一個組成型表達啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于植物生物【技術領域】，具體涉及一個大豆組成型表達啟動子SOY001P的功能鑒定和應用。本發明所公開的SOY001P啟動子在植物的根、莖、葉和花等組織器官中都有很強的表達活性，在植物轉基因領域具有很好的應用前景。
【專利說明】一個組成型表達啟動子及其應用
【技術領域】[0001]本發明屬于植物生物【技術領域】，具體涉及一個從大豆中分離的組成型表達啟動子S0Y00IP的功能鑒定和應用。
【背景技術】
[0002]外源DNA序列通過連接到特定的啟動子從而啟動在植物宿主中的表達，啟動子類型的選擇決定基因的表達時間和部位。根據啟動子驅動基因表達的不同特點，啟動子分為組成型啟動子和特異性啟動子；組成型啟動子能在所有細胞或組織中，不分時間和空間地啟動轉錄；特異性啟動子又可分為組織特異性啟動子和誘導型啟動子。目前，農業生物【技術領域】廣泛應用的主要是一些組成型的強啟動子，高活性的組成型啟動子在植物基因功能研究和遺傳改良中具有很好的應用前景。
[0003]組成型啟動子(constitutive promoter)之所以稱之為組成型是因為這類啟動子控制的基因的表達大體恒定在一定水平上，在不同組織部位表達水平沒有明顯差異，其特點是表達持續、RNA和蛋白表達量相對恒定、不表現出時空和器官特異性、不受外界因素的誘導。目前在植物基因工程改良中使用最普遍的組成型啟動子主要有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子、根癌農桿菌Ti質粒的胭脂堿合成酶基因NOS啟動子、水稻actin啟動子以及玉米泛素蛋白Ubiquitin啟動子。CaMV35S啟動子和NOS啟動子能夠驅動外源基因在大部分植物中表達，如在轉基因水稻、擬南芥、小麥等植物的研究中均有應用，然而這些啟動子畢竟不是來源植物，因此在植物基因工程中應用這些啟動子可能會存在潛在的生物不安全性。有研究表明內源型啟動子在驅動轉基因鹽藻外源基因的高效表達中比外源啟動子更具有優勢。因此，克隆植物內源組成型啟動子非常重要。
[0004]組成型啟動子為植物基因工程中應用最早、最廣泛的一類啟動子。在轉基因育種或研究基因功能時，為了充分發揮外源基因表達產物的功能一般都使用組成型啟動子使外源基因在植物中高效、穩定、持久地表達。為了避免同時使用同一個啟動子驅動2個或2個以上的外源基因而導致基因沉默或共抑制現象，需要用到不同的啟動子分別驅動不同的外源基因、篩選基因和報告基因。雖然在先前的工作中也已經分離得到一些組成型啟動子，但這些還遠遠不夠，還需要我們做大量的工作。
[0005]本發明通過實驗分析，發現啟動子S0Y001P呈現出很強的組成型表達特性，在S0Y00IP轉基因擬南芥中，其所驅動的報告基因GUS在轉基因擬南芥的根、莖、葉和花等器官中都表現出很強的表達水平，這些數據充分表明S0Y001P是一個很強的組成型表達啟動子。
【發明內容】
[0006]本發明的目的之一是提供一種從大豆中分離的組成型表達啟動子。
[0007]本發明的目的之二是提供含有上述組成型表達啟動子的表達盒、表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞。[0008]本發明的目的之三是將所述的組成型表達啟動子以及含有該啟動子的表達載體應用與調控異源核苷酸序列在植物中的轉錄或表達。
[0009]本發明提供了一個能在植物各組織器官中驅動組成型表達的啟動子核苷酸序列，及克隆并應用該啟動子的方法。在一些實施方式中，包括(a)將核苷酸序列可操作地連接于包括SEQ ID No:1的啟動子，以產生表達盒jP(b)生成含有該表達盒的轉基因植物，由此在植物中表達所述核苷酸。在一些實施方式中，所述“生成”包括用表達盒轉化植物細胞并從所轉化的植物細胞中再生出植物。
[0010]本發明所提供的組成型表達啟動子，含有序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，還包含與SEQ ID No:1中所列核苷酸序列至少具有95%相似性的核苷酸序列，可以驅動操作性連接的核苷酸序列在植物各器官中的組成型表達。
[0011]實施方案中的啟動子核苷酸序列可用于從其它生物中分離相應序列，如其它植物(單子葉或雙子葉植物等)。根據這些相應序列與本文所列序列間的序列同源性，使用如PCR、雜交等技術來鑒別分離這些相應序列。因此，根據它們與本文所列的完整S0Y001P啟動子序列(或其片段)間的序列相似性而分離的相應片段，也包括在實施方案中。實施方案的啟動子區域可從任何植物中分離，包括(但不限于)水稻、蕓苔屬、玉米、小麥、高粱、兩節薺屬、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、擬南芥屬、菜豆屬、花生、苜蓿、燕麥、油菜籽、大麥、燕麥、黑麥(Rye)、粟、蜀黍、小黑麥、單粒小麥、斯佩爾特小麥(Spelt)、雙粒小麥、亞麻、格蘭馬草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麥草、甘鹿、紅莓苔子、番木瓜、香蕉、紅花、油棕、香瓜、蘋果、黃瓜、石斛、劍蘭、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、蕓苔、甜菜、咖啡、薯蕷、觀賞植物和松類等。
