專利名稱：一種油茶無性系組培外植體脫毒方法
技術領域：
本發明涉及一種油茶無性系組培外植體脫毒方法，具體是提供一種通過預處理及“多步式消毒法”獲得大量油茶無性系無菌苗的方法。
背景技術：
油茶(CaaeBia 5/7/7)是山茶科( eacae)山茶屬ifamellia)中種子含油量高、具有生產價值的油用物種的總稱，是我國特有的優質木本油料樹種，與油棕、椰子和油橄欖并稱為世界四大木本油料樹種(莊瑞林，中國油茶[M]，北京中國林業出版社，1988)。我國現有油茶栽培面積4531萬畝，主要分布于南方14個省(區)，油茶種子榨取的茶油風味獨特，營養豐富，脂肪酸組成合理，不飽和脂肪酸含量高達90%，油酸含量80%以上，不含人體難以 吸收的芥酸和山俞酸，也不含會引起人體血壓增高而導致血管硬化的膽固醇，油質優于橄欖油等其它食用油，是理想的食用油(陳永忠，楊小胡，彭邵鋒，等，我國油茶良種選育研究現狀及發展策略[J]，林業科技開發，2005，19 (4):1-4)。茶油的副產品茶枯和茶殼還可以通過綜合利用提取茶皂素、磨制刨光粉和發酵高蛋白飼料等，油茶果殼可生產活性碳和提取鞣料等，所以通過深加工和綜合利用可大幅度提高油茶產品的附加值。油茶適應性廣、耐瘠薄，是南方低山、丘陵和崗地很好的經濟林樹種之一，不與糧、棉爭地，而且還具有一年種植，多年受益的特點，豐產期長達80年，在我國南方農村經濟和生態建設中占有很重要的地位(黎先勝，我國油茶資源的開發利用研究[J]，湖南科技學院學報，2005,26 (11)127-129)，發展油茶生產有利于緩解我國食用油長期依賴進ロ，供需緊張的矛盾，對提高我國國民經濟和人民生活水平具有重大意義。油茶種苗繁育主要采用播種育苗和芽苗砧嫁接法。過去油茶繁殖方法主要是播種育苗，后代分化嚴重，難以保持母株的優良性狀，一般61年始果，產量高低不一。目前油茶種苗繁育主要采用無性繁殖方式一芽苗砧嫁接法，該方法技術難度大，嫁接成活率和合格苗出圃率均較低，出圃時間長達2年，造林成活率不穩定，造林成本高，林相整齊度差，苗木繁殖系數低，難以滿足全國油茶產業發展對油茶優良無性系的需求，迫切需要研究油茶優良無性系高效組培快繁新技木。組培快繁技術是ー種廣泛用于農業、林業的無性繁殖方法，具有繁殖速度快、方法簡單、操作容易，材料消耗少，不受季節和地域限制的特點，同時子代能夠保持母株的優良遺傳特性。因此，研究油茶優良無性系組培快繁技術，對緩解油茶苗木緊張、加快油茶產業發展，緩解我國食用油緊張局面，推動農村經濟和社會主義新農村建設具有重大戰略意義。植物組織培養需經過初代、繼代、生根、移栽四個階段，得到完整植株。初代培養階段無菌材料的獲取是組培能否成功的關鍵，因植物材料表面常常帶有各種微生物，而培養基營養全面，適合微生物生長，且接種后植物組織失去了表皮的保護，抵抗力不強，所以如果滅菌不徹底的話，微生物將迅速滋生，抑制甚至殺死植物組織細胞，使前功盡棄。目前，對油茶組織培養外植體脫毒技術的研究很少，黃雅莉等研究了不同外植體消毒時間對油茶組織培養的影響，研究結果表明，HgCl2消毒6min效果最好，油茶岑軟2號與岑軟3號的成活率分別達到71%與73% (黃雅莉，張日清，馬錦林，等，油茶愈傷組織和芽誘導培養條件的篩選.經濟林研究，2010，28 (1):30-34)。劉海龍等對油茶不同外植體的滅菌條件進行了研究，研究結果表明，以油茶種子、莖段為外植體，采用酒精、升汞、高錳酸鉀3種滅菌劑，探討不同處理對外植體污染和種子萌發的影響。結果表明，油茶莖段較好的滅菌方法毛刷刷洗+75%酒精l(Tl5s+0. l%HgCl2l(Tl5min，污染率最低為24. 5% ;新萌條較好的滅菌方法75%酒精4 7s+0. l%HgCl25 6 min，污染率最低為14. 3% ;種子滅菌的條件O. 