專利名稱：酵母中來自Tritirachium album的重組蛋白酶K的表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及以經濟適當量制備可溶且活性形式的重組蛋白酶K的方法。
蛋白酶K(E.C.3.4.21.64，也已知為內肽酶K)是真菌Tritirachium album Limber合成的胞外內肽酶。它是具有典型催化三元組Asp39-His69-Ser224的絲氨酸蛋白酶類中的一員(Jany，K.D.等，(1986)FEBS Letters Vol.199(2)，139-144)。因為其長度為279個氨基酸的多肽鏈的序列(Gunkel，F.A.和Gassen，H.G.(1989)，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)Vol.179(1)，185-194)和三維結構(Betzel，C.等(1988)，Eur.J.Biochem.Vol.178(1)，155-71)與細菌枯草桿菌蛋白酶具有高度同源性，因此將蛋白酶K分類為枯草桿菌蛋白酶家族(Pahler，A.等(1984)EMBO J.Vol.3(6)，1311-1314；Jany，K.D.和Mayer，B.(1985).Biol.Chem.Hoppe-Seyler，Vol.366(5)，485-492)。以其水解天然角蛋白的能力為基礎對蛋白酶K命名，而真菌在角蛋白上生長使角蛋白作為唯一碳源和氮源(Ebeling，W.等(1974)歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)Vol.47(1)，91-97)。蛋白酶K具有高于30U/mg的特異活性，是已知的內肽酶中最有活性的之一(Betzel，C.等(1986)/FEBS Lett.Vol.197(1-2)，105-110)，并且非特異性水解天然的和變性的蛋白質。
來自Tritirachium album Limber的蛋白酶K在其天然宿主中翻譯成前蛋白酶原。1989年Gunkel，F.A.和Gassen，H.G.(1989)Eur.J.Biochem.Vol.179(1)，185-194解碼了編碼蛋白酶K的基因的cDNA的序列。據此前蛋白酶K原基因由兩個外顯子組成，并且編碼15個氨基酸長度的信號序列，90個氨基酸長度的序列原和279個氨基酸長度的成熟蛋白酶K。63bp內含子位于序列原區。前肽在易位過程中裂解為內質網(ER)。迄今，有關用肽原裂解形成成熟蛋白酶K的后加工還知之甚少。
結果成熟蛋白酶K由279個氨基酸組成。兩個二硫橋和兩個鍵合的鈣離子使得緊密結構穩定。這解釋了為什么與其他枯草桿菌蛋白酶相比蛋白酶K對極端pH值，高溫，離液劑和去污劑具有高得多的穩定性(Dolashka，P.等(1992)Int.J.Pept.Protein.Res.Vol.40(5)，465-471)。蛋白酶K特征在于高熱穩定性(達65℃，Bajorath等(1988)，Eur.J.Biochem.Vol.176，441-447)和寬pH-范圍(pH7.5-12.0，Ebeling，W.等(1974)Eur.J.Biochem.Vol.47(1)，91-97)。在變性劑例如脲或SDS存在下其活性得以提高(Hilz，H.等(1975)J.Biochem.Vol.56(1)，103-108；Jany，K.D.和Mayer，B.(1985)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，Vol.366(5)，485-492)。
上述性質使得蛋白酶K在其中要求非特異性蛋白質降解的生物技術應用中特別令人感興趣。特別例舉的是從粗提取液中分離核酸(DNA或RNA)以及在DNA分析中預制備樣品(Goldenberger，D.等(1995)PCR Methods Appl.Vol.4(6)，368-370；US5,187,083；US5,346,999)。其他應用是在蛋白質分析領域，例如結構釋析。
通過真菌Tritirachium album Limber發酵商業上大量獲得蛋白酶K(例如CBS348.55，Merck菌株No.2429或菌株ATCC22563)。但是在該過程中，葡萄糖或游離氨基酸抑制蛋白酶K的產生。因為含有蛋白質的介質也誘導蛋白酶的表達，所以需要使用蛋白質例如BSA，奶粉或大豆粉作為唯一氮源來源。一旦達到生長穩定期就開始分泌蛋白酶(Ebeling，W.等(1974)Eur.J.Biochem.Vol.47(1)，91-97)。
所以因為Tritirachium album Limber不適合大規模發酵，而且難以進行基因操作，曾進行過在其他宿主細胞中過量表達重組蛋白酶K的嘗試。但是，由于沒有表達，發生失活“包函體”或者與復性有關的問題，在這些實驗中沒有檢測到顯著活性(Gunkel，F.A.和Gassen，H.G.(1989)Eur.J.Biochem.Vol.179(1)，185-194；Samal，B.B.等(1996)Adv.Exp.Med.Biol.Vol.379，95-104)。
Tritirachium album Limber是緩慢生長著的真菌，其只向培養基中分泌少量蛋白酶。缺點是與酵母相比更短的細胞周期和在發酵罐中能實現的更低的光密度。另外，已知T.album除了蛋白酶K之外還產生污染制備的其他蛋白酶(Samal，B.B.等(1991).EnzymeMicrob.Technol.Vol.13，66-70)。
雖然原理上能在大腸桿菌中表達蛋白酶K，其不以可溶形式表達而是以所謂“包函體”表達，其中酶接著用一定方法溶解并且復性。該方法的缺點是在溶解和復性過程中損失很多蛋白質。
因此本發明的目的是提供以經濟適當量制備重組蛋白酶K的方法。
令人驚奇地發現有可能在酵母中表達和分泌作為可溶形式的酶原母體(zymogene Vorstufe)的重組蛋白酶K，其中自動催化激活形成活性蛋白酶K。本發明的另一個主題是從培養基上清液純化活性蛋白酶K。
因此本發明涉及制備重組蛋白酶K的方法，包括步驟a)用包含編碼蛋白酶K的酶原母體的DNA的載體轉化宿主細胞，其中所述編碼序列的DNA在讀框中與編碼信號肽的序列向上游(stromaufwrts)融合并且處于該宿主細胞的合適的啟動子的調控之下，b)蛋白酶K的酶原母體的表達，c)蛋白酶K的分泌和自動催化激活，d)蛋白酶K的分離和純化其特征在于宿主細胞是酵母細胞，并且這種表達宿主分泌可溶形式的蛋白質。
