專利名稱：一種黑芥小孢子培養獲得再生植株的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養技術領域，具體涉及一種黑芥小孢子組織培養獲得再生植株的培養方法。
背景技術：
單倍體是指僅攜有配子染色體數目的個體，在作物育種實踐和遺傳育種理論研究中均具有重要意義。游離小孢子培養作為人工誘導單倍體的有效途徑，具有實用性。在育種實踐中，對單倍體進行染色體加倍當代就可以獲得純系即雙單倍體群體，比采用傳統的自交純化方法省時約3-5年，大大提高育種效率，縮短了育種周期。在遺傳育種理論研究中，雙單倍體在遺傳上具有絕對的純合性，是進行AFLP、RFLP和SSR等分子標記、遺傳圖譜繪制及重要抗性基因定位研究的良好材料，也是進行物種進化研究、遺傳分析和植物基因克隆篩選的理想材料。黑芥(Ara1S1Sica nigra, BB)是十字花科蕓薹屬3個基本種之一,多為野生分布。已有研究表明，黑芥所在的BB基因組中存在對黑腐病主要致病生理小種I和4的抗性，對根腫病的高抗性，以及對黑脛病的全生育期抗性。而向蕓薹屬蔬菜，特別是受這三種病害影響較為嚴重的甘藍和白菜中轉移這些優良抗性基因，將對培育多抗、優質蔬菜新品種具有重要意義。但目前黑芥的抗病研究只局限于對材料各種生育期的抗病性鑒定，進一步的分子生物學研究相對滯后，進展緩慢。特別是對相關遺傳圖譜的繪制及重要抗性基因的定位研究極少，原因之一是缺少遺傳上純合、表現型一致的研究群體，而小孢子培養技術為獲得此群體提供了一條快捷、有效的途徑。黑芥是十字花科作物中最不容易進行游離小孢子培養的材料之一，盡管在蕓薹屬很多作物中已實現通過小孢子培養成功獲得單倍體。有關黑芥游離小孢子培養研究，目前國內還未見相關報道，國外也僅 見早期的一篇報道，并且其出胚率低，再生株獲得數量很有限(Lichter 1989)。本研究通過對黑芥游離小孢子進行培養，并成功獲得一定數量的雙單倍體再生植株，為開展黑芥種質資源的遺傳研究，建立高效簡便的育種方法提供重要的理論與技術指導，同時為相關遺傳圖譜繪制、重要抗性基因定位及物種進化研究等提供良好的研究材料。
發明內容
本發明的目的是，針對黑芥是十字花科作物中不易進行游離小孢子培養，從而也難以獲得遺傳上純合、表現型一致的雙單倍體再生植株材料的缺陷，提供一種使能批量獲得遺傳上純合、表現型一致雙單倍體再生植株材料的黑芥小孢子培養獲得再生植株的方法，以建立黑芥小孢子培養再生體系，加快黑芥的育種進程與效率；同時可為黑芥遺傳圖譜繪制及抗性基因的精確定位、克隆和轉基因等研究提供材料。本發明目的通過以下技術方案來實現。—種黑芥小孢子培養獲得再生植株的方法，該方法按如下步驟進行(I)培養基的配制包括小孢子培養各階段的培養基，它們的組分與各組分在每升培養基中的重量為
1)胚狀體誘導培養基NLN-13液體培養基+蔗糖130g/L, pH 5. 6飛.0，過濾滅菌；
2)胚狀體分化培養基B5培養基 + ZT O. 5^2. O mg/L + NAA O. θΓθ.1 mg/L + BAP
O.5 2· O mg/L +鹿糖20 30 g/L +瓊脂7 9 g/L, pH 5. 6 6· O,高溫滅菌；
3)萌發、生根培養基MS培養基+NAA O. 05 O.1 mg/L +蔗糖30 g/L +瓊脂8 g/L,pH 5. 8,高溫滅菌；
(2)供體植株、花蕾的選擇與預處理