[0012]本文中“啟動子” 一 詞指DNA調控序列，其中通常含有一個TATA盒，該序列能夠指導RNA聚合酶II在合適的轉錄起始位點上起始特定編碼序列的轉錄。啟動子也可另外含有其他識別序列，它們通常位于TATA盒的上游或5’端，被稱作上游啟動子元件，這些元件能夠影響轉錄速率。應認識到當鑒別了本文所公開的啟動子區域的核苷酸序列后，分離并鑒定位于本文所鑒別的特定啟動子區域上游的其它調控元件就屬于現有技術范圍了。因此，本文公開的啟動子區域可另外包含上游調控元件，如負責組織特異性和時間特異性表達的元件、調控組成型表達的元件和增強子等。
[0013]本文中的“組成型表達”是指目的基因在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續表達或變化很小這類基因的表達方式。本發明所提供的S0Y001P啟動子就是一個在植物的各個發育階段的根、莖、葉和花等組織器官中都有較強表達的組成型啟動子。
[0014]啟動子的活性和強度可以根據其驅動的報告基因的mRNA或蛋白質的表達量來測定。報告基因(importer gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來確定目的基因的表達調控特性。常用的報告基因有(6-葡萄糖苷酸酶基因GUS，和綠色熒光蛋白基因GFP。
[0015]本發明通過⑶S報告基因來檢測啟動子的活性和表達特性。根據⑶S基因檢測所用的底物不同，有三種檢測方法:組織化學法、分光光度法和熒光法(靈敏度為分光光度檢測法最高)，其中最為常用的是組織化學法。組織化學法檢測以5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷酸(X-Gluc )作為反應底物。將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡，若組織細胞轉入了 GUS基因，并表達出了 GUS酶蛋白，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍色產物，這是由其初始產物經氧化二聚作用形成的靛藍染料，它使各組織細胞中有⑶S表達活性的部位或位點呈現藍色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據染色深淺可反映出GUS活性的強弱。因此利用該方法可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個細胞內的表達情況。
[0016]本發明的實施案例中也包括DNA載體，該載體含有操作性連接于異源核苷酸序列上的啟動子，該啟動子含有本發明公開的序列，并可在植物細胞中驅動上述異源核苷酸序列進行表達。本發明的實施方案還提供了表達載體，以及在基因組中穩定包含上述DNA載體的植物或植物細胞。“操作性連接”指使異源核苷酸序列處于啟動子作用下的連接方式，也指將兩個核苷酸序列連接起來從而使每個DNA片段的編碼序列都保持在適當的閱讀框內。“異源核苷酸序列”指天然狀態下沒有與本文所述啟動子序列S0Y001P操作性連接的序列，對于植物宿主來說可以是同源的，或是異源的。
[0017]本文所公開的S0Y001P植物組成型表達啟動子及其變異體和片段可用于植物基因工程，例如制備轉化或轉基因植物，以產生目的表型。“轉化植物”或“轉基因植物”指在基因組內含有異源核苷酸序列的植物。通常轉化植物或轉基因植物基因組穩定含有這些異源核苷酸序列，可將該異源核苷酸序列穩定地遺傳給下一代。這些異源核苷酸序列可單獨或與重組DNA載體一起存在于基因組中。這里所述的“轉基因事件”包括任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物體部分或完整植物體，只要它們的基因型被外源核酸的存在而改變，包括通過轉基因操作而改變的起始宿主，以及通過這些起始宿主進行有性或無性繁殖所得的后代。這里所用的“轉基因事件”并不包括通過傳統植物種植方法或天然事件(例如隨機雜交、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發突變)改變了基因組(染色體或染色體外)的植物。
[0018]“轉基因事件”通過以下步驟獲得，使用外源DNA載體(含有核酸表達盒，其中含有本發明所提供的啟動子序列)轉化植物細胞，用基因組插入了外源DNA構建體的植物細胞再培養獲得大量植物體，根據插入的外源基因進行篩選獲得所需的陽性轉基因系。轉基因事件的典型表型特征是目的基因的表達。在遺傳水平上，“目的基因”是植物基因組組成的一部分。“轉基因事件”也指轉基因植物體與其它植物體進行雜交所得的含有外源DNA的后代。
