專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌及其菌劑的應用，屬于一種廣譜生防、促 生菌劑。
背景技術：
半個多世紀以來，化學農藥防治病蟲害對農業生產起了十分重要的作用。 但是，隨著化學農藥的長期和大量使用帶來的農藥殘留、環境污染、病蟲的 抗藥性等問題的出現，化學農藥的安全性引起了社會的普遍關注，生物防治 越來越受到人們的重視。生物防治具有對人畜安全，無毒害，不污染環境等 優點，逐漸成為植物病蟲害防治的重要措施之一。在植物病蟲害生物防治中，
尤以蘇云金芽孢桿菌(Bt)防治鱗翅目害蟲最為成功。目前，開發利用生物 殺菌劑防治農作物病害已成為生防領域的研究熱點。在該領域，具有防病效 果的微生物包括芽孢桿菌、木霉、放線菌等，其中以枯草芽孢桿菌的研究 開發最為活躍，在微生物殺菌劑市場中備受矚目。枯草芽孢桿菌是一種在自 然界廣泛存在的微生物，革蘭氏陽性，產生耐熱、抗逆的芽孢，在芽孢形成 初期分泌各種抗菌物質，對病原真菌有特異性的防治作用，具有顯著的生防 潛力。枯草芽孢桿菌具生長快、營養簡單，有利于生防菌劑的生產、劑型加 工及在環境中的存活、定殖與繁殖，而且批量生產工藝簡單，成本也較低， 施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物。目前已明確的枯草芽孢桿 菌作為生物殺菌劑的抑菌機制有以下幾個方面 一是營養和空間位點的競爭; 二是分泌抗菌物質。目前已確定來自枯草芽孢桿菌的抗菌物質有低分子抗菌 肽，有環狀肽或環狀脂肽，也有些為線狀肽等，這些物質能使病原真菌菌絲 發生斷裂、解體、細胞質消解等現象；三是促進植物生長，增強植物的誘導 抗病性。盡管很多枯草芽孢桿菌生防制劑已被證實具有防治作用，但僅有少 數幾種應用于生產，大部分仍處于研究和探索階段。
發明內容
本發明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌菌株以及該菌株的干粉菌劑在 農業病害防治、水果保鮮等領域中的應用。 本發明的目的是通過以下方式實現的
本發明人從田間玉米病葉片上分離到一株對玉米小斑病菌C小種有拮抗 作用的細菌菌株，經鑒定屬于典型的枯草芽孢桿菌(J5 "7/m s"^/fc)，但與
其它枯草芽孢桿菌相比其具有廣譜抗病原真菌活性，同時其干粉菌劑對鮮桃、 葡萄等水果保鮮效果較好，用于黃瓜、番茄、等大棚蔬菜的生產不僅有抗病 效果，而且又有促生作用。為了證明該菌株的廣譜抗病原真菌活性，發明人
做了以下工作
一、枯草芽孢桿菌CGMCCNo.l982菌株的鑒定、誘變及拮抗機理
1、 菌株的形態
顯微鏡下觀察發現，該菌株菌體桿狀，產生芽孢，革蘭氏反應為陽性。 在TSA培養基上菌落呈淺黃色，近圓形，表面干燥、有褶皺，不透明。
2、 菌株的生理生化特征
生理生化實驗鑒定表明，該菌株為好氧菌，接觸酶陽性，V-P實驗陽性， 能產生淀粉酶，對鹽有一定的耐受性；不能利用丙二酸鹽；不產生卵磷脂酶。
3、 菌株16SrDNA序列的測定
利用PCR技術擴增該菌株的16S rDNA序列，獲1514 bp全長片段。將 測序結果與GeneBank中已知的16S rDNA進行同源性比較，發現與fi"d〃附 s"M//5 (登錄號AY887082)的同源性最高，為99%。
根據菌體革蘭氏染色、菌落形態特征的觀察、生理生化測試及16SrDNA
序列分析結果，該菌株和枯草芽孢桿菌相吻合，因此將其鑒定為枯草芽孢桿 菌(5fl"7/ws )。
4、 菌株的復合誘變及抗菌活性提高