O供體植株、花蕾的選擇選擇生長健康的黑芥作為供體植株；并從中選擇花瓣與花藥長度比在O. 7^1. O之間，處于單核中晚期的花蕾為供體花蕾；
2)花蕾滅菌先用純凈水清洗花蕾3次后，將其放入由O.1% HgCl2 + O. 1%吐溫20配成的滅菌液中，搖床按50-80 rpm輕微搖晃12分鐘進行表面消毒后，再在超凈臺上用無菌水清洗4次，備用；
3)花蕾小孢子的分離、混配與分裝在超凈臺上將滅菌后花蕾置于無菌燒杯中，加入ImL胚狀體誘導培養基后用平頭玻棒壓碎花蕾、再加入9 mL相同培養基并攪成懸浮液；用40Mm無菌尼龍濾網過濾于離心管中，IOOOrpm離心4分鐘，棄上清液；加入胚狀體誘導培養基至平均每4mL培養基中含1. O個花蕾所含的小孢子量后，再將該液中的培養基與由NLN-13液體培養基+ lg/L活性炭、經高溫滅菌的活性炭混合液按體積O. 05 mL / 4mL比例混配成小孢子懸浮液；并分裝于直徑為6 cm的無菌培養皿中,加蓋后用parafilm膜封口，備用； (3)小孢子胚狀體的誘導培養將上述培養皿置于31-33°C培養箱中，暗培養24-48小時；后置于25°C恒溫培養箱中，暗培養15-20天至胚狀體出現；再在25°C黑暗下50rpm振蕩培養7-10天，至子葉胚狀體形成；
(4)再生植株的分化與萌發培養將子葉胚狀體平放于胚狀體分化培養基上，25°C每天光照16小時培養15 20天至胚狀體膨大并再生出新植株；
(5)再生植株的生根培養與移栽切取萌發有正常生長點的再生植株插于生根培養基中，25°C每天光照16小時培養至生根；將生根再生植株移入由泥炭與珍珠巖按體積2 I配制的基質中，澆透水，覆蓋塑料膜后在25°C下培養I周；
(6)再生植株的倍性檢測取移栽成活再生植株的嫩葉，用德國Partec公司生產的partec PA倍性分析儀檢測該再生植株的DNA倍性。本發明的有益效果是1、本發明對黑芥的小孢子進行培養，能批量獲得遺傳上純合、表現型一致的雙單倍體再生植株材料，以建立黑芥小孢子培養再生體系，加快黑芥的育種進程與效率；同時可為黑芥遺傳圖譜繪制及抗性基因的精確定位、克隆和轉基因等研究提供材料。2、本發明黑芥小孢子培養的出胚率，最高可達15個胚/蕾；
3、本發明胚狀體的出苗率，平均達50%。
具體實施例方式通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的內容并不局限于此。實施例1 :(黑芥小孢子培養再生植株的方法I)(1)培養基的配制包括小孢子培養各階段的培養基，它們的組分與各組分在每升培養基中的重量為
I)胚狀體誘導培養基NLN-13液體培養基+蔗糖130 g/L, pH 6.0，過濾滅菌(其中NLN-13培養基配方見表I) ; 2)胚狀體分化培養基=B5培養基+ ZT 1.5 mg/L + NAA
O.05 mg/L + BAP O. 8 mg/L + 蔗糖 20 g/L + 瓊脂 7 g/L, pH 6. 0，高溫滅菌，(其中 B5 培養基配方見表I);
3)萌發、生根培養基MS培養基+ NAA O. 08 mg/L +蔗糖30 g/L +瓊脂7g/L，pH
5.8，高溫滅菌(其中MS培養基配方見表I)；
表i Xm-13、B;和MS培養基配方
權利要求
