtt tta cag cga cag ttt ggc ccg cac ttg tgg atg457Arg Phe Ala Glu Val Leu Gln Arg Gln Phe Gly Pro His Leu Trp Met95 100 105 110gat acc gcg gtc gca gag gtt aat gcg gaa tct gtt cgg ttg aaa aag505Asp Thr Ala Val Ala Glu Val Asn Ala Glu Ser Val Arg Leu Lys Lys115 120 125ggt cag gtt atc ggt gcc cgc gcg gtg att gac ggg cgg ggt tat gcg553Gly Gln Val Ile Gly Ala Arg Ala Val Ile Asp Gly Arg Gly Tyr Ala130 135 140gca aat tca gca ctg agc gtg ggc ttc cag gcg ttt att ggc cag gaa601Ala Asn Ser Ala Leu Ser Val Gly Phe Gln Ala Phe Ile Gly Gln Glu145 150 155tgg cga ttg agc cac ccg cat ggt tta tcg tct ccc att atc atg gat649Trp Arg Leu Ser His Pro His Gly Leu Ser Ser Pro Ile Ile Met Asp160 165 170gcc acg gtc gat cag caa aat ggt tat cgc ttc gtg tac agc ctg ccg697Ala Thr Val Asp Gln Gln Asn Gly Tyr Arg Phe Val Tyr Ser Leu Pro175 180 185 190ctc tcg ccg acc aga ttg tta att gaa gac acg cac tat att gat aat745Leu Ser Pro Thr Arg Leu Leu Ile Glu Asp Thr His Tyr Ile Asp Asn195 200 205gcg aca tta gat cct gaa tgc gcg cgg caa aat att tgc gac tat gcc793Ala Thr Leu Asp Pro Glu Cys Ala Arg Gln Asn Ile Cys Asp Tyr Ala210 215 220gcg caa cag ggt tgg cag ctt cag aca ctg ctg cga gaa gaa cag ggc841Ala Gln Gln Gly Trp Gln Leu Gln Thr Leu Leu Arg Glu Glu Gln Gly225 230 235gcc tta ccc att act ctg tcg ggc aat gcc gac gca ttc tgg cag cag889Ala Leu Pro Ile Thr Leu Ser Gly Asn Ala Asp Ala Phe Trp Gln Gln240 245 250cgc ccc ctg gcc tgt agt gga tta cgt gcc ggt ctg ttc cat cct acc937Arg Pro Leu Ala Cys Ser Gly Leu Arg Ala Gly Leu Phe His Pro Thr255 260 265 270
acc ggc tat tca ctg ccg ctg gcg gtt gcc gtg gcc gac cgc ctg agt 985Thr Gly Tyr Ser Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Asp Arg Leu Ser275 280 285gca ctt gat gtc ttt acg tcg gcc tca att cac cat gcc att acg cat 1033Ala Leu Asp Val Phe Thr Ser Ala Ser Ile His His Ala Ile Thr His290 295 300ttt gcc cgc gag cgc tgg cag cag cag ggc ttt ttc cgc atg ctg aat 1081Phe Ala Arg Glu Arg Trp Gln Gln Gln Gly Phe Phe Arg Met Leu Asn305 310 315cgc atg ctg ttt tta gcc gga ccc gcc gat tca cgc tgg cgg gtt atg 1129Arg Met Leu Phe Leu Ala Gly Pro Ala Asp Ser Arg Trp Arg Val Met320 325 330cag cgt ttt tat ggt tta cct gaa gat tta att gcc cgt ttt tat gcg 1177Gln Arg Phe Tyr Gly Leu Pro Glu Asp Leu Ile Ala Arg Phe Tyr Ala335 340 345 350gga aaa ctc acg ctg acc gat cgg cta cgt att ctg agc ggc aag ccg 1225Gly Lys Leu Thr Leu Thr Asp Arg Leu Arg Ile Leu Ser Gly Lys Pro355 360 365cct gtt ccg gta tta gca gca ttg caa gcc att atg acg act 1267Pro Val Pro Val Leu Ala Ala Leu Gln Ala Ile Met Thr Thr370 375 380catcgttaaa gagcgactac atgaaaccaa ctacggtaat tggtgcaggc ttcggtggcc1327tggcactggc aattcgtcta caagctgcgg ggatccccgt cttactgctt gaacaacgtg1387ataaacccgg cggtcgggct tatgtctacg aggatcaggg gtttaccttt gatgcaggcc1447cgacggttat caccgatccc agtgccattg aagaactgtt tgcactggca ggaaaacagt1507taaaagagta tgtcgaactg ctgccggtta cgccgtttta ccgcctgtgt tgggagtcag1567ggaaggtctt taattacgat aacgatcaaa cccggctcga agcgcagatt cagcagttta1627atccccgcga tgtcgaaggt tatcgtcagt ttctggacta ttcacgcgcg gtgtttaaag1687aaggctatct aaagctcggt actgtccctt ttttatcgtt cagagacatg cttcgcgccg1747cacctcaact ggcgaaactg caggcatgga gaagcgttta cagtaaggtt gccagttaca1807tcgaagatga acatctgcgc caggcgtttt ctttccactc gctgttggtg ggcggcaatc1867ccttcgccac ctcatccatt tatacgttga tacacgcgct ggagcgtgag tggggcgtct1927
