專利名稱：一種造血干／祖細胞擴增培養體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及造血干/祖細胞的擴增培養體系。
背景技術：
造血干細胞移植是血液學領域劃時代的技術，它已成為治愈某些惡性血液病，實體瘤、遺傳性及免疫性疾病的可靠選擇。造血干細胞移植有三種類型，骨髓造血干細胞移植(BMT)，外周血造血干細胞移植(PBSCT)，和臍帶血造血干細胞移植(ICBTR)。由于臍帶血來源廣泛，采集方便，臍血中富含造血干/祖細胞，所含淋巴細胞的免疫性低，移植物抗宿主病(GVHD)的發生率及嚴重程度均較低，因此臍帶血造血干細胞移植的基礎與應用的研究與開發是目前血液學研究的熱點問題。自1988年10月首例臍血干細胞移植(CBSCT)成功治療一例范科尼氏貧血以來，2000多名患者已接受臍血移植。但是由于單份臍血可采量有限，干/祖細胞的數量不能滿足成年患者干細胞移植的需要，目前臨床上臍血移植成功地用于治療惡性血液病均為兒童患者。臍帶血移植能否代替骨髓移植用于成人，臍帶血干/祖細胞的體外擴增以增加造血干/祖細胞的數量是成人患者臍血造血干細胞移植成功率提高所面臨的關鍵問題。
目前造血干/祖細胞體外擴增的方法主要有二大類。一類是造血生長因子的組合，用這種方法在1～2周內，即可使細胞總數擴增30～100倍，集落形成細胞擴增41～190倍。但是這些細胞因子的組合在擴增細胞的同時也明顯加速了干/祖細胞的分化，擴增后的造血細胞失去了重建造血的能力1-4。第二種方法是基質細胞支持的體外擴增體系，如Deter5等人建立的體外液體長期培養體系可維持數月的造血活動，在體系中加入細胞因子則可明顯的擴增造血細胞，在基質支持下，CD34+CD38-細胞經FL+SCF+IL-3刺激10～14天，LTC-IC可擴增3～30倍，3周后可達50倍。臍靜脈內皮細胞，腦血管內皮細胞，骨髓間質干細胞等作為基質層支持造血細胞的體外擴增6-10。基質細胞支持的擴增體系，可減緩干/祖細胞的分化，保留更多的早期造血細胞的數量和功能，擴增的造血細胞有成功的維持造血重建能力的報道。現有技術中已經公開了內皮細胞的培養方法，但建立基質細胞層費時，不適合大規模臨床應用的需要。
臍靜脈內皮細胞和腦血管內皮細胞雖有建系，但多是通過感染病毒而建的細胞系，在這種細胞層上或條件培養液擴增的細胞用于臨床將有被病毒污染的可能。
發明內容
本發明的目的是提供一種既能適合于干/祖細胞擴增用于臨床應用需要，又不采用病毒來擴增的培養體系。
為實現上述發明目的，本發明提供的一種造血干/祖細胞擴增培養體系含有骨髓內皮細胞條件培養液。
優選小鼠骨髓內皮細胞條件培養液。
獲得骨髓內皮細胞培養液的方法是1)取骨髓細胞，制成單細胞懸液；2)去除非內皮細胞，并培養；3)對自發轉化的細胞繼續培養，4)培養至細胞生長至融合時，以磷酸鹽緩沖溶液洗滌，加無血清培養液培養，再收集上清液，即為骨髓內皮細胞條件培養液。
優選采取小鼠骨髓細胞，并用上述方法獲得小鼠骨髓內皮細胞條件培養液。
進一步的改進是在上述培養液中加入細胞生長因子。細胞生長因子可選自GM-CSF，EPO，IL-6，SCF，G-CSF，FL。現有文獻中公開了單獨或聯合使用這些因子的方法。
本發明提供的擴增方案中，模擬了體內的造血微環境，利用內皮細胞條件培養液中所含的造血刺激因子和造血抑制因子及內皮細胞分泌的一些其他的生物活性物質，并輔以細胞因子，既擴增了造血祖細胞，又維持了造血干細胞的性能。并且在本發明中用內皮細胞條件培養液而不直接在細胞層上擴增，既避免了病毒污染，又避免造血細胞與內皮細胞直接接觸可能導致的細胞污染。
本發明實施例說明了從臍帶血中分離的CD34陽性細胞或單個核細胞在含小鼠骨髓內皮細胞條件培養液和造血生長因子IMDM中培養，造血祖細胞獲得了滿意的擴增效果，而且擴增后的造血細胞具有重建造血和免疫的能力，說明擴增后，仍然保持了造血干細胞的性能。
