專利名稱：一種馬的非手術胚胎移植方法
技術領域：
本發明涉及胚胎移植技術領域，特別涉及一種馬的非手術胚胎移植方法。
背景技術：
胚胎移植技術是一項應用于哺乳動物的繁育高新技術。利用胚胎移植，可以開發遺傳特性優良的母畜繁殖潛力，較快地擴大良種畜群，在自然情況下，牛、馬等母畜通常一年產I胎，一生繁殖后代僅僅16只左右；豬也不過百頭。采用胚胎移植則使優良母畜免去 了冗長的妊娠期，胚胎取出后不久即可再次發情、配種和受精，從而能在一定時間內產生較多的后代。目前在許多畜牧業發達國家胚胎移植均已進入產業化發展階段。在我國，這一技術起步較晚，我國從七十年代開始對胚胎生物工程技術進行研究，八十年代后發展迅速。先后采用胚胎移植技術成功對奶牛、波爾山羊進行擴繁。由于各種原因，建國以來我國養馬業日漸消退，因此國內馬的胚胎移植技術也鮮有研究。但是隨著現代馬術運動的興起，我國養馬業開始復蘇，應用胚胎移植技術進行良種馬匹的擴繁成為改良我國馬匹品種以適應現代馬術運動的一條捷徑。由于馬屬動物的卵巢結構有其獨特性，因此導致了馬屬動物的生理特點及排卵規律有別于其他動物。雖然牛羊等胚胎移植技術已經成熟化，但并不適用于馬屬動物。
發明內容
為了提高進口良種馬匹的繁育能力，本發明實施例提供了一種馬的非手術胚胎移植方法。為了實現上述發明目的，本發明提供了一種馬的非手術胚胎移植方法，其中，所述移植方法包括以下步驟
檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進行檢查，直至找到適合移植的胚胎；
洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養液的多孔培養板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗6 10次；
裝胚步驟在無菌操作臺內的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。
所述檢胚步驟之前還可以進一步包括備胚步驟，所述備胚步驟為于供體母馬排卵后6^8天使用Y型管沖胚裝置進行沖胚獲得包含胚胎和沖胚液的胚胎混合液，或者準備好通過體外受精方式獲得的含有胚胎和培養液的胚胎混合液。所述備胚步驟之前還可以進一步包括排卵調控步驟，所述排卵調控步驟為于供體母馬和/或受體母馬發情期、卵泡直徑> 35mm時靜脈注射hCG，使用劑量為1200-1800單位/匹O
所述備胚步驟之前還可以進一步包括發情調控步驟，所述發情調控步驟為于供體母馬和/或受體母馬黃體生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用劑量為O. 15-0. 3mg/匹。
所述裝胚步驟之后還可以進一步包括移植步驟，所述移植步驟為將裝好胚胎的移植管放入胚胎移植槍內，清洗并擦干受體母馬外陰后，將移植槍送入母馬子宮內，插入移植槍內芯，將胚胎送入受體母馬子宮。
所述備胚步驟中的所述Y形管沖胚裝置包括Y型管、帶氣囊導管和集卵杯，所述Y型管·的一端連接所述帶氣囊導管，用于通過所述Y型管向供體母馬子宮內灌注沖胚液，或者通過所述Y型管向所述集卵杯內輸送胚胎或混有胚胎的混合液；所述Y型管的另一端帶有集卵控制開關，連接有所述集卵杯；所述Y型管的第三端帶有沖胚控制開關，連接盛放沖胚液的容器。
所述洗胚步驟中的所述胚胎營養液包含以下成分氯化鈉6 10g/L，氯化鉀O. Γ0. 3g/L，磷酸氫二鈉f I. 5 g/L，磷酸二氫鉀O. f0. 3 g/L，氯化鈣O. 05、. 15 g/L，氯化鎂0.05、. 15 g/L，體積百分比為O. 3、. 6%的牛血清白蛋白或體積百分比為1% 10%的犢牛血清，青霉素9(Γ110萬單位/升，鏈霉素5(Γ100萬單位/升。
所述洗胚步驟中的所述多孔培養板優選為8孔培養板，且體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次。
本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是本發明實施時選擇進口優良馬匹作為供體母馬，選擇國產母馬作為受體母馬，根據母馬生理特點、排卵規律，采用非手術法進行沖胚、體視顯微鏡下檢胚以及洗胚，并采用非手術法將胚胎移植給生理周期同步的受體母馬；還可以采用人工干預的方式對供受體母馬進行發情調控、排卵調控。本發明可使每匹供體母馬年產有效胚胎6 12枚，鮮胚移植成功率可達85%，本發明不需要麻醉和手術，極大地提高了供受體母馬的利用率。檢胚時，按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進行檢查，能夠全面徹底的把所有胚胎找到，并利于判斷哪個或哪些是適合移植的胚胎；裝胚時，將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，能夠使胚胎始終處于液體中間，不會向兩側滑落而造成胚胎丟失。