采用紫外線和氯化鋰對菌株進行復合誘變處理，獲得了遺傳性狀穩定的 誘變菌株，其對致病真菌玉米小斑病菌的拮抗活性比出發菌株提高了66.2%。
5、 菌株拮抗物質的理化特性分析
將菌株接種于LB液體培養基，3(TC振蕩培養48h，用高速離心機12， 000 r/min離心5 min去菌體，上清液加入30 %飽和度的硫酸銨，4 'C靜置過
夜后，12， 000 r/min離心25 min，取上清液，加入硫酸銨使達到60 %飽和度， 4 T:靜置過夜后，12， 000 r/min離心25 min，得到具拮抗活性的蛋白性質粗提 物。
對拮抗物的理化特性分析表明，菌株產生的拮抗物質能耐高溫(100'C， lOmiii)，抑菌活性pH值范圍為5.0 9.0，對紫外線、胰蛋白酶部分敏感， 對蛋白酶K、氯仿敏感，說明該拮抗蛋白穩定性較好。
6、菌株拮抗物質的拮抗機理
以玉米小斑病菌(說>>/ /^ m^^W作為指示菌，對菌株產生的拮抗物質的 作用機制進行了初步研究，結果表明拮抗物質可使玉米小斑病菌孢子不萌 發或萌發異常；菌絲畸形，頂端及中部膨大、扭曲，細胞質分布不均勻。 二、枯草芽孢桿菌菌株CGMCC No.1982干粉菌劑的制備
1、 液體發酵培養
(1) 菌種活化采用的培養基含胰蛋白胨，大豆蛋白胨，NaCI ，水。 將保存的甘油菌種接到活化培養基固體斜面后，34'C培養48h。
(2) 種子培養采用的培養基含酵母膏，葡萄糖，CaC03，水。 將活化的斜面菌種用無菌水沖洗，制成菌懸液，按下列條件接到種子培
養基中培養，培養溫度35'C，搖瓶裝量12%,接種量3%，初始pH值7.2。
(3) 菌株補料分批發酵工藝 發酵培養基含葡萄糖，酵母膏，CaC03。 流加培養基含葡萄糖，酵母膏，制成混合液一起流加； 流加時間發酵8h后開始；發酵時間34±2 h; 發酵液芽孢濃度(3.41±0.151) xl09cfu/mL。
2、 菌體的制備
發酵得到的發酵液12000 r/min離心20min，棄上清，菌體加入無菌水懸 浮混勻，再12000 r/min離心15 min，棄上清得菌體。
3、 干粉菌劑的制備
菌體稱重后，稱等重量的無水CaC03， CaC03緩慢加入濕菌體中，邊加 邊攪拌，直至均勻。于真空干燥箱中5(TC烘干30min至粉末狀。干粉菌劑 中活芽孢數為2.109士(U66)xl011 cfu/g。
三、枯草芽孢桿菌CGMCC No.l982干粉菌劑在農業病害防治、水果保 鮮等領域的應用
本發明用于農業病害防治、水果保鮮的枯草芽孢桿菌< "7//附s"Z^7W 菌株CGMCC No.l982干粉菌劑的組成為濕菌體與無水碳酸鈣的質量比為 1: 1,菌劑中的活芽孢數含量為200 500億/克。
上述干粉菌劑還可以制備成干粉水溶液(菌懸液)，制備方法是稱取0.1 g 干粉菌劑溶于100mL水中，或干粉菌劑與水的質量體積比為l: 1000，攪拌 均勻得菌懸液，菌懸液活芽孢數為1.0xi()Scfu/mL。 (1.0 xl08cfu/mL)o
本發明取得的積極效果是本發明的菌株CGMCC No. 1982可用于防治 由小麥赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黃瓜炭疽病菌、大蒜菌核 病菌、辣椒炭疽病菌桃等引起的農作物、蔬菜等病害；還可應用于桃、蘋果、 葡萄、梨等水果保鮮領域。經干粉水溶液處理后的水稻、玉米葉片，均不能 出現相應的病斑；用粉劑拌種、粉劑根埋或菌懸液噴灑方式處理的黃瓜種子 或幼苗葉片，不僅可防止黃瓜炭疽病的發生，而且表現出良好的促生作用， 有利于綠色、無公害蔬菜的生產。經菌懸液處理后的鮮桃，爛果率明顯降低， 貯存期延長。本發明的干粉菌劑在農業病害防治、水果保鮮等領域展現出較 好的應用前景。本發明的枯草芽孢桿菌粉劑中芽孢含量明顯高于市場上現有 的產品，而且其制備工藝簡單，適合工業化生產。