在根據本發明方法的一個具體實施方案中，宿主細胞選自畢赤氏酵母屬(Pichia)的種，漢遜氏酵母屬(Hansenula)的種，例如多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)，糖酵母屬(Saccharomyces)的種，裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)的種，Yarrowia屬的種，例如Yarrowia lipolytica，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)的種和曲霉屬(Aspergillus)的種。根據本發明特別優選的是巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)被用作宿主細胞。
此外還證明當用編碼酶原母體的DNA轉化宿主細胞并且在分泌到培養基期間或分泌到培養基中之后馬上自動催化激活蛋白酶K時根據本發明的方法的優點。
當使用巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)作宿主細胞時，優選將編碼蛋白酶K的酶原母體的基因克隆到下面的載體中pPICZ，pPICZα，pGAPZ，pGAPZα，pPICZαA和pPIC9K。在這種情況下，特別優選載體pPICZαA和pPIC9K。根據本發明，載體pPICZαA是特別優選。上述載體可商業購得(Invitrogen)。
此外，當用甲醇誘導蛋白酶K或蛋白酶K的酶原母體的表達(pPIC載體)時，優選根據本發明方法制備重組蛋白酶K。另一種方法是甘油醛磷酸誘導表達(pGAP載體)。
在制備重組蛋白酶K的本發明方法中，優選的是通過來自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子的信號肽的N-末端融合引發蛋白質分泌。這意味著例如上述α-標記的載體具有用于來自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子的信號肽的核苷酸序列。然后在翻譯過程中產生得自N-末端的信號肽和目標蛋白質的融合蛋白。另一種可能的信號肽會是蛋白酶K的天然信號序列。
此外對于制備重組蛋白酶K特別有利的是用包含編碼酶原母體的DNA的表達載體pPICZαA和pPIC9K轉化宿主細胞巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)并且該基因受AOXl啟動子的調控并且任選地有AOXl中止子。
本發明還涉及包含編碼蛋白酶K的酶原母體的DNA的載體，其中所述編碼序列在讀框中與編碼合適的信號肽的序列向上游融合并且其中編碼基因處于該宿主細胞的合適的啟動子和任選的中止子的調控之下，并且其中該載體適合這種宿主細胞的轉化。根據本發明，所述宿主細胞是酵母。
因此本發明還涉及包含上面定義的重組DNA的一個或多個拷貝的重組載體。所述載體優選是具有宿主細胞的強啟動子和宿主細胞用于分泌蛋白質的合適信號肽的質粒。此外還可以使前蛋白酶K原的天然信號肽與如在SEQ.ID.NO.21(信號序列1-15(15個氨基酸)；序列原16-104(90個氨基酸，成熟蛋白酶K的序列106-384(279個氨基酸))中所示的肽原的N-末端融合。用來產生表達載體的方法是本領域技術人員公知的，并且例如Sambrook等(1989)有所描述。
本發明的另一個主題是用上面列出的載體之一轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母。宿主細胞優選選自畢赤氏酵母屬(Pichia)的種，漢遜氏酵母屬(Hansenula)的種，例如多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)，糖酵母屬(Saccharomyces)的種，裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)的種，Yarrowia屬的種，例如Yarrowia lipolytica，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)的種和曲霉屬(Aspergillus)的種。巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)特別優選被用作宿主細胞。當幾個載體(每一個都有一個ppK基因的拷貝)被整合到基因組中時它是特別優選的。
另外，本發明涉及純化蛋白酶K的方法。為了純化蛋白酶，在第一步驟中通過微量過濾法或離心去除酵母細胞。得到的澄清溶液含有蛋白酶。接著為了使產物與陽離子交換劑結合而利用超濾再次緩沖，所述陽離子交換劑是例如SP-Sepharose或SP-Sephadex(Pharmacia)或SP-Toyopearl(Tosoh Corporation)。洗脫之后，利用超濾再次緩沖并且與陰離子交換劑結合，所述陰離子交換劑是例如DEAE-Sepharose或Q-Sepharose(Pharmacia)或DEAE-Fraktogel(Merck)。再次洗脫之后，利用超濾將純蛋白酶轉移到穩定的緩沖體系中(蛋白質純化，原理和實驗(Protein Purification，Principlesand Practice)，Robert K.Scopes，Springer Verlag，1982)。然而本領域技術人員能使用現有技術中其他純化方法。
令人驚奇地，根據本發明的方法使能夠制備重組蛋白酶K，其中異源宿主細胞產生可溶和活性形式的酶。表達蛋白酶K，接著將酶分泌到培養基中是特別有利的，這樣防止了蛋白酶K對宿主細胞的細胞溶膠產生強毒性作用。此外，這保證正確形成二硫橋，而這在細胞溶膠還原環境下不太容易發生。因此，根據本發明的方法的一個重要的優點是提供了產生可溶和活性形式的重組蛋白酶K。非常令人吃驚而意料不到的是分泌的蛋白酶K不水解根據本發明的表面蛋白。這樣的預期的蛋白酶K對表面蛋白的水解會干擾宿主細胞的生命周期。
用根據本發明的方法獲得蛋白酶K，它是同源的并因此特別適合分析和診斷應用。根據本發明的蛋白酶K的酶原母體能任選地含有另外的N-末端修飾，特別是有利于目標蛋白質純化的序列(“親和性標記”)。另外，酶原母體能包含提高翻譯效率，提高折疊效率的序列，和/或導致目標蛋白質分泌到培養基中的序列(天然前序列和其他信號肽)。