本發明擴增效果好，例如擴增1份臍帶血(可采量100毫升計)所得的單個核細胞或CD34+細胞已達到一個體重50kg左右成年患者干細胞移植所需的細胞閾值，并且擴增的造血細胞無病毒污染，無異種動物細胞的污染。因此用此方法擴增的臍血干細胞可用于臨床替代骨髓移植用于大兒童和成人患者。
圖1小鼠骨髓內皮細胞形態；圖2小鼠骨髓內皮細胞vWF和VCAM-1染色結果；圖3 CFU-GM集落形態；圖4 CFU-GEMM集落形態。
實施例(一)材料1.小鼠骨髓內皮細胞，按下述方法培養。
2.臍帶血來源于湖南省婦幼保健院
2.試劑rhGM-CSF、rhIL-6、rhSCF、rhG-CSF均為Gezyme產品。Ficoll-paque為Sigma公司產品.MiniMACS CD34陽性細胞分選試劑盒購自Sigma公司。FITC標記的CD34和PE標記的CD38單克隆抗體購自Becton Dickson-BD公司。人CD34，CD45，CD19，CD13單克隆抗體購自Bioscience公司。NOD/SCID鼠購自上海中科院動物所。
(二)方法1.小鼠骨髓內皮細胞的培養及骨髓內皮細胞條件培養液(ECM)的收集取正常小鼠骨髓，制成單細胞懸液。培養體系為每毫升含細胞2000個，含ECGF 5ng，血清20％，每皿種0、1毫升，24小時后，加同樣培養液2毫升。每日觀察貼壁細胞區，除去非內皮細胞，一般在20批培養中可有一批細胞自發轉化，繼續用上述培養體系培養細胞，可獲得大量內皮細胞，參見圖1、2，待細胞生長至融合時，以磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗三次，加無血清培養液0.1ml/每平方厘米培養皿面積，48小時后收集上清液，即為小鼠骨髓內皮細胞條件培養液。離心、過濾，-20℃保存備用2.臍血CD34+細胞的分離用含2mM EDTA的PBS稀釋肝素抗凝的臍血，加入Ficoll-paque通過密度梯度離心分離低密度單個核細胞(MNC，＜1.077g/ml)。分離的單個核細胞與半抗原交聯的CD34抗體于4℃孵育30分鐘后，細胞用PBS洗滌并重懸，然后加入半抗原的抗體交聯的MACS磁珠于4℃孵育30分鐘后，再用PBS洗滌并重懸。用LS+/VS+正性選擇柱，在MACS分離器的磁場中，分離CD34+細胞。
3.臍血造血細胞的體外擴增臍血CD34+細胞培養在含30％ECM并輔以造血生長因子GM-CSF，EPO，IL-6，SCF，G-CSF，FL的液體培養體系中，于37℃，5％CO2，飽和濕度下培養7天。離心收集液體培養體系中的細胞，檢測單個核細胞的數目；CD34+細胞和CD34+CD38-細胞的數目；集落CFUs(CFU-GM及CFU-GEMM)形成數目。參見圖3、4。
4.造血集落檢測方法CFU-GEMM為粒系-紅系-巨核系-巨噬系集落形成單位。系早期造血細胞，可以反映早期造血祖細胞的數量。培養體系為臍血CD34+細胞2×103/ml，馬血清30％，BSA 1mg/ml，EPO 2U/ml，rhSCF 50ng/ml，IL-320ng/ml，IL-650ng/ml，PHA-LCM 5％，GM-CSF 50ng/ml，2-巰基乙醇5×10-2mMol/L，L-谷氨酰胺2mMol/L，甲基纖維素0.9％，于24孔板培養，每組3孔，每孔0.5ml，于37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培養14天，置倒置顯微鏡下計數集落數，細胞數≥2000，并含有紅系細胞、單核細胞、巨噬細胞三種細胞以上的細胞聚合計數為一個CFU-GEMM。CFU-GM為粒-巨噬系集落形成單位，系較成熟的造血祖細胞，培養體系為臍血CD34+細胞2×103/ml，馬血清30％，rhGM-CSF 100ng/ml，2-巰基乙醇5×10-2mMol/L，L-谷氨酰胺2mMol/L，甲基纖維素0.9％，于5％CO2，37℃，飽和濕度條件下培養7天，倒置顯微鏡下計數集落數，以≥50個細胞的聚合計數為一個集落。