5%KMn040 24 h+75% 酒精Tl5 min+O. l%HgCl22(T40 min (不剝殼去皮)，75% 酒精 30s+0. l%HgCl2 8 min (剝殼去皮)，這2種處理污染率均較低，種子發芽率相差不大(劉海龍，陳曉明，蔡玲，油茶不同外植體滅菌條件研究，廣西林業科學，2010，39 (2) :61-63，68)。畢方鋮等用2. 5%次氯酸鈉、消毒時間20min對腋芽消毒效果最好，污染率為10%，芽的萌發誘導率為85%(畢方鋮，譚曉風，張智俊，等，油茶離體培養誘導再生植株的研究[J].經濟林研 究，2004，22 (2) :5-9)。根據現有技術表明，油茶組培外植體脫毒多采用“兩步式消毒法”，即75%こ醇5-30秒+無菌水2-3次+0. l%HgCl25-40分鐘+無菌水5_6次，采用這種方法材料保存率低，由于滅菌時間難以控制，若時間太短，滅菌不徹底，材料會因微生物滋生死亡，若滅菌時間過長，滅菌劑會對植物組織細胞產生毒害而萌發困難，導致萌芽率低。
發明內容
本發明g在克服現有技術中的不足，提供一種油茶無性系組培外植體脫毒方法。為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為
所述油茶無性系組培外植體脫毒方法，包括如下步驟
(1)將油茶無性系組培外植體在O 10°c條件下進行低溫預處理；
(2)將低溫預處理后的油茶無性系組培外植體用こ醇消毒，沖洗，然后用HgCl2處理；其中，所述的HgCl2處理是分兩次以上對油茶無性系組培外植體進行間歇性處理，HgCl2處理的總時間為4 20分鐘，HgCl2每處理一次后用水沖洗。こ醇消毒和單次HgCl2處理的操作過程是本領域的常規操作步驟和條件。例如こ醇消毒是采用體積百分比濃度75%的こ醇消毒處理，單次HgCl2處理是用質量百分比濃度O. 1%的HgCl2處理；其中的處理時間可根據不同外植體并結合本領域常識作適當調整。優選地，步驟(I)是將油茶無性系組培外植體放置于4°C恒溫箱低溫處理3-7天；步驟(2)是將低溫處理后的油茶無性系組培外植體用體積百分比濃度75%的こ醇消毒10 15秒，無菌水沖洗3 4次，然后用質量百分比濃度O. 1%的HgCl2處理2 10分鐘，無菌水沖洗3 4次，然后再用質量百分比濃度O. 1%的HgCl2處理2 10分鐘，無菌水沖洗6 8次。進ー步，本方法還包括如下步驟將經步驟(I)低溫處理后的油茶無性系組培外植體取出后進行預處理，然后在O. 1%的多菌靈溶液中浸泡2 4分鐘，流水沖洗2 4小時，然后再進行步驟(2)的處理。其中，所述的油茶無性系組培外植體為從油茶健壯植株上剪取的當年生帶芽枝條帶葉枝條或未成熟果實。所用的組培外植體可以依據現有技術中公布的方法獲得。當外植體為當年生帶芽枝條時，將經步驟(I)低溫處理的帶芽枝條取出后剪成一葉一芽的莖段，即，將葉片剪掉，保留葉柄，然后在質量百分比濃度O. 1%的多菌靈溶液中浸泡2 4分鐘，流水沖洗2 4小時，然后再進行步驟(2)的處理。其中，所述的步驟(I)低溫處理是指在4°C恒溫箱中水培。當外植體為當年生帶葉枝條時，將經步驟(I)低溫處理的帶葉枝條取出后剪取葉片，將葉片在在質量百分比濃度O. 1%的多菌靈溶液中浸泡2 4分鐘，流水沖洗2 4小時，然后再進行步驟(2)的處理。其中，所述的步驟(I)低溫處理是指在4°C恒溫箱中水培。當外植體為未成熟果實時，將經步驟(I)低溫處理的未成熟果實的種子取出，去掉外種皮，將種子用在質量百分比濃度O. 1%的多菌靈溶液中浸泡2 4分鐘，流水沖洗2 4小時，然后再進行步驟(2)的處理。上述方法中步驟(2)的處理過程在超凈工作環境下完成。與現有技術相比，本發明方法的有益效果為
本發明方法主要包括外植體預處理及“多步式消毒法”步驟，與傳統的“兩步式消毒法”不同，采用本發明的脫毒方法能使外植體污染率低于6. 7%，萌芽率達95. 5%以上。本發明方法操作簡單，污染率低，克服了傳統保存率低的技術問題。
圖I是油茶組培苗接種后的實驗結果 圖2是油茶組培苗萌芽狀態的實驗結果 圖3是油茶組培苗展葉狀態的實驗結果 圖4是油茶葉片愈傷組織誘導的試驗結果 圖5是油茶種子愈傷組織誘導的試驗結果圖。
