專利名稱：石莼目綠藻無性繁殖系育苗方法
技術領域：
本發明涉及一種通過海藻組織培養大量生產石莼目綠藻無性繁殖系幼苗的 方法。
背景技術：
石莼目藻類包括袋礁膜、滸苔、孔石莼等經濟種類，藻體內含有豐富的豐富 的蛋白質及各種氨基酸，維生素，膳食纖維、微量元素等，具有降血壓、抗腫 瘤、治療便秘等功效，深受日本及東南亞一些國家歡迎。石莼目藻體結構簡單， 一層或兩層細胞，外形為葉狀體或管狀體，該目藻類適應性強，廣溫廣鹽，尤 其適宜在河口等富營養化海區生長。因此，開展石莼目海藻的栽培，不僅可以 帶來可觀的經濟效益，而且具有良好的生態效益。
我國目前還沒有經濟綠藻進入規模化養殖階段，日本已經開展了礁膜和滸苔 的人工育苗和規模化養殖，其苗種生產是利用綠藻的有性生殖特性進行的，然 而其存在生產周期長，供苗無保證的不足。
目前，關于綠藻酶解育苗的研究取得了一些進展，申請號為200510050824.0 的中國專利申請公開了一種經濟綠藻育苗方法，但酶解育苗過程中使用昂貴的 酶液，在大規模苗種生產中應用，成本過高；而且酶解的材料為野生或養殖的 混雜藻體，遺傳性狀不穩定，不利于良種化養殖。
發明內容
針對上述問題，本發明的目的是建立一種無性繁殖系苗種生產方法，可用于 石莼目綠藻的規模化生產，解決育苗生產周期長、受季節限制、遺傳性狀不穩 定、生產成本過高等問題。
本發明的技術方案是將野生藻體離體分割到閾值以下(小于1 5mm)的 片段，進行組織培養，待片段細胞再生出有假根的幼體，將假根及幼體從固著 基上剝離下來，粉碎后充氣培養，誘導假根及幼體組織進行孤雌生殖，釋放不 動細胞并萌發形成新的植株，達到無性繁殖系的擴增。
本發明包括以下步驟1)采集性狀較好的未成熟的野生石莼目綠藻藻體，清除附生動物和雜藻后，
選擇藻體的中部偏上區域，切下后，切割成1 5mm以下的片斷；
2) 將切割完畢的片段放在PES培養基中培養，培養條件為光強55-95 umol m—2S—'，溫度20-25°C;培養時間一周左右；此時，片段上的營養細胞經過了脫 分化形成游離細胞或再分化形成游動細胞(兩根鞭毛)的過程，再生形成新的 幼苗，幼苗先形成初生假根，再進一步形成盤狀的次生假根；
3) 將假根從附著基上剝離下來，充氣培養，假根上的細胞能脫落下來，每 個脫落的細胞能再生成新的能附著的幼苗，培養到一定階段，將這些幼體或假 根用粉碎機粉碎，再充氣培養，通過這種方式可以建立并大量擴增無性繁殖系； 將這些無性繁殖系噴灑到苗網上，充氣培養，48h后，幼苗附著牢固，就可以實 現人工育苗，用于規模化養殖。
所述的l)中的切割過程是通過用手術刀片切割或組織搗碎機(轉速:0-12000 轉/分)對離體組織進行切割的。
所述的1)中所述的切割成廣5mm以下的片斷是指由于片段的閾值大小與 種類和野生藻體的生長階段有關，幼體在lmm以下，未成熟的成體在5mm以下， 片段內的細胞才能出現再生。故而切割片斷的大小一般為幼體在lmm以下，未 成熟的成體在5mm以下。
所述的野生藻體為未成熟的藻體，即藻體上無有性生殖器官，最好選擇形 態特征典型的幼體。
有益效果本發明具有育苗生產周期短、不受季節限制、遺傳性狀穩定、生 產成本低的突出優點。
具體實施例方式
下面結合實例對發明進一步進行說明。 實施例l:以緣管滸苔為材料，對本發明作進一步詳細的敘述。
1. 從海區采集野生的緣管滸苔藻體，用保溫箱低溫運回實驗室，選擇健康 完整的個體，顯微鏡檢査無繁殖器官形成，用軟毛筆洗刷藻體表面，清除附著 的雜藻或動物。用消毒海水沖洗干凈。
2. 在藻體中上部選擇一定區域，將其切下，用手術刀片切或組織搗碎機粉 碎，至l-2mm (直徑)，將切好的片段置于培養皿或三角燒瓶中靜置培養，培養 液為PES培養基，培養條件為光強55-95 umol m—2 s—1，溫度20-25。C。每隔3
4天換一次培養液，大約一周左右，片段上的細胞經過脫分化或再分化過程形成 不動細胞或游動細胞，這些細胞不經兩性結合，能進一步發育形成帶有假根的 幼體，培養到一定階段，將這些幼體或假根用組織搗碎機粉碎，連同培養液放 到三角燒瓶或氣升式藻類反應器中進行充氣培養，就可以大量擴增緣管稱苔的
無性系。將這些無性系噴灑到紫菜苗網上，充氣培養，48h后，幼苗附著牢固， 就可以下海暫養。待幼苗長到2-3cm，就可以分網養殖。 實施例2:以孔石莼為材料，對本發明作進一步詳細的敘述。
1. 從自然海區采集生長旺盛，顏色碧綠的孔石莼藻體，用保溫箱低溫運回 實驗室后，在藻體中上部選擇一定大小(如2X2cm2)區域，將其切下，鏡檢無 繁殖器官，用軟毛筆洗刷藻體表面，清除雜藻，用消毒海水反復沖洗干凈。
