專利名稱：為檢測個體對甲型干擾素及雷巴威林混合處方的療效反應傾向的方法
技術領域：
本發明涉及一種對C型肝炎病毒(HCV)的治療，特別是涉及一種與甲型干擾素(IFN-α)及雷巴威林(Ribavirin)混合處方對C型肝炎患者的療效相關的基因及基因多態性。
背景技術：
根據世界衛生組織(WHO)的最新估計，全球約有1.7-2億人感染慢性的C型肝炎病毒。C型肝炎病毒的盛行率在一地理區域中有明顯的地理及人口統計上的變異。在歐洲，尤其是在地中海國家中，C型肝炎的盛行率與年齡呈平行地上升，而在美國則以30-49歲者最為盛行，可參見W.R.Kim，The burden of hepatitis C in the United States，Hepatology 36(2002)S30-S34。在發展中國家，C型肝炎病毒的新感染率持續下降，但是在未發展國家中，因為使用被污染過的血液進行輸血，造成大多數感染C型肝炎病毒的新病例持續增加。傳染C型肝炎病毒的主要危險因素隨著時間由輸血轉變為西方世界的藥物注射傳染，而其它相關的重要危險因素包括多重性伴侶的不安全性關系、職業性的接觸、垂直或出生時的感染、醫院或醫源性的感染、不安全的刺青、穿刺及針灸，可參見M.J.Alter，Prevention of spread of hepatitis C，Hepatology 36(2002)S93-S98。
C型肝炎病毒最近才被分類在黃病毒科中唯一的肝炎病毒屬中，是一種小核糖核酸(RNA)病毒，可參見B.Robertson，G.Myers，C.Howard，T.Brettin，J.Bukh，B.Gaschen，et al.，Classification，nomenclature，and database development for hepatitis C virus(HCV)and relatedvirusesproposals for standardization，Arch Virol 143(1998)2493-2503。C型肝炎病毒基因組為大小約9.6kb的單股核糖核酸，可編碼約3,000個氨基酸的單一多肽，可參見M.Major，S.M.Feinstone，Themolecular biology of hepatitis C，Hepatology 25(1997)1527-1538。此一C型肝炎病毒多肽在轉譯后被裁剪，形成許多結構及非結構性蛋白質，包含兩個封套糖蛋白(E1及E2)、核心蛋白(core-C)以及許多非結構性蛋白質(從NS2至NS5)。其中某些病毒蛋白質顯示參與肝病的致病機轉以及對干擾素治療的抗藥性發展中。C型肝炎病毒的核心蛋白不論是以全長度或是裁減過的型態，顯示出會誘導感染細胞的凋亡，可參見A.Ruggieri，T.Harada，Y.Matsuura，T.Miyamura，Sensitization toFas-mediated apoptosis by hepatitis C virus core protein，Virology229(1997)68-76，因此可能直接地參與肝病的細胞增殖及肝癌發展的致病機轉中。核心蛋白及NS5A蛋白也被發現參與脂質的細胞代謝，并對脂肪變性的發展有直接的幫助，可參見G.Perlemuter，A.Sabile，P.Letteron，G.Vona，A.Topilco，Y.Chretien，et al.，Hepatitis C viruscore protein inhibits microsomal triglyceride transfer proteinactivity and very low density lipoprotein secretiona model ofviral-related steatosis，FASEB J 16(2002)185-194，此癥狀即是感染C型肝炎的主要特征，可參見L.Rubbia-Brandt，R.Quadri，K.Abid，E.Giostra，P.J.Male，G.Mentha，et al.，Hepatocyte steatosis isa cytopathic effect of hepatitis C virus genotype 3，J Hepatol 33(2000)106-115。此外，NS5A蛋白可能包含一干擾素敏感性決定位置(ISDR)，決定了調節細胞對干擾素的反應，可參見N.Enomoto，I.Sakuma，Y.Asahina，M.Kurosaki，T.Murakami，C.Yamamoto，et al.，Mutationsin the non-structural protein 5A gene and response to interferon inpatients with chronic hepatitis C virus 1b infection，N Engl J Med.334(1996)77-81。此蛋白質位置可以連接或抑制蛋白質激酶R(PKR)，而蛋白質激酶R的活性對于決定細胞間對干擾素的反應及抗病毒的狀態發展具有重要地位，可參見S.L.Tan，M.G.Katze，How hepatitis C viruscounteracts the interferon responsethe jury is still out on NS5A，Virology 284(2001)1-12。
