專利名稱：從毛白楊中分離的溫和的組成型表達啟動子及其應用的制作方法
從毛白楊中分離的溫和的組成型表達啟動子及其應用技術領域
發明涉及一種從植物中分離的啟動子，尤其涉及從毛白楊(Populus tomentosa Carr.)中所分離的溫和的組成型表達啟動子及其編碼的蛋白，本發明還涉及含有該溫和的組成型表達啟動子的重組植物表達載體以及宿主細胞，本發明進一步涉及它們在在構建轉基因植物、培育植物新品種、建立植物生物反應器以及解析基因功能等方面的應用，屬于植物組成型表達啟動子的分離及其應用領域。
背景技術：
啟動子是一段位于結構基因5’端上游區的DNA序列，能夠活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確結合并具有轉錄起始的特異性。啟動子決定著轉錄的方向和轉錄的效率， 同時對所使用的RNA聚合酶類型也起著決定性作用，是理解基因表達模式和轉錄調控機制的關鍵，是植物基因轉錄調控的中心。
按作用方式和功能，可將啟動子分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子。目前在植物基因工程研究中，組成型啟動子的應用最為廣泛。組成型啟動子控制的結構基因在所有組織部位中都能表達且表達水平沒有明顯變化，表達具有持續性， RNA和蛋白質表達量也相對恒定，不表現時空特異性，也不受外界因素的誘導。在雙子葉轉基因植物中使用最廣泛的組成型啟動子是花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子(Odell J T，Nagy F，Chua N H. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter[J]. Nature. 1985,313(6005) :810-812 ； Mitsuhara LUgaki MiHirochika H，et al. Efficient Promoter Cassettes for Enhanced Expression of Foregin Genes in Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants[J]. Plant and Cell Physiology. 1996，37 (1) :49-59)，單子葉轉基因植物主要使用來自玉米的 Ubiquitin 啟動子(Christensen A H，Sharrock R A，Quail P H. Maize polyubiquitin genes structure,thermal perturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation[J]. Plant Mol Biol. 1992,18(4) :675-689.)和水稻的 Actinl 啟動子(Mcelroy DiZhang WiCao J，et al. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation[J]. Plant Cell. 1990,2(2) :163-171.)，另外還有來自章魚堿合成酶基因Ocs啟動子和根癌農桿菌Ti質粒T-DNA區域的胭脂堿合成酶基因Nos啟動子(Angenon G，Vm Montagu M， Depicker A. Analysis of the stop codon context in plant nuclear genes[J]. FEBS Lett. 1990,271(1-2) :144_146·)。
雖然組成型啟動子為基因工程研究帶來了許多便利，但是由于它驅動目的基因在植物各組織部位中恒定且持續表達，不能從時間和空間上有效地調控目的基因的表達，會過度消耗細胞內的物質和能量，因此在其應用過程中暴露出一些問題(Gittins J R，Pellny T K，Hiles E R，et al. Transgene expression driven by heterologous ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small-subunit gene promotersin the vegetative tissues of apple (Malus pumila mill.)[J]. Planta. 2000,210(2) 232-MO.)