專利名稱：一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法
技術領域：
本發明涉及一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法，特別涉及一種用二氧化碳(CO2)調節培養液pH值控制紅球藻孢子的形成、蝦青素積累和循環使用培養基的方法。
背景技術：
蝦青素(Astaxanthin)因具有優越的著色性能和極強的抗氧化性而備受國內外廣大研究者的關注。目前蝦青素最主要的用途是在水產養殖中用作色素，特別是在三文魚和鱒魚的養殖業中，其次是作為食品添加劑和保健品，在醫藥方面的應用也具有很大的潛力。據最新報道，2001年三文魚養殖產量已突破100萬噸。另外，加拿大、智利和日本將成為太平洋三文魚的主要生產國(BjorndaleT.1990)。目前有95％以上的蝦青素是人工合成的，其售價約為2000-2500美元/公斤，每年市場消費量大約為2億美元(R.Todd Lorenz et al.2000)。但人工合成的產物是類似于類胡蘿卜素的成分(Mayne S.T.et al.1988；Storebakken T.et al.1984)，不能有效地被魚類吸收利用。并且美國的食品和藥品管理委員會(FDA)不允許人工合成的蝦青素添加在三文魚的飼料中(Sinnot R.，1988)。
目前蝦青素的來源有4條途徑(1)化學合成 化學合成的蝦青素產物主要是類似于類胡蘿卜素的成分(Mayne S.T.et al.1988；Storebakken T.et al.1984)。近年來，在魚的飼料中使用人工合成色素受到越來越多的限制(Sinnot R.，1988)。
(2)從甲殼類動物中提取甲殼類動物的甲殼中含有蝦青素，但含量很低。并且這些甲殼中灰分幾丁質的含量較高，限制了蝦青素的提取和利用。
(3)利用真菌生產真菌類如紅發夫酵母菌(Phaffia rhodozyma)野生株系中含有0.05％的蝦青素；某些突變株系的蝦青素含量可達細胞干重的0.218％(John A.B.et al.1997)。真菌中蝦青素的含量普遍很低。利用酵母菌生產蝦青素除產量低外，發酵成本高也是不利于大規模生產的原因。
(4)利用微藻生產雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)細胞中蝦青素含量很高，一般達干重的1.5-3.0％；根據最新報道蝦青素含量可占生物量的6-8％左右(Tsavalos et al.，1992)。雨生紅球藻細胞內天然蝦青素的含量相對較高，而且與天然生長的三文魚體內的類胡蘿卜素結構完全相同(GoodwinT.W.1984；Steven D.M.1948；Fex D.L.1957；Khare A.et al 1973)，因此，利用紅球藻生產蝦青素具有巨大的商業及經濟價值。
目前國外大規模培養都采用二步法。所謂的二步法是紅球藻的營養生長和蝦青素累積人為地分為兩個階段，這兩個階段分別在不同的光生物反應器中，不同的培養條件(包括培養基)下進行的，維持營養生長的條件和誘導蝦青素累積的條件有很大的不同。二步法的優點是解決了紅球藻細胞生長繁殖與孢子形成、積累蝦青素所需條件不同的矛盾，其不足之處在于(1)工藝復雜；(2)誘導蝦青素累積的措施會導致采收后的培養液不能重復使用，致使生產過程中大量排出廢水，對水環境有污染作用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種培養雨紅球藻生產蝦青素的方法，培養基配制合理，方法簡便，生產周期短，培養基循環使用，解決了培養過程中廢水排放的問題。
為了達到上述目的，本發明采用如下技術措施。
1.配制培養基(MHM)培養基配方如下硝酸鉀(KNO3) 0.4-0.7g/L磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.08-0.12g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.08-0.12g/L硫酸鈣(CaSO4·2H2O) 0.04-0.06g/L三氯化鐵(FeCL3·6H2O) 2.38-2.50×10-4g/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)1.85-3.7×10-4g/L氯化鋅(ZnCL2) 3.7-5.0×10-6g/L硼酸(H3BO3) 5.5-8.0×10-5g/L氯化鈷(CoCL2·6H2O) 4.8-9.6×10-6g/L硫酸銅(CuSO4·5H2O) 6.4-8.5×10-6g/L氯化錳(MnCL2·4H2O) 3.8-7.6×10-6g/L鉬酸銨((NH4)6Mo7O24·4H2O)3.0-5.0×10-5g/L維生素B12(Vitamin B12)1.0-3.0×10-6g/L生物素(Biotin) 1.0-3.0×10-6g/L2.一步法培養利用雨生紅球藻生產蝦青素，采用一步法。即雨生紅球藻的營養細胞的生長、孢子轉化和蝦青素累積是在同一個光生物反應器、同一培養基中完成，通過調控培養液的pH值促進孢子轉化和蝦青素累積。培養周期均為12-15天，前5-6天是營養生長期，藻細胞持續進行細胞分裂，以指數形式增殖，達到最大密度。后7-9天為孢子轉化與蝦青素積累期。兩個階段自然連貫。紅球藻在12-15天內完成營養生長、孢子轉化和蝦青素積累的全過程。