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Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Val Ile35 40 45Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Ile50 55 60Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile His Asn Phe Thr Leu Val His65 70 75 80Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met Arg Arg Gly Val Pro Thr Val85 90 95His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala Ile Leu Ala Gly Asp Thr Leu100 105 110Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr Lys Cys Asp Val Glu Ser Glu115 120 125Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu Ser Asp Val Cys Ile Lys Ile130 135 140Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser Phe Glu Lys Lys Glu Ser Val145 150 155 160Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val Glu Leu Lys Thr Gly Val Leu165 170 175Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala Val Leu Phe Gly Glu Ser Glu180 185 190Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr Gly Val Leu Ser Gly Ile Gly195 200 205Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp Leu Thr Glu Glu Thr Gly Lys210 215 220Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly Lys Lys Thr Leu Ile Val Ile225 230 235 240
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&lt;221&gt;啟動子&lt;222&gt;(1)..(647)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;98gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgaccagcga acgcagaata ccttgttgtg 60taatacttta cccgtgtaaa tcaaaaacaa aaaggctttt gagctttttg tagttgaatt120tctctggctg atcttttctg tacagattca tatatctgca gagacgatat cattgattat180
ttgagcttct tttgaactat ttcgtgtaat ttgggatgag agctctatgt atgtgtgtaa240actttgaaga caacaagaaa ggtaacaagt gagggaggga tgactccatg tcaaaataga300tgtcataaga ggcccatcaa taagtgcttg agcccattag ctagcccagt aactaccaga360ttgtgagatg gatgtgtgaa cagttttttt tttgatgtag gactgaaatg tgaacaacag420gcgcatgaaa ggctaaatta ggacaatgat aagcagaaat aacttatcct ctctaacact480tggcctcaca ttgcccttca cacaatccac acacatccaa tcacaacctc atcatatatc540tcccgctaat ctttttttct ttgatctttt tttttttgct tattattttt ttgactttga600tctcccatca gttcatcttc ttcttcttct tctgatcaac caagctt 647&lt;210&gt;99&lt;211&gt;28&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;primer_bind&lt;222&gt;(1)..(28)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;99gagctcactc actgatttcc attgcttg 28&lt;210&gt;100&lt;211&gt;37&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(37)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;100gcgcatgcat ctagaaatga tccagttaga acaacca 37&lt;210&gt;101&lt;211&gt;37&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(37)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;101gcgcatgctc tagactattt tgctttgtaa atttctg 37&lt;210&gt;102&lt;211&gt;792&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;點形念珠藻ATCC 29133
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(5)..(775)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;102gcgc atg cat cta gaa atg atc cag tta gaa caa cca ctc agt cat caa49Met His Leu Glu Met Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln1 5 10 15gca aaa ctg act cca gta ctg aga agt aaa tct cag ttt aag ggg ctt 97Ala Lys Leu Thr Pro Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu20 25 30ttc att gct att gtc att gtt agc gca tgg gtc att agc ctg agt tta145Phe Ile Ala Ile Val Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu35 40 45tta ctt tcc ctt gac atc tca aag cta aaa ttt tgg atg tta ttg cct193Leu Leu Ser Leu Asp Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro50 55 60gtt ata cta tgg caa aca ttt tta tat acg gga tta ttt att aca tct241Val Ile Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser65 70 75cat gat gcc atg cat ggc gta gta ttt ccc caa aac acc aag att aat289His Asp Ala Met His Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn80 85 90 95cat ttg att gga aca ttg acc cta tcc ctt tat ggt ctt tta cca tat337His Leu Ile Gly Thr Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr100 105 110caa aaa cta ttg aaa aaa cat tgg tta cac cac cac aat cca gca agc385Gln Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser115 120 125tca ata gac ccg gat ttt cac aat ggt aaa cac caa agt ttc ttt gct433Ser Ile Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala130 135 140