具體實施例方式實施例I
從油茶健壯植株上剪取當年生帶芽枝條，采回后放置于4°C恒溫箱水培3天；將枝條剪成一葉一芽的莖段，用質量百分比濃度O. 1%的多菌靈溶液浸泡3分鐘，浸泡后流水沖洗2小時；在超凈工作臺上，先用體積百分比濃度75%こ醇消毒10秒，用無菌水沖洗4次，然后用質量百分比濃度O. 1%的HgCl2處理3分鐘，無菌水沖洗4次，然后再用質量百分比濃度
O.1%的HgCl2處理3分鐘，無菌水沖洗8次，污染率為6. 7%，萌芽率為100%。具體操作如下
(1)4月份從油茶健壯植株上剪取當年生帶芽枝條，帶回后放入I升的燒杯中，加入200毫升純凈水，放入4°C恒溫箱水培3天。
(2)枝條從恒溫箱取出后剪成一葉一芽的莖段(將葉片剪掉，保留葉柄)，然后用質量百分比濃度O. 1%的多菌靈溶液浸泡2 4分鐘，浸泡后流水沖洗2小吋。(3)將流水沖洗后的外植體放置超凈工作臺上,先用體積百分比濃度75%こ醇消毒10秒，用無菌水沖洗3次,然后用質量百分比濃度O. l%HgCl2處理2分鐘,無菌水沖洗3次，然后再用HgCl2處理3分鐘，無菌水沖洗6次，沖洗完以后用剪刀將莖段兩端剪掉2 3毫米，同時將葉柄剪掉，然后接種于初代培養基上，培養基用300ml的廣ロ瓶分裝，每瓶30ml，封口膜包扎，在121°C和I. lkg. cm_2條件下，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20min。培養條件的篩選在培養溫度為25±2°C，光照1500 2000LX，每日光照時間為12h的培養室中培養。其中，所用培養基為本領域常規培養基。結果參見圖I至3。
實施例2
從油茶健壯植株上剪取當年生帶芽枝條，采回后放置于4°C恒溫箱水培5天；將枝條剪成一葉一芽的莖段，用質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液浸泡3分鐘，浸泡后流水沖洗2小時；在超凈工作臺上，先用體積百分比濃度75%乙醇消毒15秒，用無菌水沖洗3次，然后用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理3分鐘，無菌水沖洗3次，然后再用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理4分鐘，無菌水沖洗6次，污染率為4. 4%，萌芽率為95. 5%。具體操作中的其他步驟同實施例I。 實施例3
從油茶健壯植株上剪取當年生帶芽枝條，采回后放置于4°C恒溫箱水培7天；將枝條剪成一葉一芽的莖段，用質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液浸泡3分鐘，浸泡后流水沖洗3小時；在超凈工作臺上，先用體積百分比濃度75%乙醇消毒15秒，用無菌水沖洗3次，然后用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理3分鐘，無菌水沖洗3次，然后再用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理5分鐘，無菌水沖洗8次，污染率為0%，萌芽率為97. 8%。具體操作中的其他步驟同實施例I。實施例4
從油茶健壯植株上剪取當年生枝條，采回后放置于4°C恒溫箱水培5天；水培后剪取葉片，將葉片用質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液浸泡2分鐘，浸泡后流水沖洗2小時；在超凈工作臺上，先用體積百分比濃度75%乙醇消毒10秒，用無菌水沖洗3次，然后用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理2分鐘，無菌水沖洗3次，然后再用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理2分鐘，無菌水沖洗6次，污染率為4%，愈傷組織誘導率達100%。具體操作如下