就本發明意義來說，蛋白酶K意指SEQ.ID.NO.1所示的Gassen等人(1989)的序列，以及來自Tritirachium album Limber的蛋白酶K的其他變體，如Ch.Betzel等(生物化學(Biochemistry)40(2001)，3080-3088)公開的氨基酸序列，特別是蛋白酶T(Samal，B.B.等(1989)Gene Vol.85(2)，329-333；Samal，B.B.等(1996)高級實驗藥物生物學(Adv.Exp.Med.Biol.)Vol.379，95-104)和蛋白酶R(Samal，B.B.等(1990)分子微生物學(Mol.Microbiol.)Vol.4(10)，1789-1792；US5,278,062)，和重組方法產生的另外的變體(例如如WO96/28556中所述)。SEQ.ID.NO.1包括序列原(1-90；90個氨基酸)和成熟蛋白酶K的序列(91-368；279個氨基酸)。Betzel等(生物化學(Biochemistry)40(2001)，3080-3088)公開的蛋白酶K氨基酸序列特別在活性蛋白酶的207位具有代替絲氨酸殘基的特定天冬氨酸。
本發明意義的蛋白酶K原特別指其N-末端與其根據SEQ.ID.NO.1的序列原連接的蛋白酶K。在與蛋白酶K緊密相關的枯草桿菌蛋白酶E和相應變體情況下，序列原對活性蛋白酶的折疊和形成有重要影響(Ikemura，H.等(1987)生物化學(Biol.Chem.)Vol.262(16)，7859-7864)。特別地假設序列原作為分子內陪伴分子而起作用(Inouye，M.(1991)酶(Enzyme)Vol.45，314-321)。折疊之后，通過前肽自身催化裂解將其加工成成熟枯草桿菌蛋白酶(Ikemura，H.和Inouye，M.(1988)生物化學雜志(J.Biol.Chem.)Vol.263(26)，12959-12963)。這個過程在分子內發生在枯草桿菌蛋白酶E.(Samal，B.B.等(1989)Gene Vol.85(2)，329-333；Volkov，A.和Jordan，F.(1996)J.Mol.Biol.Vol.262，595-599)，枯草桿菌蛋白酶BPN′(Eder，J.等(1993)生物化學(Biochemistry)Vol.32，18-26)，木瓜蛋白酶(Vernet，T.等(1991)J.Biol.Chem.Vol.266(32)，21451-21457)和嗜熱芽孢菌蛋白酶(Marie-Claire，C.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273(10)，5697-5701)的情況下。
只有通常是疏水性的序列原的一定的核心區顯示對于作為陪伴分子的功能是必需的，因為很多區域的突變對活性沒有影響(Kobayashi，T.和Inouye，M.(1992)J.Mol.Biol.Vol.226，931-933)。另外，已知前肽可以在各種枯草桿菌蛋白酶變體之間互換。因此例如枯草桿菌蛋白酶BPN′也識別枯草桿菌蛋白酶E的序列原(Hu，Z.等(1996)J.Biol.Chem.Vol.271(7)，3375-3384)。
因此本發明涉及長度是90個氨基酸的根據SEQ.ID.NO.1的序列原，和促進折疊功能的其他變體。還涉及為成熟蛋白酶K折疊而外源加入的并促進上述功能的前肽。
因此，根據本發明的方法的重要的優點是表達宿主將重組蛋白酶K以可溶和活性形式分泌到培養基中。此外，非常有活性和非特異蛋白酶不損害或其以其它方式負面影響在根據本發明的方法中使用的表達宿主，即特別地，其連續生長沒有問題，并且沒有發現增加的細胞溶胞作用。此外，與Tritirachium album相比，根據本發明的表達宿主更容易操作，并且特征在于更高的生長速度。
圖1是表達質粒pPICPK-1。克隆到起始載體pPICZαA(Invitrogen)中的對于蛋白酶K的酶原前體編碼的序列。
圖2是表達質粒pPICPK-2。克隆到起始載體pPIC9K(Invitrogen)中的對于蛋白酶K的酶原前體編碼的序列。
實施例實施例1基因合成利用基因合成的方法制備用于沒有信號序列和沒有內含子的來自Tritirachium album Limber的成熟蛋白酶K的基因。Gunkel和Gassen，1989的368個氨基酸長度的序列(沒有天然信號肽)被用作模板。通過再次翻譯氨基酸序列獲得用于在大腸桿菌和酵母中表達的密碼子優化核酸序列。SEQ.ID.NO.1給出氨基酸序列，SEQ.ID.NO.2給出核苷酸序列。
關于基因合成，將基因分為有義和反義，交替序列中互補配對寡核苷酸的18個片段(SEQ.ID.NO.3-20)。分別至少15bp區連接5′-端和連接3′-端，在各種情況下相鄰的寡核苷酸重疊。限制性內切核酸酶的識別位點與用來接著克隆到表達載體中的編碼區外部的合成基因的5′-和3′-端連接。包含EcoRI切割位點的SEQ.ID.NO.3中所示寡核苷酸被用作克隆蛋白酶K原基因的5′引物。SEQ.ID.NO.20是包含HindIII切割位點的3′-引物。3′引物在天然終止密碼子之后包含另外的終止密碼子，以保證翻譯的安全終止。
利用PCR反應將寡核苷酸彼此連接并且擴增得到的基因。為此，首先將基因分為各自6個寡核苷酸的三個片段，在第二輪PCR循環中將這三個片段彼此連接。
片段1由如SEQ.ID.NO.3-8中所示的寡核苷酸組成，片段2由如SEQ.ID.NO.9-14中所示的寡核苷酸組成，片段3由如SEQ.ID.NO.15-20中所示的寡核苷酸組成。
使用下面的PCR參數PCR反應1(三個片段的產生)5分鐘95℃熱起始 PCR反應2(連接片段形成全長基因) 加入末端引物 實施例2克隆由基因合成得到的合成的蛋白酶K片段對瓊脂糖凝膠施用PCR混合物，并且從瓊脂糖凝膠(Bio 101，Inc.CA USA的Geneclean II試劑盒)分離大約1130bp PCR片段。用EcoRI和HindIII限制性內切核酸酶(Roche Diagnostics GmbH，德國)在37℃下將片段切割1小時。同時用EcoRI和HindIII限制性內切核酸酶在37℃下將pUC18質粒切割1小時，通過瓊脂糖凝膠電泳分離混合物，并且分離2635bp載體片段。接著使用T4-DNA連接酶將PCR片段和載體片段相互連接在一起。對于1微升(20ng)載體片段和3微升(100ng)PCR片段，用移液管加入1微升10x連接酶緩沖液(Maniatis等，1989 B.27)，1微升T4 DNA連接酶，4微升無菌H2O，小心混合并且在16℃下溫育過夜。