具體實施例方式為了提高進口良種馬匹的繁育能力，使進口良種馬匹可年產胚胎6-12枚，從而達到快速繁育進口優良馬種以適應現代馬術運動的需要的目的，本發明提供了一種馬的非手術胚胎移植方法。
實施例I:
一種馬的非手術胚胎移植方法，移植方法包括以下步驟
備胚步驟準備好通過體外受精方式獲得的含有胚胎和培養液的胚胎混合液。檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進行檢查，直至找到適合移植的胚胎；
洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養液的8孔培養板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液體留作裝胚用；
裝胚步驟在無菌操作臺內的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。其中，洗胚步驟中的胚胎營養液包含以下成分氯化鈉8g/L，氯化鉀O. 2 g/L，磷酸氫二鈉I. 2 g/L，磷酸二氫鉀O. 15 g/L，氯化鈣O. 12 8/1，氯化鎂0.08 g/L，體積百分比為O. 4 %的牛血清白蛋白，青霉素100萬單位/升，鏈霉素80萬單位/升。
實施例2
一種馬的非手術胚胎移植方法，移植方法包括以下步驟
備胚步驟于供體母馬排卵后61天使用Y型管沖胚裝置進行沖胚獲得包含胚胎和沖胚液的胚胎混合液。檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進行檢查，直至找到適合移植的胚胎；
洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養液的8孔培養板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液體留作裝胚用；
裝胚步驟在無菌操作臺內的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。移植步驟將裝好胚胎的移植管放入胚胎移植槍內，清洗并擦干受體母馬外陰后，將移植槍送入母馬子宮內，插入移植槍內芯，將胚胎送入受體母馬子宮。其中，備胚步驟中的Y形管沖胚裝置包括Y型管、帶氣囊導管和集卵杯，Y型管的一端連接帶氣囊導管，用于通過Y型管向供體母馬子宮內灌注沖胚液，或者通過Y型管向集卵杯內輸送胚胎或混有胚胎的混合液；Y型管的另一端帶有集卵控制開關，連接集卵杯；￥型管的第三端帶有沖胚控制開關，連接盛放沖胚液的容器。其中，洗胚步驟中的胚胎營養液包含以下成分氯化鈉10g/L，氯化鉀O. 3 g/L，磷酸氫二鈉I. 35g/L，磷酸二氫鉀O. 2g/L，氯化鈣O. 08g/L,氯化鎂O. I g/L,體積百分比為6%的犢牛血清，青霉素110萬單位/升，鏈霉素60萬單位/升。
實施例3
一種馬的非手術胚胎移植方法，移植方法包括以下步驟
發情調控步驟為于黃體生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用劑量為O. 2mg/匹。使用PGF2 α后I 3天母馬即可進入發情期。
排卵調控步驟為于母馬發情期、卵泡直徑> 35mm時靜脈注射hCG，使用劑量為1500單位/匹。使用hCG后24 48小時母馬即可完成排卵。備胚步驟于供體母馬排卵后61天使用Y型管沖胚裝置進行沖胚獲得包含胚胎和沖胚液的胚胎混合液。檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進行檢查，直至找到適合移植的胚胎；
洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養液的8孔培養板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液體留作裝胚用；
裝胚步驟在無菌操作臺內的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。
·
移植步驟將裝好胚胎的移植管放入胚胎移植槍內，清洗并擦干受體母馬外陰后，將移植槍送入母馬子宮內，插入移植槍內芯，將胚胎送入受體母馬子宮。其中，備胚步驟中的Y形管沖胚裝置包括Y型管、帶氣囊導管和集卵杯，Y型管的一端連接帶氣囊導管，用于通過Y型管向供體母馬子宮內灌注沖胚液，或者通過Y型管向集卵杯內輸送胚胎或混有胚胎的混合液；Y型管的另一端帶有集卵控制開關，連接集卵杯；￥型管的第三端帶有沖胚控制開關，連接盛放沖胚液的容器。其中，洗胚步驟中的胚胎營養液包含以下成分氯化鈉10g/L，氯化鉀O. 3 g/L，磷酸氫二鈉I. 35g/L，磷酸二氫鉀O. 2g/L，氯化鈣O. 08g/L,氯化鎂O. I g/L,體積百分比為6%的犢牛血清，青霉素110萬單位/升，鏈霉素60萬單位/升。
移植試驗