3.循環使用培養基3.1回收培養基的處理回收上一次采收后的培養基，用活性碳處理回收的培養基，活性碳的用量為0.2-1.0g/L，活性碳處理時間為2-5小時，過濾得到澄清的水液。活性炭處理和過濾的作用有2個(1)吸附培養基中的有機物。(2)去除雜質，包括剩余的藻細胞、少量原生動物和菌類；3.2重新配制培養基向過濾得到的澄清水液中加入培養基配方中的各種化學物質，每種的用量為原配方的80％，得到新的培養基，用于下一次培養。
4.分階段調控培養液的pH值在培養的前期(5-6天)，將培養液的pH值調節在7-8.5的范圍內，提供有利于細胞快速生長繁殖的條件，使紅球藻的生物量快速增長。在培養的后期(7-9天)，將培養液的pH值提高到8.5-10.0的范圍內，促進孢子的形成和蝦青素積累。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果1.培養基重復使用，減少生產過程的廢水排放，保護環境；2.工藝簡便，整個培養過程在一個光生物反應器和一種培養基中完成；3.生產周期短，12-15天內內完成營養生長、孢子轉化和蝦青素積累的全過程。
4.產量高，質量好，紅球藻孢子產量大于1克(干重)/升，孢子中蝦青素含量2-3％(孢子產量和蝦青素含量隨不同的藻種(品系)變化)。
5.用二氧化碳(CO2)調節培養液pH值控制紅球藻孢子的形成和蝦青素積累，簡單易行，經濟高效。
具體實施例方式
1.配制培養基環形培養池中放入20cm水，體積為600升，向其中加入各種營養成分及其濃度如下硝酸鉀(KNO3) 0.5g/L磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.1g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.1g/L硫酸鈣(CaSO4·2H2O) 0.05g/L三氯化鐵(FeCL36H2O)2.43×10-4g/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2) 1.88×10-4g/L氯化鋅(ZnCL2)4.1×10-6g/L硼酸(H3BO3) 6.1×10-5g/L氯化鈷(CoCL2·6H2O) 5.1×10-6g/L硫酸銅(CuSO4·5H2O) 6.6×10-6g/L氯化錳(MnCL2·4H2O) 4.1×10-6g/L鉬酸銨((NH4)6Mo7O24·4H2O) 3.8×10-5g/L
維生素B12(Vitamin B12) 2.0×10-6g/L生物素(Biotin) 2.5×10-6g/L2.接種將旺盛生長的紅球藻綠色游動細胞接種到配制好的培養基中，使細胞密度達到5×104cells/ml左右；3.培養培養過程光照采用自然光；利用機械攪拌使培養液保持均勻的流動；溫度調控在15-28℃范圍內；在培養的前6天，通過向培養液中通二氧二碳(CO2)，將培養液的pH值調節在7-8.5的范圍內。在這一階段內，紅球藻細胞快速生長繁殖，生物量快速增長，藻液呈綠色。
4.誘導蝦青素的積累從培養的第7天開始，控制通入二氧化碳(CO2)的頻率和數量將培養液的pH值調節在8.5-10.0的范圍內。在這一階段內，紅球藻游動細胞逐漸轉化為孢子，蝦青素大量積累。藻液顏色由綠色變為黃綠色，進一步變為桔紅色，再變為紅色。
5.采收紅球藻培養進行到第12天，培養液中95％的細胞轉化為孢子，孢子內充滿了紅色的蝦青素，藻液呈深紅色，即可采收。將藻液靜置，紅球藻孢子很快沉淀下來，收集上清液備用，孢子在低于100℃的溫度下干燥。
6.培養基的重新配制收集的上清液加入0.5g/L活性碳處理3小時、過濾，得到澄清的液體600升，再向其中加入各種營養成分配制成新的培養基，以備下一次培養使用。加入的營養成份及其濃度如下硝酸鉀(KNO3) 0.4g/L磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.08g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.08g/L硫酸鈣(CaSO4·2H2O) 0.04g/L三氯化鐵(FeCL36H2O) 1.94×10-4g/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2) 1.5×10-4g/L氯化鋅(ZnCL2) 3.28×10-6g/L硼酸(H3BO3) 4.88×10-5g/L氯化鈷(CoCL2·6H2O) 4.08×10-6g/L硫酸銅(CuSO4·5H2O) 5.28×10-6g/L氯化錳(MnCL2·4H2O) 3.28×10-6g/L鉬酸銨((NH4)6Mo7O24·4H2O) 3.04×10-5g/L維生素B12(Vitamin B12) 1.6×10-6g/L