，例如外源基因在整株植物表達，產生的大量異源蛋白或代謝產物在植物體內積累，打破植物的代謝平衡，不利于植物生長(Robinson D J. Environmental risk assessment of releases of trangenic plants containing virus-derived inserts[J]. Transgenic Res. 1996,5 :359-362.)。另外，重復使用同一種組成型啟動子驅動二個或二個以上的外源基因表達可能會引起基因沉默或共抑制現象(Kumpatla S P,Chandrasekharan M B, Iyer L M, et al. Genome intruder scanning and modulation systems and transgene silencing [J], Trends in Plant Science. 1998,3(3) :97-104.)。對于雙子葉植物，CaMV35S啟動子屬于強啟動子，它驅動的目的基因在植物體各組織部位均強烈表達，可能會對植物體造成上述不利影響，所以尋找一個較溫和的組成型表達啟動子，這樣既可以在轉基因植株內使外源基因有效發揮作用，同時又可以盡可能地降低對植株的不利影響， 以期更好地調控植物基因表達。發明內容
本發明目的之一是提供一種從毛白楊(Populus tomentosa Carr.)中所分離的溫和的組成型表達啟動子及其編碼蛋白。
本發明目的之二是提供含有上述組成型表達啟動子的表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞。
本發明目的之三是將所述的組成型表達啟動子以及含有該啟動子的表達載體應用于調控異源基因在植物中的轉錄或表達。
為實現上述目的，本發明一方面提供了一種從毛白楊中所分離的溫和的組成型表達啟動子，其多核苷酸序列為(a)或(b)所示
(a)、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列；
(b)、與SEQ ID NO 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷酸仍具有啟動子的功能或活性。
優選的，本發明所述的從毛白楊(Populus tomentosa Carr.)中所分離的溫和的組成型表達啟動子為SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列。
為了研究本發明從毛白楊(Populus tomentosa Carr.)中所分離的PtMCPpro序列(SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列)的功能或活性，本發明將PtMCPpro序列與GUS可操作的連接，構建得到PtMCPpro: :GUS植物表達載體，采用花序浸染法轉化擬南芥，獲得轉基因植株，進而進行⑶S組織化學染色和⑶S活性分析，對PtMCPpr0表達特性進行研究。轉基因擬南芥不同器官中的表達分析結果顯示，PtMCPpr0能夠驅動GUS基因在成熟轉基因擬南芥的根，莖，葉，花，角果等各個組織部位中表達，表達量相互有差異，但表達強度均低于內參ACTIN2。轉基因擬南芥的GUS染色和活性測定表明PtMCPpro驅動的GUS基因在幼苗的根、莖、子葉、真葉表達，但是表達強度弱于陽性對照CaMV35Spr0驅動的GUS基因表達。在成熟苗中，PtMCPpro驅動的⑶S基因在根、莖、蓮座葉、葉、花等各個組織部位表達，表達強度弱于陽性對照CaMV35Spro驅動的⑶S基因表達。試驗結果證實，本發明所分離的PtMCPpro 序列為組成型啟動子，表達強度明顯低于CaMV35Spr0啟動子，具有溫和性。
本發明的另一方面是提供由上述從毛白楊(Populus tomentosa Carr.)中所分離的溫和的組成型表達啟動子所編碼的蛋白或蛋白變體。
本發明所述的蛋白變體可由遺傳多態性或人為操作產生，這些操作方法通常為本領域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備轉錄因子的氨基酸序列變體或片段，其中所述誘變或改變多核苷酸的方法為本領域所習知。保守的取代是將一種氨基酸殘基替換成具有相似性質的另一種氨基酸。
本發明所述的啟動子及其編碼蛋白包括天然存在的序列和變體兩種形式。“變體” 意指基本相似的序列，對于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個或多個位點處一個或多個核苷酸的缺失、插入或/和替換。對于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過現有的分子生物學技術來鑒定。變體多核苷酸還包括合成來源的多核苷酸，例如采用定點誘變或者是通過重組的方法得到的多核苷酸變體。