tgg tat ttt cat ttt atg aaa ggt tac tgg agt tgg ggg caa ata att481Trp Tyr Phe His Phe Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile145 150 155gcg ttg act att att tat aac ttt gct aaa tac ata ctc cat atc cca529Ala Leu Thr Ile Ile Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro160 165 170 175agt gat aat cta act tac ttt tgg gtg cta ccc tcg ctt tta agt tca577Ser Asp Asn Leu Thr Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser180 185 190tta caa tta ttc tat ttt ggt act ttt tta ccc cat agt gaa cca ata625Leu Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile195 200 205ggg ggt tat gtt cag cct cat tgt gcc caa aca att agc cgt cct att673Gly Gly Tyr Val Gln Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile210 215 220tgg tgg tca ttt atc acg tgc tat cat ttt ggc tac cac gag gaa cat721Trp Trp Ser Phe Ile Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His225 230 235cac gaa tat cct cat att tct tgg tgg cag tta cca gaa att tac aaa769His Glu Tyr Pro His Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys240 245 250 255gca aaa tagtctagag catgcgc 792Ala Lys&lt;210&gt;103&lt;211&gt;257&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;點形念珠藻ATCC 29133&lt;400&gt;103Met His Leu Glu Met Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala1 5 10 15
Lys Leu Thr Pro Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe20 25 30Ile Ala Ile Val Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu Leu35 40 45Leu Ser Leu Asp Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val50 55 60Ile Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser His65 70 75 80Asp Ala Met His Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn His85 90 95Leu Ile Gly Thr Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln100 105 110Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Ser115 120 125Ile Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp130 135 140Tyr Phe His Phe Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala145 150 155 160Leu Thr Ile Ile Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser165 170 175Asp Asn Leu Thr Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu180 185 190Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly195 200 205Gly Tyr Val Gln Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp210 215 220
Trp Ser Phe Ile Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His225 230 235 240Glu Tyr Pro His Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala245 250 255Lys&lt;210&gt;104&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(26)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;104gtcgaccctg ctttaatgag atatgc 26&lt;210&gt;105&lt;211&gt;27&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(27)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;105ctcgagcttg gacaatcagt aaattga27&lt;210&gt;106&lt;211&gt;210&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;根癌農桿菌&lt;220&gt;
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&lt;400&gt;106gtcgaccctg ctttaatgag atatgcgaga cgcctatgat cgcatgatat ttgctttcaa 60ttctgttgtg cacgttgtaa aaaacctgag catgtgtagc tcagatcctt accgccggtt120tcggttcatt ctaatgaata tatcacccgt tactatcgta tttttatgaa taatattctc180cgttcaattt actgattqtc caagctcgag 210&lt;210&gt;107&lt;211&gt;37
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(37)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;107cccgggaatt cttcattatt tcgattttga tttcgtg 37&lt;210&gt;108&lt;211&gt;38&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(38)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;108aagcttggtt gatcagaaga agaagaagaa gatgaact 38&lt;210&gt;109&lt;211&gt;652
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;擬南芥&lt;220&gt;