5.造血重建能力檢測擴增前后的臍血CD34+細胞通過尾靜脈注射入受致死劑量放射線照射的NOD/SCID小鼠，8周后，用人CD34，CD45，CD19，CD13抗體檢測小鼠骨髓中人臍帶血移植來源的造血干/祖細胞和向淋巴及髓系細胞分化的能力。
對比例在擴增體系中僅加入細胞因子，培養7天后，有核細胞數擴增了21倍，CD34+細胞擴增2.5倍，CD34+CD38-細胞擴增6倍，CFU-GM擴增了16倍，CFU-GEMM擴增5倍。擴增后的CD34+細胞注入致死劑量放射線照射的NOD/SCID小鼠體內不能長期重建造血和免疫系統。結果表明，在擴增體系中加入內皮細胞條件培養液，原始造血細胞CD34+CD38-擴增倍數明顯高于僅加入細胞因子擴增組，而成熟造血祖細胞CFU-GM，CFU-GEMM擴增倍數低于僅加入細胞因子的擴增組.僅加入細胞因子擴增后的造血細胞可能由于原始造血細胞擴增倍數較低，或擴增后性能改變，從而導致造血重建和免疫重建能力喪失.因此內皮細胞對體外擴增的原始造血細胞具有保護作用。
參考文獻1.Bhatia M.，Wang J.C.，Kapp U.，Bonnet D.&Dick J.E.(1997)Purification ofprimitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice.Proc Natl Acad Sci USA，94，5320.
2.Bryder D.&Jacobsen S.E.(2000)Interleukin-3 supports expansion of long-termmultilineage repopulating activity after multiple stem cell divisions in vitro.Blood，96，1748.
3.Holyoake T.L.，Alcorn M.J.，Richmond L.，Farrell E.，Pearson C.，Green R.，DunlopD.J.，Fitzsimons E.，Pragnell I.B.&Franklin I.M.(1997)CD34 positive PBPCexpanded ex vivo may not provide durable engraftment following myeloablativechemoradiotherapy regimens.Bone Marrow Transplant，19，1095.
4.Piacibello W.，Gammaitoni L.，Bruno S.，Gunetti M.，Fagioli F.，Cavalloni G.&Aglietta M.(2000)Negative influence of IL3 on the expansion of human cord bloodin vivo long-term repopulating stem cells.J Hematother Stem Cell Res，9，945.
5.Mayani H.，Little M.T.，Dragowska W.，Thornbury G.&Lansdorp P.M.(1995)Differential effects of the hematopoietic inhibitors MIP-1 alpha，TGF-beta，andTNF-alpha on cytokine-induced proliferation of subpopulations of CD34+cellspurified from cord blood and fetal liver.Exp Hematol，23，422.