該菌株于2007年3月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(CGMCC)，菌種保藏編號為CGMCCNo. 1982。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明。 實施例1枯草芽孢桿菌CGMCC No. 1982對農業生產主要病原菌的拮抗作 用
(1)拮抗菌的培養把菌株CGMCC No. 1982試管菌種從4 "C冰箱中 取出，放置2h后，在LB平板上劃線接種，并于3(TC培養2d。
(2)病原真菌的培養供試病原真菌的保存種接于PDA平板上，28 °C 培養使其長滿平皿。供試病原真菌包括玉米小斑病菌OB,j^/"〃's附"j;^s)、水
稻稻瘟病菌(Af"g"fl/ w幼e gr/sefl)、小麥赤霉病菌CFMS"n'M附gm附,Vie"rwwi)、 棉花枯萎病菌(jp"s"f/m附，s/w"附f.sp.Kw/"/e"w附)、辣椒炭疽病菌
(CW/"幽'c/w附cfl拜'".)、辣椒疫霉病菌考s/c/)、黃瓜炭疽病 菌/fltge"a""附)、大蒜菌核病菌(5^/"< //'"/" 棉花黃萎病 菌(P^W/"7//m/w d/i緒fle)、 煙草赤星病菌(J/te/TiwVi "/te/7i她)、杉t灰霉
(jfiTw附/co/fl 7>做柳)等。
(3) 拮抗譜的測定待病原真菌菌絲長滿PDA平皿時，用滅菌的打孔器 (①-6 mm)在平板上打孔，然后用接種針把菌絲塊放入冷卻的PDA平板中央， 同時在距菌落邊緣lcm處用接種環點接菌株A，然后觀察生長情況，記錄拮 抗菌落半徑(R0，抑菌帶寬度(R2)，以R2/Ri表示抑菌活性強弱。
(4) 結果采用平板對峙法測定了菌株CGMCC No. 1982對農業生產 主要致病真菌的拮抗作用，結果表明，該菌株對上述病原真菌均有拮抗作用， 說明該菌株具有廣譜抗病原真菌特性。其中以對黃瓜炭疽病菌、大蒜菌核病 菌、小麥赤霉病菌、煙草赤星病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黃瓜炭 疽病菌拮抗活性較強，展現出其在農業生產病害生物防治方面具很好的應用 前景。
實施例2枯草芽孢桿菌菌株CGMCC No. 1982的菌懸液對稻瘟病的防效
(1) 菌種活化TSA培養基胰蛋白胨15g,大豆蛋白胨5g, NaC15g， 水1000 mL;
將保存的甘油菌種CGMCC No. 1982接種到TSA固體斜面培養基后， 34。C培養48 h;
(2) 種子培養將活化的斜面菌種用無菌水沖洗后，接種到裝有40mL TSA液體培養基的三角瓶中，接種量1%。 160r/min， 34X:振蕩培養20h;
(3) 發酵培養
發酵培養基葡萄糖1%，酵母膏1%， CaC03l%, pH7.5; 流加培養基葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖和酵母膏制成混合液 800mL;
將種子液以3%的接種量接種到發酵培養基中進行發酵培養，采用20L 攪拌式發酵罐進行補料分批發酵，裝量為12 L，發酵過程中通過流加Na2C03
調節pH值，選用食用豆油作為消泡劑，從8.5h后開始流加葡萄糖和酵母膏 的混合液，發酵時間為36土2h;