(1)3-5月份從油茶健壯植株上剪取當年生枝條，帶回后放入I升的燒杯中，加入200毫升純凈水，放入4°C恒溫箱水培5天。
(2)枝條從恒溫箱取出后剪取葉片，將葉片用質量百分比濃度0.1%的多菌靈溶液浸泡2分鐘，浸泡后流水沖洗I小時。(3)將流水沖洗后的外植體放置超凈工作臺上,先用體積百分比濃度75%乙醇消毒10秒,用無菌水沖洗3次,然后用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理2分鐘,無菌水沖洗3次，然后再用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理2分鐘，無菌水沖洗6次，沖洗完以后用剪刀剪除葉緣、葉柄及葉脈，將葉片剪成0. 5cm*0. 5cm，然后接種于誘導培養基上，培養基用300ml的廣口瓶分裝，每瓶30ml，封口膜包扎，在121°C和I. lkg. cm_2條件下，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20min。培養條件的篩選溫度為25±2°C ;光照條件暗培養20天后轉入光培養，光培養條件為光照1500 2000LX，每日光照時間為12h。其中，所用培養基為本領域常規培養基。實施例5
7月份從油茶健壯植株上剪取油茶未成熟果實，采回后放置于4°C恒溫箱低溫處理5天；低溫處理后將種子取出(去掉果皮)，然后將外種皮去掉，將種子用質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液浸泡3分鐘，浸泡后流水沖洗2小時；在超凈工作臺上，先用體積百分比濃度75%乙醇消毒15秒，用無菌水沖洗3次，然后用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理3分鐘，無菌水沖洗3次，然后再用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理5分鐘，無菌水沖洗6次，污染率為3%，愈傷組織誘導率達100%。具體操作如下
(1)7月份從油茶健壯植株上剪取油茶未成熟果實，帶回后放入4°C恒溫箱低溫處理5
天。·
(2)果實從恒溫箱取出后去掉果皮及外種皮，然后將種子用質量百分比濃度0.1%的多菌靈溶液浸泡3分鐘，浸泡后流水沖洗2小時。(3)將流水沖洗后的外植體放置超凈工作臺上,先用體積百分比濃度75%乙醇消毒15秒,用無菌水沖洗3次，然后用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理3分鐘,無菌水沖洗3次，然后再用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理5分鐘，無菌水沖洗6次，沖洗完以后用手術刀剪除內種皮，然后接種于誘導培養基上，培養基用300ml的廣口瓶分裝，每瓶30ml，封口膜包扎，在121°C和I. lkg. cm_2條件下，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20min。培養條件的篩選在培養溫度為25±2°C，光照1500 2000LX，每日光照時間為12h的培養室中培養。其中，所用培養基為本領域常規培養基。實施例6
10月份從油茶健壯植株上剪取油茶成熟果實，采回后放置于4°C恒溫箱低溫處理7天；低溫處理后將種子取出(去掉果皮)，然后將外種皮去掉，將種子用質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液浸泡4分鐘,浸泡后流水沖洗4小時；在超凈工作臺上,先用體積百分比濃度75%乙醇消毒15秒，用無菌水沖洗4次，然后用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理8分鐘，無菌水沖洗4次，然后再用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理10分鐘，無菌水沖洗8次，污染率為5%，愈傷組織誘導率達98. 7%。具體操作中的其他步驟同實施例5。