2. 將清洗干凈的藻體片段，用刀片切至5mm以下片段，培養皿或三角燒瓶中 靜置培養，培養液為PES培養基，培養條件為光強55-95 u mol nf2 s、溫度20-22 °C。每隔3天換一次培養液，大約6d后，大部分營養細胞轉化為游動細胞釋放 出來，少量轉化為不動細胞，其中的游動細胞不經兩性細胞結合直接發育成帶 有假根的幼體，不動細胞或者發育成正常幼體或者繼續分裂成囊狀體，培養到 一定階段后，將這些帶假根的幼體從附著基質上剝離下來，用組織搗碎機粉碎， 在三角燒瓶或氣升式反應器中充氣培養，可以大量擴增孔石莼的無性繁殖系。 將這些無性系噴灑到紫菜苗網上，充氣培養，48h后，幼苗附著牢固，就可以下 海暫養。待幼苗長到2-3cm，就可以分網養殖。
實施例3:以袋礁膜為材料，對本發明作進一步詳細的敘述。
1. 從自然海區采集生長旺盛期的袋礁膜藻體，用保溫箱低溫運回實驗室 后，在藻體中上部選擇一定大小(如lXlcm2)區域，將其切下，鏡檢無繁殖器 官，用軟毛筆洗刷藻體表面，清除雜藻，用消毒海水反復沖洗干凈。
2. 將清洗干凈的藻體片段，用組織搗碎機粉碎至lmm以下，在培養皿或三 角燒瓶中靜置培養，培養液為PES培養基，培養條件為光強55-95 II mol m—2 s一、 溫度21-23r。每隔3天換一次培養液，大約一周左右，除少部分轉化為不動細 胞，形成囊狀體外，大部分營養細胞轉化為孢子囊，孢子囊釋放出游孢子，后 者進一步發育成帶有盤狀假根的幼體，培養一段時間后，將幼體及假根從附著 基質上剝離下來，在三角燒瓶或氣升式反應器中充氣培養，可以大量擴增袋礁 膜的無性繁殖系。將這些無性系噴灑到紫菜苗網上，充氣培養，48h后，幼苗附 著牢固，就可以下海暫養。待幼苗長到2-3cm，就可以分網養殖。
權利要求
1、石莼目綠藻無性繁殖系育苗方法，其特征是將野生藻體離體分割到閾值以下(小于1～5mm)的片段，進行組織培養，待片段細胞再生出有假根的幼體，將假根及幼體從固著基上剝離下來，粉碎后充氣培養，誘導假根及幼體組織進行孤雌生殖，釋放游動細胞和不動細胞，并萌發形成新的植株，達到無性繁殖系的擴增，用于苗種生產。
2、 如權利要求1所述的石莼目綠藻無性繁殖系育苗的方法，其特征在于包 括以下步驟1)采集性狀較好的未成熟的石莼目綠藻藻體，清除附生動物和雜藻后，選 擇藻體的中部偏上區域，切下后，切割成l 5mm以下的片斷；2)將切割完畢的片段放在PES培養基中培養，培養條件為光強55-95pmo1 m—2s—、溫度20-25"C;培養時間一周左右；此時，片段上的營養細胞經過了脫 分化形成不動細胞或再分化形成游動細胞(兩根鞭毛)的過程，再生形成新的 幼苗，幼苗先形成初生假根，再進一步形成盤狀的次生假根，假根上形成直立 的藻體；3)培養到一定階段，將這些幼體或假根從附著基質上剝離下來，用組織搗碎 機粉碎，再充氣培養，粉碎片段上的營養細胞或假根細胞能通過孤雌生殖的方 式，再次釋放大量的不動細胞或游動細胞，萌發形成正常的植株，通過這種方 式可以建立并大量擴增無性繁殖系；將這些無性繁殖系噴灑到苗網上，充氣培 養，48h后，幼苗附著牢固，就可以實現人工育苗。
3、 根據權利要求2所述的石莼目綠藻無性繁殖系育苗方法，其特征在于 所述的步驟1)中的切割過程是通過用手術刀片或組織搗碎機(轉速0-12000 轉/分)對離體組織進行切割的。
4、 根據權利要求2或3所述的石莼目綠藻無性繁殖系育苗方法，其特征在 于所述的步驟l)中的切割片段大小與種類及野生藻體的生長階段有關，通常 情況下，幼體在lmm以下，未成熟的葉狀體在5mm以下。
5、 根據權利要求1~4中任意一項所述的石莼目綠藻無性繁殖系育苗方法， 其特征是所述的野生藻體為未成熟的藻體，即藻體上無有性生殖器官，最好選 擇形態特征典型的幼體。
全文摘要
本發明公開了石莼目綠藻無性繁殖系育苗方法，是將野生藻體離體分割到閾值以下(通常小于1～5mm)的片段，進行組織培養，待片段細胞再生出有假根的幼體，將假根及幼體從固著基上剝離下來，粉碎后充氣培養，誘導假根及幼體組織進行孤雌生殖，釋放游動細胞或不動細胞，并萌發形成新的植株，達到無性繁殖系的擴增，用于苗種生產。本發明具有育苗生產周期短、不受季節限制、遺傳性狀穩定、生產成本低的突出優點。
文檔編號A01H4/00GK101558739SQ200910011689
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月22日 優先權日2009年5月22日
發明者寧 鞏, 邵魁雙, 閆啟侖 申請人:國家海洋環境監測中心