&lt;221&gt;啟動子&lt;222&gt;(1)..(652)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;109cccgggaatt cttcattatt tcgattttga tttcgtgacc agcgaacgca gaataccttg 60ttgtgtaata ctttacccgt gtaaatcaaa aacaaaaagg cttttgagct ttttgtagtt120gaatttctct ggctgatctt ttctgtacag attcatatat ctgcagagac gatatcattg180attatttgag cttcttttga actatttcgt gtaatttggg atgagagctc tatgtatgtg240tgtaaacttt gaagacaaca agaaaggtaa caagtgaggg agggatgact ccatgtcaaa300atagatgtca taagaggccc atcaataagt gcttgagccc attagctagc ccagtaacta360ccagattgtg agatggatgt gtgaacagtt ttttttttga tgtaggactg aaatgtgaac420aacaggcgca tgaaaggcta aattaggaca atgataagca gaaataactt atcctctcta480acacttggcc tcacattgcc cttcacacaa tccacacaca tccaatcaca acctcatcat540atatctcccg ctaatctttt tttctttgat cttttttttt ttgcttatta tttttttgac600tttgatctcc catcagttca tcttcttctt cttcttctga tcaaccaagc tt652&lt;210&gt;110&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(29)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;110gagctctagc gcaatcttat gtggtacaa29&lt;210&gt;111&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(29)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;111aagcttttct tgaaagtaaa gattgagtc29&lt;210&gt;112&lt;211&gt;1773&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;碧冬茄
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;啟動子&lt;222&gt;(1)..(1773)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;112gagctctagc gcaatcttat gtggtacaaa tcttgattag tcgggaaaaa atgatgtggc 60cctacaaatg gttggaggat gggagatttg gctctatcta gagttatgtg gttgttgaag 120catttggtta ctctctgctg tggtagttgg catatccaca ttgtctcctt ccacttttat 180gacaattacg tgaaagttat gggttgtttt gtctattttt gtcgagqcct ttcttttcct 240tccaggttgt tgaagatggt ccaattcgat tagaataatg ttttgagctt tagcatattc 300tctctcgttt acacgattat agtaataatg atataggatg acagaagttg acacataaat 360tttttattct ctccatttac tttaatccaa atctcaccta ccctaaactt ctttaatatg 420tattcaatag tctatccgag taaattgtaa atttaacaac cattgataat attgacacct 480actaacatat actagtaaag agaatattaa catggcacat ataatttgat gcaaaatgag 540tatgatgaaa tttaaaccca aaatctcttg attttgacag tgtcaccttg acttgttaac 600taataagtca tgttttagtg gcagaaagac aaactcatcc accaactgta tagcaataaa 660aaatagaaga atcttcctga ggcaaagttt tggaaaaatt aagagtggct gagatttaat 720ttcaacagga attagttcca cttaactttt aggttacgat acagtgctaa ttaaataact 780taattgtatt agatatttct tqcacctaaa aaatttaaaa actgaaaaaa ggtagcaatc 840aaaataaaca aaaggacaaa ataagtgaaa ggtacagcca ccaaccctgg cggctcactg 900tttgttggtt aaaacgtaga cttacaccta ccaaaatcta caactaaaat gagqcaataa 960tactttgccc aaaattacca agaaaagaaa aagaaaggaa tcccttaata ttactctcct1020ccatttcaca ataaatatcc tagtttgact taaattagag tttaaaaaat gaaagacgac1080
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&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(39)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;113gcgcatgcat ctagaaatga atttttgtga taaaccagt 39
&lt;210&gt;114&lt;211&gt;37&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(37)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;114gcgcatgctc tagattacga attggttact gaattgt 37&lt;210&gt;115&lt;211&gt;819&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;點形念珠藻ATCC 29133&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(5)..(802)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;115gcgcatgcat ctagaaatga atttttgtga taaaccagtt agctattatg ttgcaataga 60gcaattaagt gctaaagaag atactgtttg ggggctggtg attgtcatag taattattag120