種公馬歐洲進口良種溫血馬4匹。供體母馬歐洲進口良種溫血馬10匹。受體母馬國產母馬120匹。試驗時間及移植方法采用本發明實施例3的移植方法進行移植試驗。移植數量按月統計。實驗地點青島即墨鰲山衛馬匹繁育基地。試驗數據見表I。表I每月移植數量和懷孕數量統計表
—|3月|4月|5月 |6月|7月|8月|9月|10月
移植數28~ 12 ~ 15了4Ti125
懷孕數26~ 10 ~ 13了312114
移植成功率1100%175% 183. 3% |86. 7%\92. 9%|80% |91. 7%丨80%
由表I能夠看到，通過本發明實施例3的移植方法進行胚胎移植，能夠大大提高進口良種馬匹的繁育能力，每匹每年能成功產胎6-12枚,移植成功率平均為86. 2%。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種馬的非手術胚胎移植方法，其特征在于，所述移植方法包括以下步驟 檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進行檢查，直至找到適合移植的胚胎； 洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養液的多孔培養板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗6 10次； 裝胚步驟在無菌操作臺內的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。
2.根據權利要求I所述的馬的非手術胚胎移植方法，其特征在于，所述檢胚步驟之前還可以進一步包括備胚步驟，所述備胚步驟為于供體母馬排卵后61天使用Y型管沖胚裝置進行沖胚獲得包含胚胎和沖胚液的胚胎混合液，或者準備好通過體外受精方式獲得的含有胚胎和培養液的胚胎混合液。
3.根據權利要求2所述的馬的非手術胚胎移植方法，其特征在于，所述備胚步驟之前還可以進一步包括排卵調控步驟，所述排卵調控步驟為于供體母馬和/或受體母馬發情期、卵泡直徑≥35mm時靜脈注射hCG，使用劑量為1200-1800單位/匹。
4.根據權利要求3所述的馬的非手術胚胎移植方法，其特征在于，所述備胚步驟之前還可以進一步包括發情調控步驟，所述發情調控步驟為于供體母馬和/或受體母馬黃體生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用劑量為O. 15-0. 3mg/匹。
5.根據權利要求I一4任一所述的馬的非手術胚胎移植方法，其特征在于，所述裝胚步驟之后還可以進一步包括移植步驟，所述移植步驟為將裝好胚胎的移植管放入胚胎移植槍內，清洗并擦干受體母馬外陰后，將移植槍送入母馬子宮內，插入移植槍內芯，將胚胎送入受體母馬子宮。
6.根據權利要求I一5任一所述的馬的非手術胚胎移植方法，其特征在于，所述備胚步驟中的所述Y形管沖胚裝置包括Y型管、帶氣囊導管和集卵杯，所述Y型管的一端連接所述帶氣囊導管，用于通過所述Y型管向供體母馬子宮內灌注沖胚液，或者通過所述Y型管向所述集卵杯內輸送胚胎或混有胚胎的混合液；所述Y型管的另一端帶有集卵控制開關，連接有所述集卵杯；所述Y型管的第三端帶有沖胚控制開關，連接盛放沖胚液的容器。
7.根據權利要求I一6任一所述的馬的非手術胚胎移植方法，其特征在于，所述洗胚步驟中的所述胚胎營養液包含以下成分氯化鈉6 10g/L，氯化鉀O. Γ0. 3 g/L，磷酸氫二鈉Γ1. 5 g/L，磷酸二氫鉀 O. Γ0. 3 g/L，氯化鈣 O. 05、. 15 g/L，氯化鎂 O. 05、. 15 g/L，體積百分比為O. 3、. 6%的牛血清白蛋白或體積百分比為1% 10%的犢牛血清，青霉素9(Γ110萬單位/升，鏈霉素5(Γ100萬單位/升。
8.根據權利要求I一7任一所述的馬的非手術胚胎移植方法，其特征在于，所述洗胚步驟中的所述多孔培養板為8孔培養板，且體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次。
全文摘要
本發明公開了一種馬的非手術胚胎移植方法，移植方法包括以下步驟發情調控步驟；排卵調控步驟；備胚步驟；檢胚步驟；洗胚步驟；裝胚步驟；移植步驟。本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是本發明實施時選擇進口優良馬匹作為供體母馬，選擇國產母馬作為受體母馬，根據母馬生理特點、排卵規律，采用非手術法進行沖胚、體視顯微鏡下檢胚以及洗胚，并采用非手術法將胚胎移植給生理周期同步的受體母馬；還可以采用人工干預的方式對供受體母馬進行發情調控、排卵調控。本發明可使每匹供體母馬年產有效胚胎6~12枚，鮮胚移植成功率可達85%，本發明不需要麻醉和手術，極大地提高了供受體母馬的利用率。
文檔編號A61D19/04GK102836014SQ20121032923
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者張志鵬, 榮美潔, 李成修, 邢金鳳, 張肖軍 申請人:青島德瑞駿發生物科技有限公司