C型肝炎病毒目前有6種主要基因型以及許多的次要亞型，在歐洲及美國以基因型1a及1b的出現最普遍，然后是基因型2及3，此四種基因型也普遍存在于世界其它地方。另一方面，其它基因型只普遍存在于某些特定的地理區域，例如，基因型4出現于埃及、基因型5出現于南非、以及基因型6出現于東南亞。就抗病毒療法的療效而言，C型肝炎病毒的基因型非常重要，可參見T.Poynard，P.Marcellin，S.S.Lee，et al.，Randomized trial of interferon alpha 2b plus ribavrin for 48 weeksor for 24 weeks versus interferon alpha 2b plus placebo for 48 weeksfor treatment of chronic infection with hepatitis C virus.Lancet352(1998)1426-32，以及J.G.McHutchison，S.C.Gordon，E.R.Schiff，et al.，Interferon alpha-2b alone or in combination with ribavirinas initial treatment for chronic hepatitis C.N Engl J Med.339(1998)1485-92，基因型2及3對于抗病毒療法的反應就比基因型1要好。C型肝炎病毒的某些株被報導有更強的毒力，但是相關的分子決定位置及機制則仍然未被了解，可參見P.Farci，S.J.Munoz，A.Shimoda，et al.，Experimental transmission of hepatitis C virus-associated fulminanthepatitis to a chimpazee.J Infect Dis 179(1999)1007-11。此外，由日本的次要亞型1b得知，以干擾素治療的療效可以追溯到與NS5A區域的基因變異相關，可參見N.Enomoto，I.Shakuma，Y.Asahina，et al.，Mutation in the nonstructural protein 5A gene and response tointerferon in patients with chronic hepatitis virus 1b infection.N Engl J Med.334(1996)77-81，但是，這一研究結果卻不能在由歐洲或美洲分離出的C型肝炎病毒次要亞型1b中得到重復驗證，可參見R.T.Chung，A.Monto，J.L.Dienstag，L.M.Kaplan，Mutations in the NS5Aregion do not predict interferon-responsiveness in American patientsinfected with genotype 1b hepatitis C virus.J Med Virol 58(1999)353-8及S.Zeuzem，J.H.Lee，W.K.Roth，Mutations in the non-structural 5A gene of European hepatitis C virus isolates andresponse to interferon alpha.Hepatology 25(1997)740-4。
C型肝炎的自然病史變異很大，感染帶原者可能在很長的一段時間后，導致肝硬化及相關的并發癥，或仍是保持良性，大部分則是演變成持續進行的慢性感染。肝炎的嚴重度、進程及結果也被許多的輔因子所影響，可參見A. Alberti，L.Chemello，L.Benvegnù，Natural history ofhepatitis C，J Hepatol 31(Suppl 1)(1999)17-24。經由對感染C型肝炎的患者進行10-30年的回溯性研究結果顯示，17-55％(平均值為42％)的患者發展成肝硬化、1-23％發展成肝細胞癌、以及4-15％死于肝臟的相關疾病。這些統計數據將會在預測性研究中大量降低，其中在首次接觸后8-16年間患者的隨訪中顯示，7-16％的患者發展成肝硬化(平均值為11％)、0.7-1.3％發展成肝細胞癌、以及1.3-3.7％死于肝臟的相關疾病，可參見L.B.Seeff，Natural history of chronic hepatitis C，Hepatology 36(2002)S35-S46。在一系列持續9-45年間的回溯-預測性研究中發現，0.3-15％的患者發展成肝硬化、0-1.9％發展成肝細胞癌、以及0-2.8％死于肝臟的相關疾病。這些調查也一并揭露可能影響慢性C型肝炎病程及結果并造成巨大變異性的許多患者及環境的影響因素。一群有區別的患者在感染后進行相似時間(20-25年)的隨訪后，依據不同的結果及造成肝硬化的比例，這些差異被清楚地描述出來。在前血清學時代，經由輸血接種感染而大多在45-65歲的男性成人患者中，15-27％發展成肝硬化，可參見R.L.Koretz，H.Abbey，E.Coleman，G.Gitnick，NANB post-transfusion hepatitislooking back on the second decade，Ann Intern Med119(1993)110-115、F.Tremolada，C.Cassin，A.Alberti，C.Drago，A.Tagger，M.L.Ribero，G.Realdi，Long-term follow-up of NANB(type C)post-transfusionhepatitis，J Hepatol 16(1992)273-281，以及A.M.Di Bisceglie，Z.D.Goodman，K.G.Ishak，J.H.Hoofnagle，J.J.Melpolder，H.J.Alter，Long-term clinical and histopathological follow-up of chronicpost-transfusion hepatitis，Hepatology 14(1991)969-974；對照社區型感染C型肝炎者有4％發展成肝硬化，可參見A.J.Rodger，S.Roberts，A.Lanigan，S.Bowden，N.Crofts，Assessment of long-term outcomesof community-acquired hepatitis C infection in a cohort with serastored from 1971-1975，Hepatology 32(2000)582-587；1％的年輕毒癮者發展成肝硬化，可參見D.L.Thomas，J.As temborski，R.M.Rai，F.A.Anania，M.Schaeffer，N.Galai，et al.