本發明進一步提供了含有所述組成型表達啟動子的重組植物表達載體以及含有該重組植物表達載體的宿主細胞。
將本發明所述組成型表達啟動子與待轉錄的異源性DNA序列進行可操作的連接， 即得到在植物體的各種組織以及各個發育階段溫和的轉錄或表達所述異源性DNA序列的重組植物表達載體。可以采用任何植物轉化方法將所述的重組植物表達載體引入到目標植物(所述的目標植物包括被子植物、裸子植物；單子葉植物和雙子葉植物；草本植物、木本植物和藤本植物；一年生植物和多年生植物；水生植物和陸生植物等)細胞、組織或器官中，得到轉化體；再由轉化體通過植物組織培養方法再生得到完整的植株及其無性系或其后代；所述的轉化方法包括Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、顯微注射、電穿孔法、微粒轟擊、農桿菌介導的轉化以及原生質體轉化等。
本發明所分離的組成型表達啟動子的主要應用
本發明組成型表達啟動子在構建轉基因植物、培育植物新品種、建立植物生物反應器以及解析基因功能等方面有廣泛的應用。
將本發明的組成型啟動子可操作的與待轉錄的異源性DNA序列相連接，可以指導或調控待轉錄的異源基因在植物細胞或組織中進行溫和的轉錄或表達，得到具有預期性狀的轉基因植物或植物新品種(例如抗病、抗蟲、抗除草劑或抗逆的植物新品種)。例如，將本發明的組成型表達啟動子可操作的與待轉錄的異源DNA序列相連接(其中，該待轉錄的異源DNA序列還與3'非編碼區可操作的連接，所述的3'非編碼區可以包含終止子序列、 mRNA切割序列等。)得到可以在植物組織或植物細胞中溫和表達該待轉錄的異源DNA序列的植物表達載體。待轉錄的異源DNA序列不受限制，可以是結構基因、結構基因的反義基因、調節基因、調節基因的反義基因或者能干擾內源基因表達的小RNA等；所述的待轉錄的異源DNA序列可以是來自非靶基因物種的核酸分子或基因，或者是起源于或存在于相同的物種中經過人工改造或修飾的核酸分子或基因，譬如已經存在于植物細胞中的基因，來自另一植物的基因，來自不同生物體的基因，外部產生的基因(含基因的反義信息的核酸分子)以及人工修飾或改造的基因序列等。通常來說，待轉錄的異源DNA序列多為提供與下列期望特征有關的DNA序列，包括植物形態、生理、生長和發育、產量、營養強化、病蟲害抗性、環境或化學耐受性等，為植物體提供有益的性狀，例如除草劑抗性，增加的產量或生物量，病蟲害的控制、高蛋白的生產、環境脅迫抗性的改善、固氮作用等。該待轉錄的異源DNA序列可以包括具有RNA活性的序列或產生多肽產物的序列等，例如，可以是反義序列、RNAi 序列、核酶序列、剪接體、氨基酸編碼序列以及它們的片段。
所述的植物表達載體中還可含有選擇標記基因。
另外，可以將本發明的組成型啟動子與標記序列可操作的連接以確定標記序列的活性，所述的標記序列通常包括提供抗生素抗性或除草劑抗性的基因，諸如四環素抗性基因、潮霉素抗性基因；草苷膦或草丁膦抗性基因等。
本發明的組成型啟動子還可用于調控植物代謝或分解代謝過程，這些過程包括但不限于次級產物代謝、氨基酸合成、種子蛋白質儲存、生物量增加等。
本發明所渉及到的術語定義
除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。雖然在本發明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現在描述優選方法、裝置和材料。
術語“嚴謹雜交條件”意指在所屬領域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常，在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高(例如超過本底至少2倍。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環境條件下將會不同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探針100%互補的靶序列。對于核酸雜交的詳盡指導可參考有關文獻(Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, “ Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)。