tctttgggta gctagtttgg cttttttact agctattaat tatgccaaag tcccaatttg180gttgatacct attgcaatag tttggcaaat gttcctttat acagggctat ttattactgc240acatgatgct atgcatgggt cagtttatcg taaaaatccc aaaattaata attttatcgg300ttcactagct gtagcgcttt acgctgtgtt tccatatcaa cagatgttaa agaatcattg360cttacatcat cgtcatcctg ctagcgaagt tgacccagat tttcatgatg gtaagagaac420aaacgctatt ttctggtatc tccatttcat gatagaatac tccagttggc aacagttaat480agtactaact atcctattta atttagctaa atacgttttg cacatccatc aaataaatct540catcttattt tggagtattc ctccaatttt aagttccatt caactgtttt atttcggaac600atttttgcct catcgagaac ccaagaaagg atatgtttat ccccattgca gccaaacaat660aaaattgcca acttttttgt catttatcgc ttgctaccac tttggttatc atgaagaaca720tcatgagtat ccccatgtac cttggtggca acttccatct gtatataagc agagagtatt780caacaattca gtaaccaatt cgtaatctag agcatgcgc 819&lt;210&gt;116&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(24)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;116gaattcctgc aatagaatgt tgag 24
&lt;210&gt;117&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(25)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;117ctcgagctta cgagcatttt ctaag 25&lt;210&gt;118&lt;211&gt;307&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;蠶豆&lt;220&gt;
&lt;221&gt;終止子&lt;222&gt;(1)..(307)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;118gaattcctgc aatagaatgt tgaggtgacc actttctgta ataaaataat tataaaataa 60atttagaatt gctgtagtca agaacatcag ttctaaaata ttaataaagt tatggccttt120
tgacatatgt gtttcgataa aaaaatcaaa ataaattgag atttattcga aatacaatga180aagtttgcag atatgagata tgtttctaca aaataataac ttaaaactca actatatgct240aatgtttttc ttggtgtgtt tcatagaaaa ttgtatccgt ttcttagaaa atgctcgtaa300gctcgag 307&lt;210&gt;119&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(25)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;119gaattcccaa taataatcta cagcc 25&lt;210&gt;120&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(25)
&lt;223&gt;
&lt;400&gt;120aagcttccat gqcggccgga atttc 25&lt;210&gt;121&lt;211&gt;1020&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;食用番茄&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(1)..(1020)&lt;223&gt;編碼β-羥化酶的核酸&lt;400&gt;121aagcttccat ggcggccgga atttcagcct ccgctagttc ccgaaccatt cgcctccgtc 60ataacccgtt tctcagtcca aaatccgcct caaccgcccc gccggttctg ttcttctctc120cgttaactcg caattttggc gcaattttgc tgtctagaag aaagccgaga ttggcggttt180gttttgtgct ggagaatgag aaattgaata gtactatcga aagtgagagt gaagtaatag240aggatcggat acaagtagag attaatgagg agaagagttt agctgccagt tggctggcgg300agaaattggc gaggaagaaa tcggagaggt ttacttatct tgtggcagct gtgatgtcta360gtttggggat tacttctatg gcgattttgg cggtttatta cagattttca tggcaaatgg420agggtggaga agtgcctttt tctgaaatgt tagctacatt cactctctcg tttggcgctg480ccgtaggaat ggagtactgg gcgagatggg ctcatagagc actatggcat gcttctttat540ggcacatgca cgagtcgcac catagaccaa gagaaggacc ttttgagatg aacgacgttt600
tcgccataac aaatgctgtt ccagctatag gtcttctttc ctacggtttc ttccataaag 660ggatcgtccc tggcctctgt ttcggcgctg gattggggat cacagtattt gggatggctt 720acatgttcgt tcacgatgga ctggttcata agagatttcc cgtagggcct attgccaacg 780tgccttactt tcggagggta gctgcagcac atcagcttca tcactcggac aaatttgatg 840gtgtcccata tggcttgttt ctaggaccta aggaattgga agaagtagga ggacttgaag 900agttagaaaa ggaagtcaac cgaaggatta aaatttctaa gggattatta tgatcaaaag 960atacgtctga taataataaa atgcgattgt atttaggctg tagattatta ttgggaattc1020&lt;210&gt;122&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(24)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;122gagctctagc gcaatcttat gtgg 24&lt;210&gt;123&lt;211&gt;22&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(22)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;123ccatggttct cacttctgta tg 22&lt;210&gt;124&lt;211&gt;1802&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;碧冬茄&lt;220&gt;
&lt;221&gt;啟動子&lt;222&gt;(1)..(1802)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;124gagctctagc gcaatcttat gtggtacaaa tcttgattag tcgggaaaaa atgatgtggc 60cctacaaatg gttggaggat gggagatttg gctctatcta gagttatgtg gttgttgaag120catttggtta ctctctgctg tggtagttgg catatccaca ttgtctcctt ccacttttat180gacaattacg tgaaagttat gggttgtttt gtctattttt gtcgaggcct ttcttttcct240tccaggttgt tgaagatggt ccaattcgat tagaataatg ttttgagctt tagcatattc300tctctcgttt acacgattat agtaataatg atataggatg acagaagttg acacataaat360tttttattct ctccatttac tttaatccaa atctcaccta ccctaaactt ctttaatatg420
