專利名稱：草坪草生物技術育種平臺的制作方法
技術領域：
本發明涉及草坪草生物技術育種與常規育種手段相結合從而實現快速高效育種的一套技術平臺。
背景技術：
草產業在我國是“朝陽產業”，起步晚但是發展迅速；而草坪業的發展是草業的一個重要方面，在城市綠化、環境建設與運動場草坪建設中起著重要的作用。我國的草業育種工作遠遠落后于國外發達國家；草坪所需的草種基本上都是依賴于進口，國家每年為此花費大量外匯。在國外，諸如美國、新西蘭、荷蘭等，將草坪業的發展與草坪草育種緊密地聯系起來，其育種手段以傳統育種為基礎，將新發展的生物技術應用于其中，以求獲得期望的優良草坪草單倍體植株和具有特定外源目的基因的栽培品系，因而每年都能為世界各地提供一批優良的草坪草新品種或品系。
我國野生草坪草種質資源豐富，草種的抗逆性、抗病力在我國的氣候條件下明顯優于國外品種。在草坪草育種工作方面，我國的李俊龍等對多花黑麥草和葦狀羊茅進行屬間雜交，獲得屬間雜種，并提出利用葦狀羊茅的抗熱性能改變多花黑麥草的抗旱、耐熱性能的可能性。張新全等進行坪用黑麥草‘Derby’和高羊茅‘Houndog’的屬間雜交，未經胚培養就獲得雜種，并從染色體配對表明，‘Derby’和‘Houndog’染色體間存在一定程度的親緣關系，這進一步證明對高羊茅和黑麥草的屬間雜交改良是完全可行的。同時，新發展的組培技術和體細胞融合技術也為草坪草育種提供了另一可能成功的途徑。陳文品等將葦狀羊茅12日齡幼胚接種到MS+3mg/L 2，4-D培養基上，28d后形成愈傷組織，并在這些愈傷組織中成功地誘導出一塊能分化長成具幼葉和根毛的植株。支月娥等以高羊茅為對象研究其組織培養條件，結果發現，以MS附帶一定濃度的BA和2，4-D的培養基對高羊茅愈傷組織有很高的誘導率。朱根發等以草地早熟禾的幼穗和胚軸為外植體誘導和分化愈傷組織，發現用幼穗作外植體的適宜長度為0.5～1.0cm，適宜的2，4-D濃度為1mg/L以下；培養基中添加1.5mg/L生物素或將KH2PO4濃度提高到400mg/L，可能對草地早熟禾胚性愈傷組織的誘導和篩選有一定作用。馬忠華等以早熟禾種子成熟胚為外植體，進行愈傷組織誘導和分化，發現3mg/L和0.1mg/L 2，4-D是早熟禾誘導愈傷組織和分化愈傷組織成苗的最佳濃度組合。Kuo等用含1～5mg/L 2，4-D MS基本培養基誘導鈍葉草，用0.25mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT的MS培養基分化鈍葉草，14h/10h的光周期，分化率為33％，最后在1/2MS無激素培養基中分化長根情況良好。Lee Hyoshin等利用鴨茅屬的雞腳草(Dactylis glomerata)的成熟胚誘導培養出愈傷組織并分化得到再生植株。Chaudhury等發現，用0.044mmol/L的6-BA對雜交狗牙根“Tifgreen”(Cynodon dactylon×Cynodon transvaalensis)和一個普通種狗牙根“Savannah”(Cynodon dactylon)的幼花序作外植體，誘導出致密、結節狀胚胎發生結構，然后再分化效果甚佳。
以上這些實驗說明了草坪草愈傷組織可由種子、幼穗、幼花序等誘導產生，但是產生率很低。本發明正是針對生物技術育種中愈傷組織材料供應的緊缺而提出的以懸浮細胞系與體細胞胚體系的建立來確保優良愈傷細胞與愈傷組織的供應。同時，應用懸浮細胞系進行育種與篩選，避免了在其他受體的誘導育種、輻射育種、基因工程育種中嵌合體的存在。
發明內容
通過草坪草種子、幼穗、莖尖或根尖、幼花序誘導的愈傷組織細胞進行培養獲得草坪草懸浮細胞體系。在懸浮細胞體系的基礎上進一步誘導培養草坪草體細胞胚，建立草坪草體細胞胚培養體系。本發明建立懸浮細胞系的目的是可以快速獲得來源于同一細胞的眾多克隆，為快速育種提供充足的遺傳背景一致的材料。所有育種操作方式即可以此懸浮細胞系或體細胞胚為受體材料。具體可用育種手段分別如下1.誘導育種利用懸浮細胞系和體細胞胚的高變異特性，通過對懸浮細胞系或體細胞胚施加相應的誘導選擇壓，穩定與我們育種目標相一致的變異類型，并通過懸浮培養的高增殖速率達到擴繁的目的。
2.輻射育種將懸浮細胞或體細胞胚直接采用一定頻率與強度的射線進行照射，對照射后的細胞進行繼續培養。
3.倍性育種在懸浮細胞系中施加秋水仙素等抑制劑抑制細胞的分裂，將細胞停留在染色體加倍階段。從而獲得染色體倍性增加的細胞。
4.體細胞雜交通過纖維素酶、果膠酶等消化去除細胞壁，得到原生質體，進行原生質體培養和細胞融合得到雜交細胞。再經過細胞壁再生形成懸浮細胞系。
5.基因工程通過導入外源基因獲得遺傳性狀改良的新細胞系。
通過草坪草懸浮細胞系或體細胞胚體系的分化培養，獲得再生小植株或小胚芽，再進一步固定培養，得到再生植株。
具體實施例方式
1.結縷草成熟胚愈傷組織的誘導及改造種子置于離心管中，加入1-2滴表面活性劑吐溫，然后加次氯酸鈉至離心管體積的四分之三左右，放置在90-1雙向磁力攪拌器上攪拌1小時，用無菌水沖洗3-5次，置于4℃冰箱中放置2-3天，每天及時更換無菌水。接種前再用次氯酸鈉消毒20分鐘，然后用無菌水沖洗3-5次，以備接種。