發酵完成活菌數達1.5xl09cfu/mL，芽孢數達1.29xl09cfu/mL。
(4) 濕菌體的制備
將用發酵罐發酵培養所得的發酵液12000 r/min離心20min,棄上清，菌 體加入無菌水懸浮混勻，再12000 r/min離心15 min,棄上清得濕菌體。
(5) 干粉菌劑的制備
菌體稱重后，稱等重量的無水CaC03。 CaC03緩慢加入濕菌體中，邊加 邊攪拌，直至均勻。于真空干燥箱中5(TC烘干30min至粉末狀，干粉菌劑 中活芽孢數為2.109土(U66)xl011 cfu/g。
(6) 干粉水溶液(菌懸液)制備
制備方法是稱取0.1 g干粉菌劑溶于100 mL水中，攪拌均勻得菌懸液(1.0 xl08cfu/mL)。
(7) 試驗方法
分別取水稻(麗江新團黑谷)葉片10片，分成兩組。 一組做對照，以清 水處理后，滴加稻瘟病菌孢子懸液(濃度為3xl04 cfu/mL) —滴，每個葉片 接種3處；另一組用菌懸液處理，同樣條件下接種稻瘟病菌孢子懸液。隨后 培養皿26'C保濕培養(光照12h，黑暗12h)， 48h后去除孢子懸液，72h后 觀察統計葉片的發病情況。
(8) 試驗結果
結果表明，經菌懸液處理后的水稻葉片多不發病或只是輕微發病，病斑 直徑《lmm2，而清水處理后的葉片均發病，病斑直徑平均為5X2 mm2，且 病斑具有壞死中心。
實施例3枯草芽孢桿菌菌株CGMCC No. 1982的菌懸液對玉米小斑病的防 效
采用與實施例1基本相同的方法檢測了該菌株菌懸液對玉米小斑病菌的 防治效果。結果表明，經菌懸液處理后的玉米(B73C)葉片均未發病；而清 水處理后的玉米葉片均發病，病斑直徑平均為2X2mm2。 實施例4枯草芽孢桿菌菌株干粉水溶液(菌懸液)對黃瓜種子促芽及生長試 驗
(1) 菌懸液的制備同實施例l。
(2) 黃瓜種子處理
用菌懸液浸泡黃瓜種子，25'C浸泡24h。然后將種子轉移至鋪有含菌懸 液的濾紙培養皿中，25'C催芽保濕24h。以清水浸泡種子和清水催芽保濕為 對照。每皿20顆種子，每個處理三次重復。觀察菌懸液對黃瓜出芽和芽生 長的影響。
將菌懸液浸泡催芽后的種子播種于裝有無菌的營養土和蛭石的花盆中。 以清水浸泡處理種子做對照。每處理6盆，重復3次。每盆播種5粒，置于 培養室中，光暗時間12h/12h條件下培養。出苗后每盆留苗4株。待苗的第 一片真葉展開后，統計苗成活率、株高、株重，對結果進行統計分析。 (3)結果
菌懸液對黃瓜種子的發芽無抑制作用，處理組出芽率為97.91%,對照為 97.82%,處理和對照沒有顯著差異；出芽后菌懸液對芽表現出促生長作用， 催芽2d后生菌懸液處理種子平均芽長為1.66 cm,比對照高出0.27 cm，促芽 生長率達19.42%。
經浸種處理的黃瓜苗的平均株高、株重和苗成活率都顯著高于清水處理 (對照)，說明菌懸液處理對黃瓜苗的生長具有促生作用；浸種處理的黃瓜苗 長勢良好，苗整齊粗壯，而對照組同等條件下黃瓜苗細弱，整體長勢較差。 實施例5枯草芽孢桿菌菌株干粉菌劑拌種對盆栽黃瓜苗的促生作用
(1) 干粉菌劑的制備同實施例l。
(2) 拌種處理及播種 將清水浸泡和催芽的種子與干粉菌劑按照重量比100:1拌種后，播種于
裝有無菌的營養土和蛭石的花盆中。以清水浸泡未拌種處理種子做對照。每 處理6盆，重復3次。每盆播種5粒，置于培養室中，光暗時間12h/12h條 件下培養。出苗后每盆留苗4株。待苗的第一片真葉展幵后，統計苗成活率、 株高、株重，對結果進行統計分析。
(3) 結果
經拌種處理的黃瓜苗的平均株高、株重和苗成活率都顯著高于清水處