通過限制性(內切核酸酶酶切)分析并且通過兩條鏈的多次測序來檢查克隆的基因。
實施例3載體構建首先從pUC質粒再次分離合成基因。為此目的，1微克質粒DNA首先根據生產商說明與限制性內切核酸酶HindIll(RocheDiagnostics GmbH)溫育，接著通過加熱至65℃維持20分鐘將限制性內切核酸酶滅活。然后用Klenow聚合酶根據生產商說明(RocheDiagnostics GmbH) 補平得到的DNA突出端，并且通過在75℃溫育10分鐘將Klenow聚合酶滅活。最后用限制性內切核酸酶EcoRI(RocheDiagnostics GmbH)根據生產商說明切割現在線性化的上述pUC質粒的載體片段，將反應混合物施加給1％瓊脂糖凝膠，并且通過施加電流(100V/150mA)根據大小相互分離片段。從瓊脂糖凝膠(QIAquick GelExtraction Kit/Qiagen)分離包含對于蛋白酶K原的基因(ppk基因)的大約1120bp片段。
用限制性內切核酸酶Asp718I(Roche Diagnostics GmbH)根據生產商說明切割pPICZαA載體(Invitrogen)，并且通過將溫育混合物加熱至65℃維持20分鐘將限制性內切核酸酶滅活。然后用Klenow聚合酶根據生產商說明(Roche Diagnostics GmbH)補平得到的DNA突出端，并且然后通過在75℃溫育10分鐘將Klenow聚合酶滅活。最后用限制性內切核酸酶EcoRI(Roche Diagnostics GmbH)根據生產商說明切割現在線性化的pPICZαA的載體片段，將反應混合物施加給1％瓊脂糖凝膠，并且通過施加電流(100V/150mA)根據大小分離片段。從瓊脂糖凝膠(QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen)分離大約3550bp載體片段。
通過標準方法(Sambrook等，1989)將用這種方法獲得的片段彼此連接在一起。在該載體中，ppk基因受AOX1啟動子(甲醇可誘導的來自巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)的醇氧化酶1的啟動子)的控制，并且利用這種克隆策略在來自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的α-因子的信號肽后面的正確的讀框(leserahmen)中克隆。然后用限制性(內切核酸酶酶切)分析和測序對用這種方法插入的基因片段檢查沒有錯誤的基礎序列。得到的包含編碼蛋白酶K原的ppk基因的表達載體命名為pPICPK-1(參見圖1)。
隨后也將ppk基因克隆到pPIC9K(Invitrogen)中。為此目的，使用限制性內切核酸酶PmeI和NotI(Roche Diagnostics GmbH)根據生產商說明切割載體pPICPK-1。在1％瓊脂糖凝膠中根據大小從限制性(酶切)混合物中分離片段，從凝膠上分離含有AOX1-啟動子區的3′-部分的大約1960bp片段，α-因子信號肽序列和ppk基因(QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen)。同時使用限制性內切核酸酶PmeI和NotI(Roche Diagnostics GmbH)根據生產商說明切割載體pPIC9K，在1％瓊脂糖凝膠中根據大小從限制性酶切混合物中分離片段，從凝膠上分離大約8450bp載體片段(QIAquick Gel ExtractionKit/Qiagen)。
接著通過標準方法(Sambrook等，1989)將用這種方法獲得的片段彼此連接在一起。在該載體中，ppk基因也受AOX1啟動子(甲醇可誘導的來自巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)的醇氧化酶1的啟動子)的控制。通過篩選標記物并且通過本領域公知的在轉化之前基于載體線性化將其整合到畢赤氏酵母基因組中的三種可能性來區別載體pPIC9K與載體pPICZαA，而pPICZαA整合到AOX1位點的整合作用是固定的。然后用限制性(內切核酸酶酶切)分析和測序對插入的基因片段檢查沒有錯誤的基礎序列。
得到的包含編碼蛋白酶K原的ppk基因的表達載體命名為pPICPK-2(參見圖2)。
實施例4在巴斯德畢赤氏酵母中轉化pPICPK-1為了在巴斯德畢赤氏酵母X-33中轉化pPICPK-1并且接著整合到基因組中，首先用PmeI(Roche Diagnostics GmbH)將載體線性化。利用電穿孔使用Gene Pulser II(Biorad)進行轉化作用。
為此目的，用巴斯德畢赤氏酵母野生型菌株的菌落接種5毫升YPD培養基，并且振蕩下在30℃下溫育過夜。接著在200毫升新鮮YPD培養基(根據Invitrogen目錄)中以1∶2000比例再接種過夜培養物，并且振蕩下在30℃下溫育過夜，直到OD600達到1.3-1.5。將細胞離心(1500xg/5分鐘)并且將沉積物(pellet)重新懸浮于200ml冰冷無菌水(0℃)中。再次離心細胞(1500xg/5分鐘)并且再次懸浮于100ml冰冷無菌水(0℃)中。再次離心細胞并且再次懸浮于10毫升冰冷(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。再次離心細胞并且再次懸浮于0.5毫升冰冷(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。用這種方法得到的細胞保存在冰上并且立即用于轉化。
向80微升的細胞加大約1微克線性化pPICPK-1載體DNA，并且將全部混合物轉移到冰冷(0℃)的電穿孔小池(küvette)中并且在冰上又溫育5分鐘。接著將小池轉移給Gene Pulser II(Biorad)，在1kV，1kΩ和25μF下進行轉化作用。電穿孔之后，向混合物加入1毫升1M山梨糖醇(ICN)，并且接著在含有100微克/毫升Zeocin(Invitrogen)的YPDS瓊脂板(根據Invitrogen目錄)上平板培養100-150微升。平板接著在30℃下溫育2-4天。
用克隆接種最小葡萄糖格板并且進一步分析克隆。
取生長的克隆，重新懸浮于20微升無菌水中并且用17.5U溶細胞酶(Roche Diagnostics GmbH)溶解(1小時，37℃)并且通過PCR方法直接檢查ppk表達盒的正確整合作用。