1. 一種黑芥小孢子培養獲得再生植株的方法，其特征在于按如下步驟進行 (I)培養基的配制包括小孢子培養各階段的培養基，它們的組分與各組分在每升培養基中的重量為 1)胚狀體誘導培養基NLN-13液體培養基+蔗糖130g/L, pH 5. 6飛.0，過濾滅菌； 2)胚狀體分化培養基B5培養基 + ZT O. 5^2. O mg/L + NAA O. θΓθ.1 mg/L + BAPO.5 2· O mg/L +鹿糖20 30 g/L +瓊脂7 9 g/L, pH 5. 6 6· O,高溫滅菌； 3)萌發、生根培養基MS培養基+NAA O. 05 O.1 mg/L +蔗糖30 g/L +瓊脂8 g/L,pH 5. 8,高溫滅菌； (2)供體植株、花蕾的選擇與預處理 O供體植株、花蕾的選擇選擇生長健康的黑芥作為供體植株；并從中選擇花瓣與花藥長度比在O. 7^1. O之間，處于單核中晚期的花蕾為供體花蕾； 2)花蕾滅菌先用純凈水清洗花蕾3次后，將其放入由O.1% HgCl2 + O. 1%吐溫20配成的滅菌液中，搖床按50-80 rpm輕微搖晃12分鐘進行表面消毒后，再在超凈臺上用無菌水清洗4次，備用； 3)花蕾小孢子的分離、混配與分裝在超凈臺上將滅菌后花蕾置于無菌燒杯中，加入ImL胚狀體誘導培養基后用平頭玻棒壓碎花蕾、再加入9 mL相同培養基并攪成懸浮液；用40Mm無菌尼龍濾網過濾于離心管中，IOOOrpm離心4分鐘，棄上清液；加入胚狀體誘導培養基至平均每4mL培養基中含1. O個花蕾所含的小孢子量后，再將該液中的培養基與由NLN-13液體培養基+ lg/L活性炭、經高溫滅菌的活性炭混合液按體積O. 05 mL / 4mL比例混配成小孢子懸浮液；并分裝于直徑為6 cm的無菌培養皿中,加蓋后用parafilm膜封口，備用； (3)小孢子胚狀體的誘導培養將上述培養皿置于31-33°C培養箱中，暗培養24-48小時；后置于25°C恒溫培養箱中，暗培養15-20天至胚狀體出現；再在25°C黑暗下50rpm振蕩培養7-10天，至子葉胚狀體形成； (4)再生植株的分化與萌發培養將子葉胚狀體平放于胚狀體分化培養基上，25°C每天光照16小時培養15 20天至胚狀體膨大并再生出新植株； (5)再生植株的生根培養與移栽切取萌發有正常生長點的再生植株插于生根培養基中，25°C每天光照16小時培養至生根；將生根再生植株移入由泥炭與珍珠巖按體積2 1配制的基質中，澆透水，覆蓋塑料膜后在25 °C下培養I周； (6)再生植株的倍性檢測取移栽成活再生植株的嫩葉，用德國Partec公司生產的partec PA倍性分析儀檢測該再生植株的DNA倍性。
全文摘要
本發明公開了一種黑芥小孢子培養獲得再生植株的方法，屬于植物組織培養技術領域。方法包括(1)培養基的配制；(2)供體植株、花蕾的選擇與預處理；(3)小孢子胚狀體的誘導培養；(4)再生植株的分化與萌發培養；(5)再生植株的生根培養與移栽；(6)再生植株的倍性檢測等步驟。本發明對黑芥的小孢子進行培養，其出胚率最高達15個胚/蕾，出苗率平均達50%，能批量獲得遺傳上純合、表現型一致的雙單倍體再生植株材料。本發明可在黑芥育種、遺傳圖譜、抗性基因定位、克隆及轉基因等研究領域中推廣應用。
文檔編號A01H4/00GK103053424SQ20131001392
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者盛小光, 顧宏輝, 虞慧芳, 趙振卿, 王建升, 許映君 申請人:浙江省農業科學院