消毒處理過的種子接種在MS2培養基上，28℃黑暗培養，接種10天后進行拔芽。接種4周后對誘導出的愈傷進行繼代，此時愈傷多為水狀，不適合挑選。將其接種到篩選培養基，培養兩個月以后，愈傷生長狀態有所改善，但此時愈傷仍多為非胚性愈傷，對其進行分塊，繼代。培養三個月，進行愈傷挑選。此時的愈傷組織可分為三種I為質地堅硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織，即通常所說的胚性愈傷組織。II為質地疏松、易分散、不分泌黏液的顆粒狀胚性愈傷組織。III為柔軟、水漬、形狀不規則、顏色淡白的非胚性愈傷組織。棄掉愈傷III，保留愈傷I和II繼續培養，II型愈傷為適合懸浮培養的愈傷。對I型愈傷繼續進行改良，縮短繼代周期，每20天左右繼代一次，將其逐漸改良為II型愈傷。
將II型愈傷接種于MS2液體培養基中。置于轉速為90-110r/min的全溫震蕩培養箱(型號為HZQ-F)中，黑暗條件下振蕩培養，溫度控制在27℃左右。進行懸浮培養每3-4天換一次培養液。每次繼代時條件培養基與新鮮培養基的比例為1∶2。待培養1月左右，每5-6天繼代一次，此時對條件培養基與新鮮培養基比例沒有特別要求。
2.體細胞胚的誘導在懸浮體系建立的基礎上，在繼代過程中調整培養基配方，基本上用MS2液體培養基作為主導培養基，在其中每月用MS2+BA0.1進行1-2次穿插培養，提高細胞分裂能力，保持其胚性。懸浮物顏色淡黃、培養液較澄清、愈傷為顆粒狀且大小均勻。采用固體預培養和直接再生分化的途徑來誘導愈傷分化。并調整瓊脂濃度、培養基中大量元素的含量、蔗糖的濃度等來改變滲透勢，讓其盡快適應從液體到固體的環境轉變，提高再生頻率。同時在MS基本再生培養基的基礎上添加不同的細胞分裂素來觀察其對再生的影響，在此基礎上確立最佳分化、再生培養基。
隨著懸浮繼代時間的延長，在繼代過程中用加細胞分裂素的液體培養基進行繼代，如(MS2+BA0.1，MS2+KT0.2)調整培養體系的生長狀態，并在一定程度上加強了其細胞同步化，促進了細胞再生。體系中的懸浮物逐漸由原來松散的大顆粒變成顆粒狀的小塊愈傷，大小均一，顏色淡黃，此時狀態為適合再生。此種狀態下的體細胞胚性較高。
權利要求
1.草坪草生物技術育種平臺，包括以下技術體系(1)愈傷組織的誘導；(2)懸浮細胞體系的建立；(3)體細胞胚體系的建立；(4)胚性細胞的芽再生誘導；(5)再生芽的生長與分化培養；(6)再生植株的生根培養；(7)植物輻射育種、誘導育種、倍性育種與基因工程育種。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于本育種平臺應用于草坪草，草坪草是指能夠形成草皮或草坪的禾本科植物。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，愈傷組織的誘導由種子、幼穗、根尖或莖尖、幼葉經脫分化誘導培養產生。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，懸浮細胞體系由經脫分化產生的愈傷組織經過液體振蕩培養或過篩后振蕩培養產生。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，體細胞胚由懸浮細胞經過誘導培養產生；
6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，再生芽由體細胞胚經過進一步的分化產生；
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，再生芽的生長與分化是進行快速繁殖與壯苗形成小植株的過程。。
8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，再生植株經過誘導可以形成自己的根系。
9.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，輻射育種、誘導育種、倍性育種與基因工程育種手段可以應用于本平臺的懸浮細胞體系或體細胞胚體系，從而大大提高育種效率。
全文摘要
本發明涉及草坪草生物技術育種與常規育種手段相結合從而實現快速高效育種的一套技術平臺。本發明通過建立草坪草懸浮細胞體系來解決禾本科植物愈傷組織再生困難，生物技術育種中受體材料不足或受體遺傳背景不一致的問題。通過草坪草種子、幼穗、幼花序、幼根等誘導愈傷，獲得可懸浮培養的細胞材料，并誘導形成體細胞胚及再生植株。通過懸浮培養的簡并操作獲得大量生物技術育種材料；結合誘導育種、輻射育種、倍性育種、細胞雜交、基因工程育種等手段，并利用其高變異性，大大加快育種速率。本平臺應用于草坪草育種，可與常規育種手段以及現代生物技術育種手段相結合，推動草坪草育種進度。
文檔編號A01G1/00GK1663347SQ20051006787
公開日2005年9月7日 申請日期2005年4月29日 優先權日2005年4月29日
發明者曾會明, 韓烈保, 方文娟 申請人:北京林業大學, 韓烈保, 曾會明