[0019]本文的“植物”包括整株植物、植物組織器官(如葉、根、莖等)、種子、植物細胞，以及它們的后代。實施方案中轉基因植物的部分植株應理解為包括轉基因植物或其后代的植物細胞、原生質體、組織、愈傷組織、胚，及從轉基因植物或其后代長出的花、莖、果實、胚珠、葉或根等。
[0020]這里所用的“植物細胞”包括但不限于種子懸浮培養物、胚芽、分生組織區域、愈傷組織、葉、根、芽、配子、花粉、孢子體和小孢子。可用于本文所公開方法的植物種類包括所有可進行轉化的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。
[0021]本文所公開的啟動子·序列可在宿主植物中調控任何異源核苷酸序列的表達。因此，所述的異源核苷酸序列可以是操作性連接于本文所公開的啟動子之上的功能基因(編碼目的蛋白)。實施方案中的功能基因包括參與信號傳導調控的基因如轉錄因子、激酶等，持家基因如熱休克蛋白基因。更具體地說，轉基因的種類包括如，所編碼蛋白賦予植物耐受非生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、溫度、鹽和毒素(殺蟲劑和除草劑)等。或是所編碼蛋白賦予植物耐受生物逆境的抗性基因，如真菌、病毒、細菌、昆蟲和線蟲的侵害，以及由這些脅迫引起的疾病。表型的編碼包括改變植物中某個基因的表達，從而改變植物對病原體或昆蟲等的防御機制，或是提高植物對除草劑的抗性，根據環境改變植物的生長發育過程等。這些改變可通過在植物體內表達外源基因或提高內源特定基因的表達來獲得。或者是通過降低植物體內一個或多個內源基因的表達產物，如酶、轉運蛋白、輔因子等，通過影響植物的代謝機制來獲得相應的表型。
[0022]由上可見，可將任何目的基因操作性連接到實施方案中的啟動子序列上，并在植物體中進行表達。
[0023]其中根據RNA干擾技術(RNA interference, RNAi ),操作性連接于本文所公開的S0Y001P啟動子上的異源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反義序列。“反義核苷酸序列”指一段與靶基因核苷酸序列互補的雙鏈DNA分子。當導入到植物細胞中后，反義DNA序列的轉錄能阻止靶基因DNA序列的正常表達。反義核苷酸序列編碼的RNA轉錄產物可與靶基因轉錄生成的內源mRNA互補，并可與其雜交，由此，靶基因編碼的天然蛋白的合成就受到限制，從而獲得相應的表型。
[0024]下面通過【具體實施方式】，結合附圖對本發明做進一步詳細描述，但不以任何方式限制本發明的范圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為載體pHPG的結構示意圖。
[0026]圖2是表達載 體pHPG-S0Y001P的T-DNA區圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的啟動子；Tnos表不nos基因的終止子AUS表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的終止子；KpnI和SpeI分別表示限制性內切酶KpnI和SpeI的酶切位點；啟動子即為本發明所分離鑒定的組成型表達啟動子S0Y00IP。
[0027]圖3是S0Y001P驅動的⑶S基因在擬南芥的幼苗和花器官的表達情況；A、B、C分別代表三個不同的轉基因擬南芥的株系。
[0028]圖4是轉基因擬南芥的S0Y001P表達特性分析；圖為轉基因擬南芥⑶S基因在不同組織器官中的RT-PCR檢測，其中R代表根、S代表莖、L代表葉片、F代表花。
[0029]圖5是S0Y001P驅動的⑶S基因在煙草的根、莖和葉中的表達情況。
[0030]圖6是轉基因煙草的S0Y001P表達特性分析；圖為轉基因煙草⑶S基因在不同組織器官中的RT-PCR檢測，其中R代表根、S代表莖、L代表葉片。
【具體實施方式】
[0031]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物均由上海英駿生物技術公司合成，測序由北京華大基因完成，PCR試劑盒、載體構建過程中的核酸內切酶購自寶生物工程有限公司，PEASY-Tl連接試劑盒購自北京全式金生物技術公司，T4 DNA連接酶購自Promega公司，方法均參照試劑盒提供的方法進行。實驗中所用的載體pHPG由本實驗改造所得(載體PHPG的結構示意圖為圖1所示)，基本骨架來自于CAMBIA公司的PCAMBIA1303。
[0032]1.啟動子S0Y001P的分離和鑒定 設計克隆啟動子S0Y001P所需引物:
引物 1:5’ ggtaccATAATGCATGTGCCTGACCAG 3’
引物 2:5， actagtAGTTGCAGAGAAGAGAATCGAA 3’