更具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規定離子強度 PH下的熱熔點(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態下50%與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度(在指定離子強度、PH和核酸濃度下)(因為目標序列過量存在，所以在1下在平衡狀態下50%的探針被占據)。嚴謹條件可為以下條件其中在pH 7.0到8.3下鹽濃度低于約1. OM鈉離子濃度，通常為約0. 01到1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對于短探針(包括(但不限于)10到50個核苷酸)而言為至少約30°C，而對于長探針(包括 (但不限于)大于50個核苷酸)而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩定劑來實現。對于選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴謹雜交條件可如下50%甲酰胺，5乂33(和SDS，在42°C 下培養；或5XSSC，1% SDS，在65°C下培養，在0. 2 X SSC中洗滌和在65°C下于0. SDS中洗滌。所述洗滌可進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。
術語“宿主細胞”意指包含本發明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。
術語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括 PNA(肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并6密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡并密碼子取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；和 Cassol 等人，(1992) ；Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮口， 針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術語適用于天然產生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經由共價肽鍵連接。
術語“組成型啟動子”該啟動子能夠在幾乎所有的植物組織以及幾乎所有的發育階段中指導或調控所控制的開放閱讀框(ORF)在植物細胞或組織中的轉錄或表達，具有持續性、不表現時空特異性。
術語“異源性DNA序列”指該DNA序列對該特定的宿主細胞而言屬于外來的來源， 或若來自相同的原始來源但對該原始序列進行了修飾或改造。
術語“內源基因”來自宿主本身的基因，包括DNA或RNA序列。
術語“選擇標記基因”該基因在植物細胞中的表達給予該細胞選擇優勢，用這些選擇性標記基因所轉化的這些細胞所具有的選擇優勢可以是由于它們與非轉化細胞的生長相比具有在陰性選擇劑(如抗菌素或除草劑)的存在下生長的能力。選擇標記基因還指多種基因的組合，它們在植物細胞中的表達給予該細胞陰性以及陽性的選擇優勢。
“可操作的連接”指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。
術語“轉化”將異源性DNA序列引入到宿主細胞或有機體的方法。
術語“表達”內源性基因或轉基因在植物細胞中的轉錄和/或翻譯。
術語“編碼序列”轉錄成RNA的核酸序列。
術語“植物表達載體”一種或多種用于實現植物轉化的DNA載體；本領域中這些載體常被稱為二元載體。二元載體連同具有輔助質粒的載體是大多常用于土壤桿菌介導轉化的。二元載體通常包括T-DNA轉移所需要的順式作用序列、經工程化處理以便能夠在植物細胞中表達的選擇標記物，待轉錄的異源性DNA序列等。
圖1毛白楊PtMCPpro的克隆與酶切鑒定；A :PCR產物，B 重組質粒的雙酶切鑒定； M :lkb DNA ladder，1 :PCR產物，2 重組質粒的Sac I和Kpn I雙酶切產物。
圖2毛白楊PtMCPpro序列分析。
圖SpftOtest質粒的結構示意圖。
圖4PtMCPpro ⑶S植物表達載體構建；A =PtMCPpro ⑶S植物表達載體雙酶切鑒定；B =PtMCPpro:⑶S植物表達載體的結構示意圖。