理(對照)，說明菌劑拌種對黃瓜苗的生長具有促生作用；經拌種處理的黃瓜 苗長勢良好，苗整齊粗壯，而對照組同等條件下黃瓜苗矮小，整體長勢較差。 實施例6枯草芽孢桿菌菌懸液對離體黃瓜葉片黃瓜炭疽病發病的影響
(1) 浸種與催芽處理；拌種處理及播種同上。
(2) 葉面噴灑處理待黃瓜葉苗第一片真葉完全展開后，對清水浸種的 苗進行菌懸液葉面噴灑處理，每棵噴灑菌懸液10mL。
(3) 接種實驗
分別剪取經菌懸液浸種、干粉菌劑拌種、菌懸液葉面噴灑處理苗的第三 片真葉，以清水未處理葉片做對照，置于濾紙保濕的培養皿中。每種葉片中 央各滴加黃瓜炭疽病菌孢子懸液20 jtL (濃度為2xl05 cfu/mL)，蓋上皿蓋置 于光照培養箱中25 'C保濕培養(光照12h，黑暗12h)， 6 d后統計發病情況 和病斑的大小。每皿放置一片葉子，每處理30個重復。
(4) 黃瓜炭疽病調查分級標準 0級葉片無病斑
l級病斑占整個葉片面積的5%以下 3級病斑占整個葉片面積的6% 10% 5級病斑占整個葉片面積的11% 25% 7級病斑占整個葉片面積的26% 50% 9級病斑占整個葉片面積的50%以上
病情指數-i:(各級發病數X該級代表數)/ (總數X最高級代表數) 防效％=[(對照病情指數一處理病情指數)/對照病情指數1 X 100%
(5) 結果
統計比較離體黃瓜葉片病斑直徑，發現拌種處理的黃瓜苗的離體葉片對 黃瓜炭疽病的防效較高，與清水處理相比，防效可達77.92%。清水處理離體 葉片保濕培養6 d后，病菌在葉片上生長形成明顯的水浸斑；而拌種處理葉 片、噴灑處理葉片、浸種處理葉片經保濕培養6 d后，未見水浸斑，或只在 葉片中央有很小面積的水浸斑，防病效果較好。 實施例7枯草芽孢桿菌菌懸液對盆栽黃瓜苗黃瓜炭疽病的防治 (1)菌懸液的制備同實施例l。(2) 浸種與催芽處理、拌種處理及播種同上。
(3) 黃瓜炭疽病菌孢子懸液制備同上。
(4) 黃瓜苗處理
待黃瓜苗第一片真葉完全展開，菌懸液浸種和干粉拌種的苗直接接種黃 瓜炭疽病菌孢子；對清水浸種的苗分別進行菌懸液澆苗處理和葉面噴灑理， 每盆澆菌懸劑40mL,每棵噴灑菌懸劑10mL。澆苗或噴灑72 h后接種病菌 孢子。每株噴灑接種黃瓜炭疽孢子懸液5mL， 25'C保濕培養(光照12h，黑 暗12h)。每處理6盆，重復3次。以清水處理接種和不接種病菌為對照，分 別于接種后7d、 14d調查發病率及發病程度。
(5) 黃瓜炭疽病調查分級標準同上
(6) 結果
三種處理方式在接種病菌7d和14d后有較好的防效。浸種處理7d后的 防效為84.86%,澆灌處理14d的防效達49.69%。對照組中大部分黃瓜苗發 病，黃瓜葉片因發病干枯；而經生防菌處理過的黃瓜苗只有少部分葉片有發 病癥狀。
實施例8枯草芽孢桿菌干粉水溶液(菌懸液)對鮮桃果實灰霉病的防治
(1) 菌懸液的制備 同實施例l。
(2) 病菌孢子懸液的制備
將長滿桃灰霉的PDA平板中加入含0.01%吐溫-80的無菌水，將孢子洗 下，經四層紗布過濾得孢子懸液，血球計數板計數，孢子濃度為lxK)4 cfu/mL。
(3) 剌傷接種
選擇健壯、無機械損傷、新鮮、大小一致的桃子，先用2"/。的NaC10消 毒，然后用無菌水沖洗干凈，晾干后在每個桃子上用滅菌的接種針剌一個大 小為5x3 mm，深度為3 mm的孔，孔中加入菌懸液20 ^L， 2 h后，每孔中 再加入桃灰霉孢子20nL。以剌傷后接種無菌水，2h后再接種桃灰霉孢子處 理為對照。每處理9個果，各三次重復。每9個果放入一個塑料筐中，25 °C 儲藏。每天統計桃發病情況。
發病率％=(發病水果數一該處理的總水果數)X100%