權利要求
1.一種油茶無性系組培外植體脫毒方法，包括如下步驟 (1)將油茶無性系組培外植體在O 10°C條件下進行低溫預處理； (2)將低溫預處理后的油茶無性系組培外植體用乙醇消毒，沖洗，然后用HgCl2處理；其中，所述的HgCl2處理是分兩次或兩次以上對油茶無性系組培外植體進行間歇性處理，HgCl2處理的總時間為4 20分鐘，HgCl2每處理一次后用水沖洗。
2.如權利要求I所述的脫毒方法，其特征在于，步驟(I)所述的低溫預處理是將油茶無性系組培外植體放置于4°C恒溫箱低溫處理3-7天；步驟(2)是將低溫處理后的油茶無性系組培外植體用體積百分比濃度75%的乙醇消毒10 15秒,無菌水沖洗3 4次,然后用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理2 10分鐘，無菌水沖洗3 4次，然后再用質量百分比濃度0. 1%的HgCl2處理2 10分鐘，無菌水沖洗6 8次。
3.如權利要求I所述的脫毒方法，其特征在于，還包括如下步驟將經步驟(I)低溫處理的油茶無性系組培外植體進行修剪，在質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液中浸泡2 4分鐘，流水沖洗2 4小時，然后再進行步驟(2)的處理。
4.如權利要求I所述的脫毒方法，其特征在于，所述的油茶無性系組培外植體為當年生帶芽枝條。
5.如權利要求4所述的脫毒方法，其特征在于，將經步驟(I)低溫處理的帶芽枝條取出后剪成一葉一芽的莖段，然后在質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液中浸泡2 4分鐘，流水沖洗2 4小時，然后再進行步驟(2)的處理。
6.如權利要求I所述的脫毒方法，其特征在于，所述的油茶無性系組培外植體為當年生帶葉枝條。
7.如權利要求6所述的脫毒方法，其特征在于，將經步驟(I)低溫處理的帶葉枝條取出后剪取葉片，將葉片在在質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液中浸泡2 4分鐘，流水沖洗2 4小時，然后再進行步驟(2)的處理。
8.如權利要求I所述的脫毒方法，其特征在于，所述的油茶無性系組培外植體為未成熟果實。
9.如權利要求8所述的脫毒方法，其特征在于，將經步驟(I)低溫處理的未成熟果實的種子取出，去掉外種皮，將種子用在質量百分比濃度0. 1%的多菌靈溶液中浸泡2 4分鐘，流水沖洗2 4小時，然后再進行步驟(2)的處理。
10.如權利要求5或7所述的脫毒方法，其特征在于，所述的步驟(I)低溫處理是指在4 °C恒溫箱中水培。
全文摘要
本發明公開了一種油茶無性系組培外植體脫毒方法，包括如下步驟(1)將油茶無性系組培外植體進行低溫預處理；(2)將低溫預處理后的油茶無性系組培外植體用乙醇消毒，沖洗，然后用HgCl2處理；其中，所述的HgCl2處理是分兩次以上對油茶無性系組培外植體進行間歇性處理，HgCl2處理的總時間為4～20分鐘，HgCl2每處理一次后用水沖洗。本發明的方法操作簡單，污染率低，克服了傳統保存率低的技術問題。
文檔編號A01H4/00GK102696482SQ201210200050
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者唐煒, 彭邵鋒, 楊小胡, 王湘南, 王瑞, 王磊, 王金路, 羅健, 陳永忠, 陳隆升, 馬力 申請人:湖南省林業科學院