圖5轉基因植株的分子檢測及PtMCPpro表達特性分析；A =Tl代轉基因擬南芥⑶S 基因PCR檢測；B =Tl代轉基因擬南芥⑶S、ACTIN2基因的RT-PCR檢測；C =PtMCPpro的表達特性分析(N，代表野生型；P，代表陽性質粒;A2，A3，A4，A5，A7，A8，A9，A11分別代表不同的轉基因株系；R，S, L, F, Si 分別代表 Root, Stem, Leaf, Flower, Silique)。
圖6PtMCPpro驅動的⑶S基因在擬南芥不同組織器官中的表達及⑶S活性測定； a, e :CaMV35Spro, b, f :WT, c, g =PtMCPpro 的轉基因株系 A2，d, h =PtMCPpro 的轉基因株系 A7，i 不同株系⑶S活性測定。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
生物材料與試劑
1. 1生物材料
用于提取植物基因組DNA的毛白楊無性系TC1521無菌組培苗和遺傳轉化受體植物哥倫比亞生態型擬南芥(Arabidopsis thaliana L. ecotype Columbia，Col-Ο)均取自林木育種國家工程實驗室；大腸桿菌菌株DH5 α、根癌農桿菌菌株GV3101 (購自Biovector Science Lab. Inc.中國質粒載體菌株基因庫)由本發明人實驗室保存；克隆載體pMD 19-T 購自TaKaRa公司。
1. 2主要試劑
植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒以及普通質粒小提試劑盒均購自北京天根公司，LA Taq酶、核酸分子量標準(DNA Marker Ladder)、 T4-DNA連接酶、限制性內切酶Me I和Kpn I等購自TaKaRa公司；⑶S ( β -葡萄糖苷酶，β-glucuronidase)組織化學染色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯 (X-Gluc)、⑶S活性測定底物4-甲基傘形酮酰-β -D-葡萄糖醛酸苷酯G-MUG)購自Sigma 公司。
實施例1毛白楊溫和組成型啟動子PtMCPpro序列的克隆與分析
1. 1毛白楊溫和組成型啟動子PtMCPpro序列克隆
按照北京天根公司植物基因組DNA提取試劑盒的操作流程，以毛白楊無性系LM50 無菌組培苗的葉片為材料提取基因組DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。PCR擴增所用引物包括
上游引物5，-CTACGAGCTCTACTAAATAAATATATAA-3，，
下游引物5，-ATGGTACCATCTATCTGCCCCCTTGTC-3，，
在上下游引物的5’端分別加入Me I和Kpn I酶切位點。20 μ L PCR反應體系包括2 μ L(IOOng)毛白楊基因組DNA，2y L IOXLA PCR 緩沖液，1. 6 μ U2. 5mmol/L) dNTP， 0. 4μ L 10pm/yL 上游引物，0. 4yL IOpm/μ L 下游引物，0. 2 μ L LA Taq DNA 聚合酶(5U/ UL)，13. 4μ L ddH20。PCR 反應循環條件為 94°C預變性 3min，94°C變性 30s，57°C退火 30s， 68°C延伸2. 5min，35個循環，然后68°C延伸IOmin0
PCR產物經1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過PCR擴增得到大小約為2. 6kb的片段(圖1A)，切下目的條帶，使用凝膠回收試劑盒(天根公司)回收、純化目的片段。將純化產物與pMD19-T載體連接，再轉化DH5 α感受態細胞，接種到含氨芐(100mg/L)的LB平板上37°C培養14-16h，挑取單菌落進行PCR，并對重組質粒進行限制性內切酶(Sac I和Kpn I)酶切鑒定(圖1B)。證明該啟動子片段已克隆到PMD19-T載體上得到PtMCP-T重組質粒。 測序結果表明，該序列長度為^561bp。
1. 2PtMCPpro序列的生物信息學分析
使用TSSP-TCM軟件對PtMCPpr0序列進行分析，預測其轉錄起始位點為A。聯合使用PLACE和Plant CARE在線軟件分析序列，預測其含有的主要啟動子基本轉錄元件包括 TATA-box 位于-19bp 處，CAAT-box 分別位于 _71bp，TATC-box 位于 _28bp 處，GARE-motif 位于-473bp 處，BoxI 位于 _587bp 處，MBS 位于-60lbp, TC-rich repeats 位于 _620bp 處， Box4 位于-737bp 處，GAG-motif 位于處，TCA-eIement 位于 _1008bp 處，CAT-box 位于-1104bp, Spl 位于-1466bp 處，TCT-motif 位于-1527 處，LTR 位于 _1613bp 處，Box-Wl 位于-1689和-1833處，另外還有2個雙相連作用元件ABRE/G_box位于_543bp處、_576bp 處和-1628bp 處，CCGTCC-box/A-box 位于 _1334bp 處(圖 2)。