然后在表達實驗中使用轉化到基因組的過程中整合了完整表達盒的克隆。
實施例5在巴斯德畢赤氏酵母中轉化pPICPK-2為了在巴斯德畢赤氏酵母GS115中轉化pICPK-2并且接著整合到基因組中，首先針對變體I用PmeI(Roche Diagnostics GmbH)將載體線性化，將它整合到AOXI-位置，并且針對變體II用SaII(RocheDiagnostics GmbH)線性化，將它整合到His4位置。利用電穿孔使用Gene Pulser II(Biorad)進行轉化作用。
為此目的，用巴斯德畢赤氏酵母GS115野生型菌株的菌落接種5毫升YPD培養基(根據Invitrogen目錄)，并且振蕩下在30℃下溫育過夜。接著在200毫升新鮮YPD培養基(根據Invitrogen目錄)中以1∶2000比例再接種過夜培養物，并且振蕩下在30℃下溫育過夜，直到OD600達到1.3-1.5。將細胞離心(1500xg/5分鐘)并且將沉積物重新懸浮于200ml冰冷無菌水(0℃)中。再次離心細胞(1500xg/5分鐘)并且再次懸浮于100ml冰冷無菌水(0℃)中。再次離心細胞并且再次懸浮于10毫升冰冷(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。再次離心細胞并且再次懸浮于0.5毫升冰冷(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。用這種方法得到的細胞保存在冰上并且立即用于轉化。
向80微升的細胞加大約1微克線性化pPICPK-2載體DNA，并且將全部混合物轉移到冰冷(0℃)的電穿孔小池并且在冰上又溫育5分鐘。接著將小池轉移給Gene Pulser II(Biorad)中，在1kV，1kΩ和25μF下進行轉化作用。電穿孔之后，向混合物加入1毫升1M山梨糖醇(ICN)，并且接著在沒有組氨酸的MM瓊脂板(根據Invitrogen目錄的最小培養基)上平板培養100-150微升。平板接著在30℃下溫育2-4天。當它們已整合帶有具有功能His4基因作為插入物的載體pPICPK-2時，具有突變(組氨醇脫氫酶)引起的缺損His4基因的巴斯德畢赤氏酵母GS115克隆只能在這些板上生長，而且因此能補償(aufhebt)組氨酸合成中的缺陷。
用克隆接種最小葡萄糖格板并且進一步分析克隆。取生長的克隆，重新懸浮于20微升無菌水中并且用17.5U溶細胞酶(RocheDiagnostics GmbH)溶解(1小時，37℃)，并且通過PCR方法直接檢查ppk表達盒的正確整合作用。
然后在表達實驗中使用轉化到基因組的過程中整合了完整表達盒的克隆。
實施例6蛋白酶K的表達用陽性克隆接種10毫升BMGY培養基(根據Invitrogen目錄)，并且振蕩下在30℃下溫育過夜。接著測定600nm下的光密度(OD)，并且用這樣一種方式接種10毫升BMMY培養基(根據Invitrogen目錄)，使OD600達到1。BMMY培養基(根據Invitrogen目錄)含有甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)，它通過AOX1啟動子誘導蛋白酶K的表達。
振蕩下在30℃下溫育振蕩瓶，每24小時取樣，測定OD600，對蛋白酶K的表達進行活性測定，并且每一次再次添加0.5％甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)用于進一步誘導。表達實驗進行168小時。
實施例7分泌的重組蛋白酶K的活性測定對于重組蛋白酶K的活性測定，需要CaCl2x2H2O(Merck ID-No.102382)，DMSO(Merck ID-No.109678)，底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Roche Diagnostics ID-No.0716766)和Tris-Base(RocheDiagnostics ID-No.0153265)。
溶液組成如下溶液150毫摩爾/升Tris-Base；10mmol/L CaCl2pH8.2溶液2溶解于1毫升DMSO中的125毫克Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA將細胞離心(10000rpm，5分鐘，Eppendorf-Tisch離心機)，并且在溶液1中以1∶500稀釋上清液。
用移液管將2毫升溶液1吸移到小池中并且加入0.02毫升的溶液2。混合兩種溶液，并且在25℃的反應溫度下溫育。通過加入0.05毫升如上所述的稀釋的上清液并且反復混合開始反應，測定405nm下的吸收變化并且測定線性區域中ΔA/分鐘。然后用下式計算 2.07＝樣品體積ε405＝10.4[mmol-1x1xcm-1]1＝小池路徑長度0.05＝加入的樣品的體積序列表<110>Roche Diagnostics GmbH<120>來自酵母中Tritirachium album的重組蛋白酶K的表達<130>5441/00/DE<140>
<141>
<160>21<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>369<212>PRT<213>Tritirachium album Limber<400>1Ala Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala1 5 10 15Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly20 25 30Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys35 40 45Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu50 55 60Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr65 70 75 80Ile Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala85 90 95Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr100 105 110Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile115 120 125Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln130 135 140Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly145 150 155 160Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys165 170 175Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly180 185 190
Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys195 200 205Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly210 215 220Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser225 230 235 240Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala245 250 255Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala260 265 270Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val275 280 285Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly290 295 300Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val305 310 315 320Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala325 330 335Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser340 345 350Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln355 360 365Ala<210>2<211>1124<212>DNA<213>Tritirachium album Limber<400>2gaattcgctc ctgccgttga gcagcgctcc gaggctgctc ctctgatcga ggcccgcggc 60gagatggttg ccaacaagta catcgtcaag ttcaaggagg gtagcgctct ttccgctctg 120gatgctgcca tggagaagat ctctggcaag cccgaccacg tctacaagaa cgtcttcagc 180ggtttcgctg cgaccctgga cgagaacatg gttcgggttc tccgcgccca ccccgatgtt 240gagtacatcg agcaggatgc tgttgtcacc atcaacgctg cgcagaccaa cgctccctgg 300ggcctggctc gcatctccag caccagcccc ggtacctcta cctactacta tgacgaatct 360gccggccaag gctcctgcgt ctacgtgatc gacaccggta tcgaggcatc gcaccccgag 420ttcgagggtc gtgcccagat ggtcaagacc tactactact ccagtcgcga cggtaacggt 480cacggcaccc actgcgctgg taccgttggc tcccgtacct acggtgtcgc caagaagacc 540cagctgttcg gtgtcaaggt cctggatgac aacggcagtg gccagtactc caccatcatc 600gccggtatgg acttcgttgc cagcgacaag aacaaccgca actgccccaa aggtgtcgtt 660gcctccttat ccctgggcgg tggttactcc tcctccgtga acagcgccgc tgcccgcctc 720cagagctctg gtgtcatggt cgccgtcgct gccggtaaca acaacgctga cgcccgcaac 780tactcccctg cttctgagcc ctcggtctgc accgtcggtg cttctgaccg ctacgaccgc 840cgctccagct tctccaacta cggcagcgtt ttggacatct tcggccctgg taccagcatc 900ctctccacct ggatcggcgg cagcacccgc tccatctctg gtacctccat ggctactccc 960
cacgttgccg gtctcgctgc ctacctcatg actcttggaa agactaccgc cgccagcgct 1020tgccgataca ttgccgacac cgccaacaag ggcgacttaa gcaacattcc cttcggcact 1080gtcaacttgc ttgcctacaa caactaccag gcttaatgaa gctt 1124<210>3<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>3cgcgaattcg ctcctgccgt tgagcagcgc tccgaggctg ctcctctgat cgaggcccgc 60ggcgagatgg ttgccaaca 79<210>4<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4atcttctcca tggcagcatc cagagcggaa agagcgctac cctccttgaa cttgacgatg 60tacttgttgg caaccatctc 80<210>5<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>5tgccatggag