引物I中序列ggtacc為KpnI的酶切位點，引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；引物2中序列actagt為SpeI的酶切位點，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0033]利用啟動子的正反向引物(其中帶下劃線部分的序列為啟動子序列)，以植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的大豆(黑農37)基因組DNA作為模板，進行擴增，反應條件是:950C預變性5分鐘；940C變性30秒；55 V退火30秒；72°C延伸I分鐘；30個循環；72°C延伸10分鐘。反應結束后，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產物連入PEASY-T1，篩選陽性克隆并進行測序驗證，結果表明:所擴增序列為S0Y00IP啟動子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0034]2.構建表達載體
將測序驗證已經插入S0Y001P啟動子序列的質粒用KpnI和SpeI雙酶切，連入同樣用KpnI和SpeI雙酶切的載體pHPG，挑取菌落PCR結果為陽性的菌落進行測序，測序驗證正確后，提取相應陽性克隆質粒，命名為pHPG-SOYOOlP。
[0035]所構建的表達載體的T-DNA區的圖譜如圖2所示，其中:LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的啟動子；Tnos表不nos基因的終止子；GUS表示gus蛋白基因；T35S表示35S基因的終止子；KpnI和SpeI分別表示限制性內切酶KpnI和SpeI的酶切位點；啟動子即為本發明實施例1中通過PCR克隆出的組成型表達啟動子。
[0036]3.農桿菌共轉化
利用熱激法將質粒PHPG-S0Y001P轉入農桿菌AGLO菌株，利用農桿菌介導法對擬南芥和煙草進行共轉化。
[0037]4.轉基因擬南芥苗的⑶S染色和活性測定
從轉基因擬南芥植株中挑選幾株幼苗，進行GUS活性檢測，將幼苗置于含有GUS染色緩沖液的EP管中，放于37°C溫箱溫育過夜，然后室溫條件下在無水乙醇中脫色保存。
[0038]結果如圖3所示，擬南芥幼苗呈現很強的表達活性，幼苗對應株系的花的GUS染色結果也呈現出很強的表達活性，說明S0Y001P啟動子驅動的⑶S基因在植物的各個組織器官中都有強的表達，是一個組成型表達啟動子
5.轉基因擬南芥的RT-PCR分析
為了進一步確定S0Y001P啟動子是否呈組成型表達，我們對其轉基因苗進行了 RT-PCR分析，收集轉基因擬南芥植株純系的根、莖、葉和花器官，提取RNA，反轉錄為cDNA作為模板，以擬南芥ACTIN基因作為內參照，分析S0Y001P啟動子驅動的GUS報告基因在轉基因擬南芥中的表達情況。
[0039]RT-PCR的檢測弓丨物是:
引物 3:5’ - TAATGTTCTGCGACGCTCAC -3’
【權利要求】
1.一種分離的組成型表達啟動子,其特征在于,所述啟動子包含SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID NO:1互補的核苷酸序列。
2.一種表達盒，其特征在于，所述表達盒包含權利要求1所述的組成型表達啟動子和待驅動的異源核苷酸序列。
3.—種表達載體,其特征在于,含有權利要求1所述的組成型表達啟動子。
4.一種制備轉基因植物或其衍生物的方法，其特征在于所述轉基因植物中包含權利要求2所述的表達盒。
5.權利要求4所述的方法，其中所述的植物為雙子葉植物。
6.權利要求5所述的方法，其中所述的雙子葉植物選自大豆或油菜。
7.權利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉基因植物的衍生物為所述轉基因植物的種子、組織或者細胞的至少一部分。
8.權利要求4所述的方法，其特征在于，通過農桿菌介導法，在植物的至少一部分中引入權利要求3所述的表達載體。
9.一種啟動子的應用，包括用于在植物中組成型表達與其操作性相連的目的基因，其特征在于，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
10.一種用于擴增權利要求1所述的啟動子的引物對，其特征在于，包括: 第一引物，所述第一引物包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和 第二引物，所述第二引物`包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
【文檔編號】A01H5/00GK103667296SQ201310731017
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年1月5日
【發明者】周君莉, 李早霞, 吳潔芳, 趙靜, 衛靜 申請人:北京未名凱拓作物設計中心有限公司