其中，TATA-box為核心啟動子元件，保證轉錄精確開始；CAAT-box可以控制轉錄的效率和頻率；TATC-box和GARE-motif為赤霉素響應相關順式作用元件；Boxl、Box4、 GAG-motif、Spl、TCT-motif、G-box為光響應元件；MBS為與干旱誘導相關的MYB結合位點； TC-rich repeats為抗病和逆境脅迫作用元件；TCA-element為水楊酸響應順式作用元件； CAT-box為與分生組織表達相關順式作用元件；LTR為低溫響應順式作用元件；Box-Wl為真菌誘導元件；ABRE為脫落酸響應作用元件。
試驗例1溫和組成型啟動子PtMCPpro的應用效果試驗
1. pPtMCP ⑶S植物表達載體的構建
將pProtest質粒(pProtest質粒的結構示意圖為圖3所示)進行&ic I和Kpn I雙酶切，同時將PtMCP-T重組質粒進行Me I和Kpn I雙酶切，回收純化目的片段，通過 T4-DNA連接酶連接，并將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，新的重組質粒經氨芐霉素(100mg/L)和PCR篩選后，進行雙酶切驗證(圖4A)，獲得植物表達載體pPtMCP:⑶S， CaMV35Spro::⑶S植物表達載體作為陽性對照(圖4B)。采用液氮凍融法，將表達載體 pPtMCP: :GUS轉入根癌農桿菌GV3101中，并進行菌落PCR鑒定，獲得陽性克隆，完成工程菌制備。
2.擬南芥的遺傳轉化
通過液氮凍融法將pPtMCP:⑶S表達載體轉化到農桿菌GV3101中，利用花序浸染法轉化擬南芥，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培養基篩選，獲得抗性植株。
植物表達載體PtMCPpro:⑶S在植物中表達卡那霉素抗性基因，將侵染后所收獲的Ttl代擬南芥種子均勻播種在含有50mg/L卡那霉素的V2MS培養基上，在篩選培養基上萌發并存活的植株即為T1代陽性植株，其余假陽性的植株雖然能長出子葉，但是均不能長出真葉并且逐漸死亡，PtMCPpro:⑶S轉基因擬南芥篩得M株陽性植株，從中選取8個轉基因株系用于研究。
3.轉基因植株的分子檢測
提取擬南芥抗性植株基因組DNA，以基因組DNA為模板，用標記基因⑶S特異引物 GUS-F :5’ -GTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACC-3，；GUS-R :5’ -CTGCCCAACCTTTCGG TATAAAGAC-3，進行PCR檢測，PCR反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，61°C退火15s，72°C延伸 20s, 30個循環，然后72°C延伸5min。能擴增到239bp的⑶S基因片段的特異條帶，初步推斷為轉基因陽性植株。提取擬南芥抗性植株總RNA并反轉錄cDNA第一鏈，將第一鏈cDNA 稀釋5倍備用，用標記基因GUS特異引物進行cDNA稀釋產物為模板的PCR檢測，反應條件同上，同時以擬南芥ACTIN2作為內參基因，特異引物ACTIN2-F
5，-AAGCACAATCCAAGAGAGGTATTC-3，；ACTIN2-R
5，-TACATAGCGGGAGAGTTAAA GGTC-3’，目的片段大小為 219bp，在模板量一致的情況下，對⑶S和ACTIN2基因進行RT-PCR檢測。
以擬南芥抗性植物基因組DNA為模板對上述T1代轉基因植株進行PCR檢測，結果顯示轉基因植株能擴增得到239bp⑶S基因特異條帶(圖5A)，這說明目的片段可能已經整合進入植物基因組。挑選的8個株系均有特異性擴增條帶，初步證實這8個擬南芥株系為轉基因陽性植株。
以擬南芥抗性植株cDNA稀釋產物為模板，同時以擬南芥ACTIN2作為內參基因，在模板量一致的情況下對⑶S、ACTIN2基因進行RT-PCR檢測，結果顯示，8個株系的⑶S表達豐度均弱于ACTIN2表達豐度，但不同株系間，GUS基因表達豐度有所差異(圖5B)。
4. PtMCPpro驅動⑶S基因在轉基因擬南芥不同器官中的表達分析