aagatctctg gcaagcccga ccacgtctac aagaacgtct tcagcggttt 60cgctgcgacc ctggacgaga 80<210>6<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6tgctcgatgt actcaacatc ggggtgggcg cggagaaccc gaaccatgtt ctcgtccagg 60gtcg 64<210>7<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>7tgagtacatc gagcaggatg ctgttgtcac catcaacgct gcgcagaccg ctgcgcagac 60caacg 65<210>8<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8agtaggtaga ggtaccgggg ctggtgctgg agatgcgagc caggccccag ggagcgttgg 60tctgcgcagc70<210>9<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>9gtacctctac ctactactat gacgaatctg ccggccaagg ctcctgcgtc tacgtgatcg 60acaccggtat cgaggcatcg 80<210>10<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>10ttaccgtcgc gactggagta gtagtaggtc ttgaccatct gggcacgacc ctcgaactcg 60gggtgcgatg cctcgatacc g 81<210>11<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>11ccagtcgcga cggtaacggt cacggcaccc actgcgctgg taccgttggc tcccgtacct 60acggtgtcgc caagaaga 78<210>12<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>12atggtggagt actggccact gccgttgtca tccaggacct tgacaccgaa cagctgggtc 60ttcttggcga cac73<210>13<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>13ggccagtact ccaccatcat cgccggtatg gacttcgttg ccagcgacaa gaacaaccgc 60aactgcccca aaggtgtcgt t 81<210>14<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>14gctctggagg cgggcagcgg cgctgttcac ggaggaggag taaccaccgc ccagggataa 60ggaggcaacg acacctttgg g 81<210>15<211>82<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>15gcccgcctcc agagctctgg tgtcatggtc gccgtcgctg ccggtaacaa caacgctgac 60gcccgcaact actcccctgc tt 82<210>16<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>16gttggagaag ctggagcggc ggtcgtagcg gtcagaagca ccgacggtgc agaccgaggg 60ctcagaagca ggggagtagt 80<210>17<211>83<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>17ctccagcttc tccaactacg gcagcgtttt ggacatcttc ggccctggta ccagcatcct 60ctccacctgg atcggcggca gca 83<210>18<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>
tcatgaggta ggcagcgaga ccggcaacgt ggggagtagc catggaggta ccagagatgg 60agcgggtgct gccgccgatc c 81<210>19<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>19ctgcctacct catgacctta ggaaagacca ccgccgccag cgcttgccgt tacatcgccg 60acaccgccaa caagggcgac t 81<210>20<211>87<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>20atataagctt ctattaagcc tggtagttgt tgtaggctaa caggttgacg gtgccgaagg 60gaatgttgct taagtcgccc ttgttgg 87<210>21<211>384<212>PRT<213>Tritirachium album Limber<400>21Met Arg Leu Ser Val Leu Leu Ser Leu Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ala1 5 10 15Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg20 25 30Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly Ser35 40 45Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys Pro50 55 60
Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu Asp65 70 75 80Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr Ile85 90 95Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro100 105 110Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr115 120 125Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp130 135 140Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met145 150 155 160Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly Thr165 170 175His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys180 185 190Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln195 200 205Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys Asn210 215 220Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly225 230 235 240Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser245 250 255Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg260 265 270Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Ser275 280 285Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu290 295 300Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly305 310 315 320Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala325 330 335Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser340 345 350Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn355 360 365Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala370 375 380
權利要求
1.制備重組蛋白酶K的方法，包括步驟a)用包含編碼蛋白酶K的酶原母體的DNA的載體轉化宿主細胞，其中所述編碼序列的DNA在讀框中與編碼信號肽的序列向上游融合并且處于該宿主細胞的合適的啟動子的調控之下，b)蛋白酶K的酶原母體的表達，c)蛋白酶K的分泌和自動催化激活，其特征在于宿主細胞是酵母細胞，并且這種表達宿主分泌可溶形式的蛋白質。
2.根據權利要求1要求的方法，其中所述宿主細胞選自畢赤氏酵母屬，漢遜氏酵母屬，糖酵母屬，裂殖糖酵母屬，Yarrowia屬，克魯維氏酵母屬和曲霉屬。
3.根據權利要求1或2之一要求的方法，其中所述宿主細胞是巴斯德畢赤氏酵母。
4.根據權利要求3要求的方法，其中編碼蛋白酶K的酶原母體的基因克隆到下面的載體之一中pPICZ，pPICZα，pGAPZ，pGAPZα，pPICZαA和pPIC9K。
5.根據權利要求3或4要求的方法，其中用下面的載體之一轉化所述宿主細胞pPICPK-1和pPICPK-2。
6.根據權利要求1-5之一要求的方法，其中甲醇誘導蛋白酶K的酶原母體的表達。
7.根據權利要求1-6之一要求的方法，其中信號肽的N-末端融合引發蛋白質的分泌。
8.根據權利要求1-7之一要求的方法，其中來自啤酒糖酵母的α-因子的信號肽的N-末端融合引發蛋白質的分泌。
9.根據權利要求1-8之一要求的方法，其中用包含編碼蛋白酶K的酶原母體的DNA的表達載體pPICZαA轉化宿主細胞巴斯德畢赤氏酵母并且該基因處于AOX1啟動子的控制下。
10.包含編碼蛋白酶K的酶原母體的DNA的載體，其中編碼序列的這種DNA在讀框中與編碼合適的信號肽的序列向上游融合，并且該編碼基因處于對于該宿主細胞合適的啟動子的控制之下，并且該載體適合酵母的轉化。
11.權利要求10要求的載體，特征在于其適合于巴斯德畢赤氏酵母的轉化。
12.權利要求10或11要求的包含編碼蛋白酶K的酶原母體的DNA的載體，選自pPICZ，pPICZα，pGAPZ，pGAPZα，pPICZαA和pPIC9K。
13.權利要求10-12之一要求的載體，其中所述載體是pPICZαA。
14.權利要求10-12之一要求的載體，其中所述包含編碼蛋白酶K的酶原母體的DNA的載體是pPICPK-1或pPICPK-2。
15.用權利要求10-14之一要求的載體轉化的宿主細胞，其中所述宿主的酵母。
16.權利要求15要求的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自畢赤氏酵母屬，漢遜氏酵母屬，糖酵母屬，裂殖糖酵母屬，Yarrowia屬，克魯維氏酵母屬和曲霉屬。
17.權利要求15或16要求的宿主細胞，其中所述宿主細胞是巴斯德畢赤氏酵母。
全文摘要
本發明涉及在酵母中例如在巴斯德畢赤氏酵母中表達編碼可溶性蛋白酶K的基因并接著分泌到培養基中的方法。本發明另外描述了異源表達和分泌的蛋白酶K的純化方法。
文檔編號C12N15/09GK1592785SQ02804774
公開日2005年3月9日 申請日期2002年2月5日 優先權日2001年2月9日
發明者R·米勒, J·-P·塔爾霍菲, F·蓋佩爾, S·格拉澤爾, W·赫爾克, H·舍恩, T·柯施鮑姆 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司