tattcaatag tctatccgag taaattgtaa atttaacaac cattgataat attgacacct 480actaacatat actagtaaag agaatattaa catggcacat ataatttgat gcaaaatgag 540tatgatgaaa tttaaaccca aaatctcttg attttgacag tgtcaccttg acttgttaac 600taataagtca tgttttagtg gcagaaagac aaactcatcc accaactgta tagcaataaa 660aaatagaaga atcttcctga ggcaaagttt tggaaaaatt aagagtggct gagatttaat 720ttcaacagga attagttcca cttaactttt aggttacgat acagtgctaa ttaaataact 780taattgtatt agatatttct tgcacctaaa aaatttaaaa actgaaaaaa ggtagcaatc 840aaaataaaca aaaggacaaa ataagtgaaa ggtacagcca ccaaccctgg cggctcactg 900tttgttggtt aaaacgtaga cttacaccta ccaaaatcta caactaaaat gaggcaataa 960tactttgccc aaaattacca agaaaagaaa aagaaaggaa tcccttaata ttactctcct1020ccatttcaca ataaatatcc tagtttgact taaattagag tttaaaaaat gaaagacgac1080ttttaaaact tgtaatctaa aataaatcat agttaaatgt gtggctataa atcattgtat1140taacggtaaa gtggtaagtt taaaagttaa ttgttttcaa atataaaatt gtactatcat1200tctttttgga atggactaat aagaaaacta tgacatccat tatggagcgg agggagtatc1260tccttttaac aataaccttt gtcccttcaa ttcaattatc agtatgcaaa cattaaaaat1320tattattgat gttaagtacc acatcatcct taatgataga atcatcgtag aacgcttttc1380caggcacaca ttcaaactag ttagaccagt accacacatc gaatattcca gacttctttg1440tttgaatagt cgactacatt ggataatgga acttctcgaa ttaacttcga attagtcgag1500cccaaaataa tatatacgtc gggtggaaaa ctataaaatg tttgacaaaa atgtcaaatt1560aatatatcaa tctgcaacaa ccttttcacc ttgagaacac agctgaaatt ttttacaaag1620gtagttggtg aagctagtca gcgaatccca ttaccttcca ctctacctaa cccccttcac1680caacaacaaa tttctgtaat ttaaaaacta gccaaaaaag aactctcttt tacaaagagc1740caaagactca atctttactt tcaagaaaag ctttgcaatt catacagaag tgagaaccat1800gg 1802
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1.通過培養遺傳修飾的非人生物制備酮類胡蘿卜素的方法，所述遺傳修飾的生物與野生型相比具有修飾的酮酶活性及修飾的β環化酶活性，而其修飾的β環化酶活性是由于β環化酶造成，其含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
2.如權利要求1的方法，其中使用野生型具有酮酶活性而遺傳修飾使其酮酶活性相對于野生型增加的非人生物。
3.如權利要求2的方法，其中通過提高編碼酮酶的核酸相對于野生型的基因表達來增加酮酶活性。
4.如權利要求3的方法，其中通過向生物中插入編碼酮酶的核酸來增加基因表達。
5.如權利要求4的方法，其中插入的編碼酮酶的核酸所編碼的酮酶含有SEQ ID NO4氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO4序列至少有70％的同一性。
6.如權利要求1的方法，其中使用野生型不具有酮酶活性而遺傳修飾使其相對于野生型造成酮酶活性的非人生物。
7.如權利要求6的方法，其中使用轉基因表達酮酶的遺傳修飾生物。
8.如權利要求6或7的方法，其中通過向生物中插入編碼酮酶的核酸來造成基因表達。
9.如權利要求8的方法，其中插入的核酸編碼的酮酶含有SEQ ID NO4氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO4序列至少有70％的同一性。
10.如權利要求5或9的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO3的核酸。
11.如權利要求1至10中任一項的方法，其中使用野生型已經具有β環化酶活性而遺傳修飾使其β環化酶活性相對于野生型增加的生物。
12.如權利要求11的方法，其中通過提高編碼β環化酶的核酸相對于野生型的基因表達來增加β環化酶活性，所述β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
13.如權利要求12的方法，其中通過向生物中插入編碼β環化酶的核酸來增加基因表達，所述β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
14.如權利要求1至10中任一項的方法，其中使用野生型不具有β環化酶活性而遺傳修飾使其相對于野生型造成β環化酶活性的生物。
15.如權利要求14的方法，其中使用轉基因表達β環化酶的遺傳修飾生物，所述β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
16.如權利要求14或15的方法，其中通過向生物中插入編碼β環化酶的核酸來造成基因表達，所述β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
17.如權利要求13或16的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO1的核酸。
18.如權利要求1至17中任一項的方法，其中使用相對于野生型額外具有增加的或造成的羥化酶活性的非人生物。
19.如權利要求18的方法，其中通過增加或造成編碼羥化酶的核酸相對于野生型的基因表達來額外增加或造成羥化酶活性。
20.如權利要求19的方法，其中通過向生物中插入編碼羥化酶的核酸來增加或造成基因表達。
21.如權利要求20的方法，其中插入的編碼羥化酶的核酸，其編碼的羥化酶含有SEQ ID NO6氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO6序列至少有70％的同一性。
22.如權利要求21的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO5的核酸。
23.如權利要求1至22中任一項的方法，其中使用相對于野生型額外具有增加的或造成的選自HMG-CoA還原酶活性、(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶活性、異戊烯二磷酸酯Δ-異構酶活性、牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶活性、八氫番茄紅素合酶活性、八氫番茄紅素去飽和酶活性、ζ-胡蘿卜素去飽和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性以及MinD活性中至少一種的生物。