隨機選取8個擬南芥株系的其中一個株系A8作為研究對象，提取轉基因擬南芥根，莖，葉，花，角果等各組織部位RNA，并反轉錄成cDNA第一鏈，以cDNA稀釋產物為模板，進行RT-PCR檢測；RT-PCR檢測結果顯示=PtMCPpro能夠驅動⑶S基因在成熟轉基因擬南芥的根，莖，葉，花，角果等各個組織部位中表達，表達量相互有差異，但表達強度均低于內參 ACTIN2 (圖 5C)。
5.轉基因擬南芥的GUS染色和活性測定
按照Jefferson等的方法進行⑶S組織化學染色分析，在37°C避光染色過夜，染色后的各組織用75%乙醇脫色2- 至無色，在體視顯微鏡下觀察并拍照記錄擬南芥各個組織部位的⑶S染色結果。按照Jefferson等和Bradford等的方法進行⑶S活性測定， GUS活性測定在pH 7. 0的磷酸緩沖液中進行，反應時間為30min。反應中止后在激發波長 365nm,發射波長455nm條件下進行熒光測定。所示活性測定結果為3次獨立試驗測定的平均值。
隨機挑選兩個轉基因株系(A2和A7)作為研究對象，對轉基因擬南芥幼苗和成熟苗進行⑶S組織化學染色分析，結果顯示，轉PtMCPpro:⑶S幼苗的根、莖、子葉、真葉等組織部位呈現藍色(圖6c，d)，但顏色弱于轉CaMV35Spro:⑶S幼苗各組織部位呈現的藍色 (圖6a)。轉PtMCP pro:⑶S成熟苗的根、莖、蓮座葉、葉、花等組織部位均被染成藍色(圖 6g，h)，同樣地，顏色弱于陽性對照轉CaMV35Spr0:⑶S成熟苗各組織部位呈現的藍色(圖 6e)。這說明PtMCPpr0驅動的⑶S基因在幼苗的根、莖、子葉、真葉表達，但是表達強度弱于陽性對照CaMV35Spro驅動的GUS基因表達。在成熟苗中，PtMCPpro驅動的⑶S基因在根、 莖、蓮座葉、葉、花等各個組織部位表達，表達強度弱于陽性對照CaMV35Spr0驅動的GUS基因表達。整體試驗結果顯示，不同株系⑶S活性有所差異，但均遠遠低于CaMV35Spro驅動的⑶S活性(圖6i)。所以可判定本發明所分離的PtMCPpr0序列為組成型啟動子，表達強度明顯低于CaMV35Spro，具有溫和性。10
權利要求
1.一種從毛白楊(Populus tomentosa Carr.)中分離的組成型啟動子，其特征在于，其多核苷酸序列為(a)或(b)所示(a)、SEQID No. 1所示的多核苷酸序列；(b)、與SEQID NO :1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸序列，該多核苷酸序列仍具有啟動子活性。
2.權利要求1所述的組成型啟動子所編碼的蛋白。
3.—種表達盒，其特征在于，包括含有權利要求1所述的組成型啟動子和待轉錄的異源基因序列。
4.含有權利要求1所述的組成型啟動子的重組植物表達載體。
5.按照權利要求4所述的重組植物表達載體，其特征在于，包含權利要求1所述的組成型啟動子和待轉錄的異源基因序列；其中，組成型啟動子和待轉錄的異源基因序列可操作的相連接，待轉錄的異源基因序列位于組成型啟動子的下游。
6.按照權利要求5所述的重組植物表達載體，其特征在于所述的待轉錄的異源基因包括結構基因、結構基因的反義基因、調節基因、調節基因的反義基因或者能干擾內源基因表達的小RNA。
7.含有權利要求4-6任何一項重組植物表達載體的宿主細胞。
8.權利要求1所述的組成型啟動子在構建轉基因植物或培育植物新品種中的應用，包括將權利要求1所述的組成型啟動子和待轉錄的異源基因序列可操作的連接后轉化到植物細胞、組織或器官中得到轉化體；將轉化體通過組織培養再生得到完整的植株或無性系。
9.權利要求1所述的組成型啟動子在建立植物生物反應器中的應用。
10.權利要求1所述的組成型啟動子在分析基因或標記物功能中的應用。
全文摘要
本發明公開了從毛白楊中分離的溫和的組成型表達啟動子及其應用。本發明所述溫和的組成型表達啟動子為SEQ ID No.1所示多核苷酸序列。本發明還公開了含有所述組成型表達啟動子的重組植物表達載體及宿主細胞。將本發明組成型啟動子與GUS基因可操作的連接后轉化到擬南芥中，獲得轉基因植株；GUS組織化學染色和GUS活性分析證實，本發明所分離的啟動子為組成型啟動子，指導GUS基因在植物各組織及發育各階段進行溫和的轉錄或表達。本發明進一步公開了所述組成型啟動子以及含有該組成型啟動子的重組植物表達載體在構建轉基因植物、培育植物新品種、建立植物生物反應器以及解析基因功能等方面的應用。
文檔編號C12N1/19GK102517286SQ20111043991
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者葉梅霞, 安新民, 陳仲 申請人:北京林業大學