防效％=[(對照發病率一處理發病率)/對照發病率IX100。/0 (4)結果
接種病菌4 d后菌懸液仍能顯著抑制病菌在刺傷處的蔓延生長；而清水 處理的對照，所有桃子在剌傷接種的部位已經長出一個較大的病斑，且隨時 間的延長病斑直徑繼續增大。處理組6 d后生防菌株的菌懸液仍能抑制病菌 生長，沒有灰霉病斑長出。菌懸液能顯著降低灰霉病發病率，病菌接種4 d 后防效達卯％以上，6d后的防效達到40。/。。 實施例9枯草芽孢桿菌菌懸液對小批量鮮桃貯藏保鮮效果試驗
(1) 菌懸液的制備 制備方法同實施例l。
(2) 噴灑接種
選擇健壯、無機械損傷、新鮮、大小一致的桃子，分別噴灑菌懸液，晾 干后，單果用紙包裹放入紙箱中25'C儲藏。每處理9個果實，三次重復。以 不做任何處理為對照。隨時觀察發病情況，待有一部分果實發病時，統計發 病情況，計算發病指數。
(3) 病果分級標準
0級無病斑 l級病斑直徑Sl.0cm
2級病斑直徑1.1—2.0 cm 3級病斑直徑2.1—3.0 cm 4級病斑直徑3.1—4.0cm 5級病斑直徑^4.1 cm 病情指數-i:(各級腐爛數X該級代表數)/ (總數X最高級代表數) 防效％=[(對照病情指數一處理病情指數)/對照病情指數]X 100%
(4) 結果
菌懸液對桃儲藏有明顯的保鮮、防病效果。3 3后的防效為92.8%， 6 d 后防效為40.74%。
權利要求
1、 一種枯草芽孢桿菌(5""7""s s^說/s)菌株，其特征在于在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.1982。
2、 如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株CGMCC No.1982的應用，其 特征在于由該菌體制備的菌劑作為抗農作物病害、蔬菜病害的生防、促生劑 及水果保鮮劑。
3、 按權利要求2所述的枯草芽孢桿菌菌株CGMCC No.1982的應用，其 特征在于所述菌劑為干粉菌劑，其組成為濕菌體與碳酸鈣的質量比為1: 1， 菌劑的活芽孢數含量為200 500億/克。
4、 按權利要求2所述的枯草芽孢桿菌菌株CGMCC No.1982的應用，其 特征在于所說的菌劑為干粉水溶液，其組成為干粉菌劑與水的質量體積比為 1: 1000,菌懸液活芽孢數為1.0xi()8cfu/mL。
全文摘要
本發明公開了一種枯草芽孢桿菌(Bacillius subtilis)菌株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的菌種保藏編號為CGMCCNo.1982。該菌株制成的干粉菌劑可用于防治由小麥赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黃瓜炭疽病菌、大蒜菌核病菌、黃瓜炭疽病菌等引起的農作物、蔬菜等病害；還可應用于桃、蘋果、葡萄、梨等水果保鮮領域。經菌懸液處理后的水稻、玉米葉片，均不能出現相應的病斑；用粉劑拌種、粉劑根埋或菌懸液噴灑方式處理后的黃瓜種子或幼苗葉片，不僅可防止黃瓜炭疽病的發生，而且表現出良好的促生作用，有利于綠色、無公害蔬菜的生產。經菌懸液處理后的鮮桃，爛果率明顯降低，貯存期延長。該菌劑制備工藝簡單，適合工業化生產。
文檔編號A01N63/02GK101121924SQ20071006250
公開日2008年2月13日 申請日期2007年8月2日 優先權日2007年8月2日
發明者兵 彭, 成麗霞, 李小俊, 王立安, 宇 賈 申請人:河北師范大學