24.如權利要求23的方法，其中通過增加選自編碼HMG-CoA還原酶的核酸、編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸、編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸、編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸、編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸、編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸、編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸、編碼八氫番茄紅素合酶的核酸、編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸、編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸、編碼crtISO蛋白的核酸、編碼FtsZ蛋白的核酸、編碼MinD蛋白的核酸中至少一種相對于野生型的基因表達來額外增加或造成至少一種活性。
25.如權利要求24的方法，其中通過向非人生物中插入選自編碼HMG-CoA還原酶的核酸、編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸、編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸、編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸、編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸、編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸、編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸、編碼八氫番茄紅素合酶的核酸、編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸、編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸、編碼crtISO蛋白的核酸、編碼FtsZ蛋白的核酸、編碼MinD蛋白的核酸中至少一種來增加或造成至少一種核酸的基因表達。
26.如權利要求25的方法，其中插入編碼HMG-CoA還原酶的核酸，其編碼的HMG-CoA還原酶含有SEQ ID NO8氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO8序列至少有20％的同一性。
27.如權利要求26的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO7的核酸。
28.如權利要求25的方法，其中插入編碼(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶的核酸，其編碼的(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯還原酶含有SEQ ID NO10氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO10序列至少有20％的同一性。
29.如權利要求28的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO9的核酸。
30.如權利要求25的方法，其中插入編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸，其編碼的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶含有SEQ ID NO12氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO12序列至少有20％的同一性。
31.如權利要求30的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO11的核酸。
32.如權利要求25的方法，其中插入編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶的核酸，其編碼的1-脫氧-D-木糖-5-磷酸還原異構酶含有SEQ IDNO14氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO14序列至少有20％的同一性。
33.如權利要求32的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO13的核酸。
34.如權利要求25的方法，其中插入編碼異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶的核酸，其編碼的異戊烯基二磷酸酯Δ-異構酶含有SEQ ID NO16氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO16序列至少有20％的同一性。
35.如權利要求34的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO15的核酸。
36.如權利要求25的方法，其中插入編碼牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸，其編碼的牻牛兒基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO18氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO18序列至少有20％的同一性。
37.如權利要求36的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO17的核酸。
38.如權利要求25的方法，其中插入編碼法呢基二磷酸酯合酶的核酸，其編碼的法呢基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO20氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQID NO20序列至少有20％的同一性。
39.如權利要求38的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO19的核酸。
40.如權利要求25的方法，其中插入編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶的核酸，其編碼的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO22氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO22序列至少有20％的同一性。
41.如權利要求40的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO21的核酸。
42.如權利要求25的方法，其中插入編碼八氫番茄紅素合酶的核酸，其編碼的八氫番茄紅素合酶含有SEQ ID NO24氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO24序列至少有20％的同一性。
43.如權利要求42的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO23的核酸。
44.如權利要求25的方法，其中插入編碼八氫番茄紅素去飽和酶的核酸，其編碼的八氫番茄紅素去飽和酶含有SEQ ID NO26氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO26序列至少有20％的同一性。
45.如權利要求44的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO25的核酸。
46.如權利要求25的方法，其中插入編碼ζ-胡蘿卜素去飽和酶的核酸，其編碼的ζ-胡蘿卜素去飽和酶含有SEQ ID NO28氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQID NO28序列至少有20％的同一性。