6.Brandt J.E.，Bartholomew A.M.，Fortman J.D.，Nelson M.C.，Bruno E.，Chen L.M.，Turian J.V.，Davis T.A.，Chute J.P.&Hoffman R.(1999)Ex vivo expansion ofautologous bone marrow CD34(+)cells with porcine microvascular endothelial cellsresults in a graft capable of rescuing lethally irradiated baboons.Blood，94，106.
7.Davis T.A.，Robinson D.H.，Lee K.P.&Kessler S.W.(1995)Porcine brainmicrovascular endothelial cells support the in vitro expansion of human primitivehematopoietic bone marrow progenitor cells with a high replating potentialrequirement for cell-to-cell interactions and colony-stimulating factors.Blood，85，1751.
8.Brandt J.E.，Galy A.H.，Luens K.M.，Travis M.，Young J.，Tong J.，Chen S.，DavisT.A.，Lee K.P.，Chen B.P.，Tushinski R.&Hoffman R.(1998)Bone marrowrepopulation by hunan marrow stem cells after long-term expansion culture on aporcine endothelial cell line.Exp Hematol，26，950.
9.Kawano Y.，Kobune M.，Yamaguchi M.，Nakamura K.，Ito Y.，Sasaki K.，Takahashi S.，Nakamura T.，Chiba H.，Sato T.，Matsunaga T.，Azuma H.，Ikebuchi K.，Ikeda H.，Kato J.，Niitsu Y.&Hamada H.(2003)Ex vivo expansion of human umbilical cordhematopoietic progenitor cells using a coculture system with human telomerasecatalytic subunit(hTERT)-transfected human stromal cells.Blood，101，532.
10.Li W.，Johnson S.A.，Shelley W.C.，Ferkowicz M.，Morrison P.，Li Y.&Yoder M.C.(2003)Primary endothelial cells isolated from the yolk sac and para-aorticsplanchnopleura(P-Sp)support the expansion of adult marrow stem cells in vitro.Blood.
11.Wang QR，Yan Y，Wang BH.(1997)Establishment of murine bone marrow derivedendothelial cell line.J Exp Hemato，5，360.
權利要求
1.一種造血干/祖細胞擴增培養體系主要含有骨髓內皮細胞條件培養液。
2.根據權利要求1所述的造血干/祖細胞擴增培養體系，其特征在于骨髓內皮細胞條件培養液是小鼠骨髓內皮細胞條件培養液。
3.根據權利要求1所述的造血干/祖細胞擴增培養體系，其特征在于獲得骨髓內皮細胞培養液的方法是1)取骨髓細胞，制成單細胞懸液；2)去除非內皮細胞，并培養；3)對自發轉化的細胞繼續培養，培養至細胞生長至融合時，以磷酸鹽緩沖溶液洗滌，加無血清培養液培養，再收集上清液，即為骨髓內皮細胞條件培養液。
4.根據權利要求3所述的造血干/祖細胞擴增培養體系，其特征在于采用小鼠骨髓細胞。
5.根據權利要求1至4之一所述的造血干/祖細胞擴增培養體系，其特征在于還加入了細胞因子。
6.根據權利要求5所述的造血干/祖細胞擴增培養體系，其特征在于所說的細胞因子選自GM-CSF，EPO，IL-6，SCF，G-CSF，FL中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及造血干/祖細胞的擴增培養體系。本發明提供的一種造血干/祖細胞擴增培養體系含有骨髓內皮細胞條件培養液。在本發明中用內皮細胞條件培養液而不直接在細胞層上擴增，既避免了病毒污染，又避免造血細胞與內皮細胞直接接觸可能導致的細胞污染。本發明提供的擴增培養體系對造血祖細胞獲得了滿意的擴增效果。
文檔編號C12N5/06GK1609193SQ20031011043
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月21日 優先權日2003年10月21日
發明者王綺如, 程臘梅, 譚孟群 申請人:湖南惠霖生命科技有限公司