生物素(Biotin)2.0×10-6g/L7.培養基的循環使用配制好的培養基的使用方法與第一次的培養基相同。經過接種—培養—誘導蝦青素的積累—采收—培養基回收—處理—重新配制，又成為新的培養基，如此循環，培養基至少可以循環使用6次。
權利要求
1.一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法，包括下列步驟A、配制培養基硝酸鉀 0.4-0.7g/L磷酸氫二鉀 0.08-0.12g/L硫酸鎂 0.08-0.12g/L硫酸鈣 0.04-0.06g/L三氯化鐵2.38-2.50×10-4g/L乙二胺四乙酸二鈉 1.85-3.7×10-4g/L氯化鋅 3.7-5.0×10-6g/L硼酸5.5-8.0×10-5g/L氯化鈷 4.8-9.6×10-6g/L硫酸銅 6.4-8.5×10-6g/L氯化錳 3.8-7.6×10-6g/L鉬酸銨 3.0-5.0×10-5g/L維生素B121.0-3.0×10-6g/L生物素 1.0-3.0×10-6g/LB、接種將紅球藻綠色游動細胞接種到配置好的培養基中，使細胞密度達到5×104cells/ml；C、培養培養過程光照采用自然光，利用機械攪拌使培養液保持均勻的流動，溫度調控在15-28℃范圍內，在培養的前6天，通過向培養液中通二氧化碳，將培養液的pH值調節在7-8.5；D、誘導蝦青素的積累從培養的第7天開始，控制通入二氧化碳的頻率和數量將培養液的pH值調節在8.5-10.0，在這一階段內，紅球藻游動細胞逐漸轉化為孢子，蝦青素積累；E、采收紅球藻培養進行到第12天，培養液中95％的細胞轉化為孢子，孢子內充滿了紅色的蝦青素，藻液呈深紅色，即可采收，將藻液靜置，紅球藻孢子沉淀下來，收集上清液備用，孢子在低于100℃的溫度下干燥；F、培養基的重新配制收集的上清液首先經過活性碳處理、過濾，得到澄清的液體，再向其中加入各種營養成分配制成新的培養基，以備下一次培養使用；G、培養基的循環使用。
2.根據權利要求1所述的一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法，其特征是配制的培養基硝酸鉀 0.5g/L磷酸氫二鉀 0.1g/L硫酸鎂 0.1g/L硫酸鈣 0.05g/L三氯化鐵 2.43×10-4g/L乙二胺四乙酸二鈉1.88×10-4g/L氯化鋅 4.1×10-6g/L硼酸 6.1×10-5g/L氯化鈷 5.1×10-6g/L硫酸銅 6.6×10-6g/L氯化錳 4.1×10-6g/L鉬酸銨 3.8×10-5g/L維生素B122.0×10-6g/L生物素 2.5×10-6g/L。
3.根據權利要求1所述的一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法，其特征是培養基的重新配制硝酸鉀 0.4g/L磷酸氫二鉀 0.08g/L硫酸鎂 0.08g/L硫酸鈣 0.04g/L三氯化鐵 1.94×10-4g/L乙二胺四乙酸二鈉1.5×10-4g/L氯化鋅 3.28×10-6g/L硼酸 4.88×10-5g/L氯化鈷 4.08×10-6g/L硫酸銅 5.28×10-6g/L氯化錳 3.28×10-6g/L鉬酸銨 3.04×10-5g/L維生素B121.6×10-6g/L生物素 2.0×10-6g/L。
4.根據權利要求1所述的一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法，其特征是用活性碳處理回收的培養基，活性碳的用量為0.2-1.0g/L，活性碳處理時間為2-5小時。
全文摘要
本發明公開了一種培養雨生紅球藻生產蝦青素的方法，包括培養基配方、一步法生產工藝、培養基的循環使用和用二氧化碳調節培養液pH值誘導紅球藻孢子的形成和蝦青素積累的方法。雨生紅球藻的營養細胞的生長、孢子轉化和蝦青素累積是在同一個光生物反應器、同一培養基中完成，通過調控培養液的pH值促進孢子轉化和蝦青素累積，培養周期為12－15天。培養基經過回收—處理—重新配制，可以循環使用至少6次。減少生產過程的廢水排放，保護環境；本發明工藝簡便，生產周期短，12－15天內完成營養生長、孢子轉化和蝦青素積累，產量高，質量好。
文檔編號C12P23/00GK1392244SQ0213882
公開日2003年1月22日 申請日期2002年7月26日 優先權日2002年7月26日
發明者李夜光, 張寶玉 申請人:中國科學院武漢植物研究所