47.如權利要求46的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO27的核酸。
48.如權利要求25的方法，其中插入編碼crtISO蛋白的核酸，其編碼的crtISO蛋白含有SEQ ID NO30氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO30序列至少有20％的同一性。
49.如權利要求48的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO29的核酸。
50.如權利要求25的方法，其中插入編碼FtsZ蛋白的核酸，其編碼的FtsZ蛋白含有SEQ ID NO32氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO32序列至少有20％的同一性。
51.如權利要求50的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO31的核酸。
52.如權利要求25的方法，其中插入編碼MinD蛋白的核酸，其編碼的MinD蛋白含有SEQ ID NO34氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO34序列至少有20％的同一性。
53.如權利要求52的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO33的核酸。
54.如權利要求1至53中任一項的方法，其中在培養后收集遺傳修飾的生物并隨后從生物中分離酮類胡蘿卜素。
55.如權利要求1至54中任一項的方法，其中使用起始生物可天然產生或能夠通過遺傳互補或代謝途徑的再調節生產類胡蘿卜素的生物。
56.如權利要求1至55中任一項的方法，其中使用的生物是微生物或植物。
57.如權利要求56的方法，其中使用的微生物為細菌、酵母、藻類或真菌。
58.如權利要求57的方法，其中微生物選自埃希氏桿菌屬、歐文氏菌屬、農桿菌屬、黃桿菌屬、產堿菌屬、副球菌屬、念珠藻屬、集胞藻屬藍細菌、假絲酵母屬、酵母屬、漢遜酵母屬、法夫酵母屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、木霉屬、阿舒囊霉屬、脈孢菌屬、布拉霉屬、須霉屬、鐮孢霉屬、紅球藻屬、三角褐指藻、團藻屬或杜氏藻屬。
59.如權利要求56的方法，其中使用的生物為植物。
60.如權利要求59的方法，其中使用的植物選自莧科、石蒜科、夾竹桃科、紫菀科、鳳仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫蘆科、十字花科、大戟屬、豆科、龍膽科、牻牛兒苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亞麻科、山梗菜屬、錦葵科、木犀科、蘭科、罌粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、報春花科、毛茛科、薔薇科、茜草科、玄參科、茄科、旱金蓮科、傘狀花科、毛蕊花科、葡萄科或紫羅蘭科。
61.如權利要求60的方法，其中使用的植物選自萬壽菊屬、萬壽菊、孔雀草、金合歡屬、烏頭屬、側金盞花屬、阿尼菊屬、耬斗菜屬、紫菀屬、黃芪屬、紫葳屬、金盞花屬、驢蹄草屬、風鈴草屬、美人蕉屬、矢車菊屬、桂竹香屬、茼蒿屬、柑桔屬、還陽參屬、番紅花屬、南瓜屬、金雀兒屬、Delonia屬、翠雀屬、石竹屬、康乃馨屬、多榔菊屬、花菱草屬、連翹屬、Fremontia屬、勛章菊屬、鉤吻屬、染料木屬、龍膽屬、老鸛草屬、非洲菊屬、路邊青屬、銀樺屬、堆心菊屬、向日葵屬、細辛屬、獨活屬、木槿屬、賽菊芋屬、金絲桃屬、黃金菊屬、鳳仙花屬、鳶尾屬、藍花楹屬、棣堂屬、毒豆屬、山黧豆屬、貓耳草屬、百合屬、亞麻屬、百脈根屬、番茄屬、珍珠菜屬、Maratia、苜蓿屬、溝酸漿屬、水仙屬、月見草屬、木犀屬、碧冬茄屬、石楠屬、酸漿屬、牧根草屬、委陵草屬、火棘屬、毛茛屬、杜鵑花屬、薔薇屬、金光菊屬、千里光屬、蠅子草屬、松香草屬、Sinapsis、花楸屬、鷹爪豆屬、黃鐘花屬、蝴蝶草屬、婆羅們參屬、金蓮花屬、旱金蓮屬、郁金香屬、款冬屬、荊豆屬、堇菜屬或百日草屬植物。
62.如權利要求1至61中任一項的方法，其中酮類胡蘿卜素選自蝦青素、角黃素、海膽酮、3-羥基海膽酮、3’-羥基海膽酮、金盞花玉紅質和金盞花黃質。
63.遺傳修飾的非人生物，其中該遺傳修飾，A.對于已經具有酮酶活性的野生型生物，與野生型相比增加其酮酶活性，且B.對于不具有酮酶活性的野生型生物，與野生型相比造成酮酶活性，且其中該遺傳修飾C.對于已經具有β環化酶活性的野生型生物，與野生型相比增加其β環化酶活性，且D.對于不具有β環化酶活性的野生型生物，與野生型相比造成β環化酶活性，而C中增加的β環化酶活性或D中造成的β環化酶活性源于以下β環化酶，該β環化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或對該序列替換、插入或刪除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上與SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
64.如權利要求63的遺傳修飾的生物，所述生物的起始生物可天然產生或能夠通過遺傳互補產生類胡蘿卜素。
65.如權利要求63或64的遺傳修飾的生物，選自微生物或植物。
66.如權利要求65的遺傳修飾的生物，其中微生物選自細菌、酵母、藻類或真菌。
67.如權利要求66的遺傳修飾的生物，其中微生物選自埃希氏桿菌屬、歐文氏菌屬、農桿菌屬、黃桿菌屬、產堿菌屬、副球菌屬、念珠藻屬、集胞藻屬藍細菌、假絲酵母屬、酵母屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、木霉屬、阿舒囊霉屬、脈孢菌屬、布拉霉屬、須霉屬、鐮孢霉屬、紅球藻屬、三角褐指藻、團藻屬或杜氏藻屬。
68.如權利要求65的遺傳修飾的生物，其中使用的植物選自莧科、石蒜科、夾竹桃科、紫菀科、鳳仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫蘆科、十字花科、大戟屬、豆科、龍膽科、牻牛兒苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亞麻科、山梗菜屬、錦葵科、木犀科、蘭科、罌粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、報春花科、毛茛科、薔薇科、茜草科、玄參科、茄科、旱金蓮科、傘狀花科、毛蕊花科、葡萄科及紫羅蘭科。
69.如權利要求68的遺傳修飾的生物，其中使用的植物選自萬壽菊屬、萬壽菊、孔雀草、金合歡屬、烏頭屬、側金盞花屬、阿尼菊屬、耬斗菜屬、紫菀屬、黃芪屬、紫葳屬、金盞花屬、驢蹄草屬、風鈴草屬、美人蕉屬、矢車菊屬、桂竹香屬、茼蒿屬、柑桔屬、還陽參屬、番紅花屬、南瓜屬、金雀兒屬、Delonia屬、翠雀屬、石竹屬、康乃馨屬、多榔菊屬、花菱草屬、連翹屬、Fremontia屬、勛章菊屬、鉤吻屬、染料木屬、龍膽屬、老鸛草屬、非洲菊屬、路邊青屬、銀樺屬、堆心菊屬、向日葵屬、細辛屬、獨活屬、木槿屬、賽菊芋屬、金絲桃屬、黃金菊屬、鳳仙花屬、鳶尾屬、藍花楹屬、棣堂屬、毒豆屬、山黧豆屬、貓耳草屬、百合屬、亞麻屬、百脈根屬、番茄屬、珍珠菜屬、Maratia、苜蓿屬、溝酸漿屬、水仙屬、月見草屬、木犀屬、碧冬茄屬、石楠屬、酸漿屬、牧根草屬、委陵草屬、火棘屬、毛茛屬、杜鵑花屬、薔薇屬、金光菊屬、千里光屬、蠅子草屬、松香草屬、Sinapsis、花楸屬、鷹爪豆屬、黃鐘花屬、蝴蝶草屬、婆羅們參屬、金蓮花屬、旱金蓮屬、郁金香屬、款冬屬、荊豆屬、堇菜屬或百日草屬植物。
70.如權利要求63至69中任一項的遺傳修飾生物作為飼料或食品的用途。
71.如權利要求63至69中任一項的遺傳修飾生物在生產含酮類胡蘿卜素提取物或生產飼料添加劑或食品添加劑中的用途。
全文摘要
本發明涉及通過培養遺傳修飾的生物來制備酮類胡蘿卜素的方法，所述遺傳修飾的生物與野生型相比具有修飾的酮酶活性及修飾的β環化酶活性。本發明也涉及經過遺傳修飾的生物和它們作為食品和飼料的用途，以及它們在生產酮類胡蘿卜素提取物中的用途。
文檔編號A23K1/00GK1863922SQ200480029068
公開日2006年11月15日 申請日期2004年7月31日 優先權日2003年8月18日
發明者R·弗拉赫曼, C·R·朔普費爾, K·赫伯斯, I·孔策, M·紹爾, M·克勒布薩特爾, T·盧克, D·弗斯特, A－M·皮菲弗爾 申請人:太陽基因有限公司