，The natural history ofhepatitis C virus infectionhost，viral and environmental factors，J Am Med Assoc 284(2000)450-456；年輕女性因污染的抗D免疫球蛋白(anti-DIg)而感染者，0.4-2％發展成肝硬化，可參見E.Kenny-Walsh，for the Irish Hepatology Research Group，Clinical outcome afterhepatitis C infection from contaminated anti-D immune globulin，NEngl J Med 340(1999)1228-1233；以及0.3％的C型肝炎病童發展成肝硬化，可參見M.Wiese，F.Berr，M.Lafrenz，H.Porst，V.Olsen，Lowfrequency of cirrhosis in a hepatitis C(genotype 1b)single-sourceoutbreak in Germanya 20-year multicenter study，Hepatology 32(2000)91-96。這些發現指出感染病毒量及源頭、年齡及性別都是影響慢性C型肝炎的病程及結果的重要因子。
治療慢性C型肝炎感染的患者大多依據一定的準則，可參見NationalInstitutes of Health Consensus Development Conference Panelstatementmanagement of hepatitis C.Hepatology 26(1997)Suppl12S-10S，以及EASL International Consensus Conference on HepatitisCParis，26-28，February 1999，consensus statement.J Hepatol 30(1999)956-961。參見EASL International Consensus Conference onHepatitis CParis，26-28，February 1999，consensus statement.JHepatol 30(1999)956-961，1999年的建議書建議對現在以干擾素或雷巴威林單獨治療的有上述跡象但還沒有并發癥的對照患者給予干擾素及雷巴威林混合處方治療，對于體重超過75公斤的患者給予一周三次皮下注射三百萬單位的甲型干擾素及每日口服1200毫克的雷巴威林，對于體重少于75公斤的患者則將每日口服雷巴威林劑量降為1000毫克。通常雷巴威林以分開的劑量在早晨及晚間給藥，甲型干擾素則在睡前注射。
治療的效力通常且傳統上以測量血生化反應(正常的丙氨酸轉氨酶水準)來決定，但在新近引入的分析中，以偵測C型肝炎病毒的核糖核酸來評估病毒學的反應(于C型肝炎病毒的核糖核酸定性檢驗中定義陰性的結果來比較測定)，作為治療是否成功的要件。因為在治療停止后，對治療不一定能持續的反應，臨床試驗的成功與否乃是就治療結束時的反應(停止給藥時的反應)及治療中斷后六個月(持續的治療反應)來評估。持續性地具病毒學反應的患者有較高機率也有持續性的生化、病毒及組織性反應，可參見O.Reichard，H.Glaumann，A.Fryden，G.Norkrans，R.Wejstal，O.Weiland，Long-term follow-up of chronic hepatitis C patients withsustained virological response to alpha-interferon.J Hepatol 30(1999)783-787。
C型肝炎患者對單以干擾素治療的治療結束時反應率為40％，但持續的反應比例則不到20％，可參見T.Poynard，P.Marcellin，S.S.Lee，etal.Randomised trial of interferon alpha2b plus ribavirin for 48weeks or for 24 weeks versus interferon alpha 2b plus placebo for 48weeks for treatment of chronic infection with hepatitis C virus.Lancet 352(1998)1426-1432，以及J.G.McHutchison，S.C.Gordon，E.R.Schiff.et al. Interferon alfa-2b alone or in combination withribavirin as initital treatment for chronic hepatitis C.N Engl JMed 339(1998)1485-1492。尤其是感染在美國及西歐最為盛行的基因型，C型肝炎病毒基因型1a或1b的患者身上，更為明顯。兩個大型的預測性試驗，可參見T.Poynard，P.Marcellin，S.S.Lee，et al.，Randomisedtrial of interferon alpha2b plus ribavirin for 48 weeks or for 24weeks versus interferon alpha2b plus placebo for 48 weeks fortreatment of chronic infection with hepatitis C virus.Lancet 352(1998)1426-1432，以及J.G.McHutchison，S.C.Gordon，E.R.Schiff，et al.，Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirinas initital treatment for chronic hepatitis C.N Engl J Med 339(1998)1485-1492，證實以甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療的對照患者的持續病毒學反應明顯地提高了，反應比例從16％上升至40％。此外，這兩個研究也同時顯示以此治療方式的理想的臨床研究結果與病毒基因型及治療前的病毒量有關。在治療前感染少量C型肝炎病毒基因型第2或3型的患者，可在治療后24周時得到最大的反應；而感染大量C型肝炎病毒基因型第1型的患者，可在治療后48周時才得到較理想的結果。這個發現證實在建議治療所需時間時須考慮感染病毒的基因型及治療前感染的病毒量，可參見EASL International Consensus Conference on Hepatitis CParis，26-28，February 1999，consensus statement.J Hepatol 30(1999)956-961。但是，基于對C型肝炎病毒核糖核酸定性反應的檢驗基準仍未統一，病毒量也會因時間而自然地波動，因此目前常規上不使用病毒量來決定療程的長短。
近年來，因為以甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療慢性C型肝炎病毒患者，使得治療上有長足的進步。最近，更進一步改進為以聚乙烯二醇化的干擾素(PEG-IFNs)混合雷巴威林來治療。近期美國國家衛生研究院(NIH)對管理C型肝炎所召開的共識會議，以目前所得的資料，使用聚乙烯二醇化的干擾素混合雷巴威林的抗病毒療法治療慢性C型肝炎可達到最大的反應率，至少對于C型肝炎病毒第1型的患者，此一療程已被視為是治療慢性C型肝炎的新基準療法，可參見C A.Alberti and L.Benvegnu，Management of hepatitis C，J.Hepatology 38(2003)S104-S118。
影響持續病毒反應率的因素包括病毒、宿主因子及肝臟的感染病程，病毒影響分子包括病毒基因型(基因型第1a、2及3型對于治療較有反應)、病毒血癥的程度(每毫升少于二百萬次的復制較有利于治療反應)、以及病毒的變異程度(C型肝炎病毒基因E2/NS1區域的變異度影響患者對干擾素的反應)。對治療最為有利的宿主影響因素為年紀輕(小于四十歲)及女性。對治療最為有利的病理影響因素則為治療前有低的丙氨酸轉氨酶及天門冬氨酸轉氨酶、尚無肝硬化及低的病理纖維化指數，可參見A.Alberti and L.Benvegnu，Management of hepatitis C，J.Hepatology38(2003)S104-S118，以及G.M.Lauer and B.D.Walker，Hepatitis C virusinfection，N Engl J Med 345(2001)41-52。此外，基于對治療反應上有大程度的各別差異，因此推測宿主本身的基因因子也有很大的影響。
C型肝炎蛋白質受器CD81是一個由四個細胞膜間及兩個細胞外次單元構成的分子量二萬六千道爾頓(Da)的細胞膜結合蛋白質，可參見S.Levy，S.C.Todd，and H.T.Maecker，CD81(TAPA-1)A molecule involved insignal transduction and cell adhesion in the immune system.Annu.Rev.Immunol.16(1998)89-109，其為tetraspanins蛋白質巨族中的一員，可參見H.T.Maecker，S.C.Todd，and S.Levy，The tetraspaninsuperfamilymolecular facilitators.FASEB J.11(1997)428-442。大多數的tetraspanins最初被視為是一種白血球抗原，但是現在被證實，tetraspanins，尤其是CD81，可表現在許多不同型態的細胞中而參與細胞菜單現，包括細胞附著、遷移、細胞型態的改變及細胞的活化狀態，可參見I.Tachibana and M.E.Hemler，Role of transmembrane 4 superfamily(TM4SF)proteins CD9 and CD81 in muscle cell fusion and myotubemaintenance，J.Cell Biol.146(1999)893-904。在免疫系統中，在B細胞上的CD81與CD21、CD19、以及Leu13組成混合處方體。該混合處方體的構成可經由B細胞受器連結抗體特異辨識及CD21參與的補充性辨識來降低使B細胞活性化的臨界值，可參見D.T.Fearon and R.H.Carter，TheCDl9/CR2/TAPA-1 complex of B lymphocyteslinking natural toacquired immunity.Annu.Rev.Immunol.13(1995)127-149。在T細胞中，CD81連結CD4及CD8提供協同刺激性信號給予CD3，可參見T.Imai，M.Kakizaki，M.Nishimura，and O.Yoshie，Molecular analyses if theassociation of CD4 with two members of the transmembrane 4superfamily，CD81 and CD82.J.Immunol.15(1995)1229-1239。研究中同時顯示T細胞中CD81的表現可大大地提高同源性T-B細胞的相互影響及擴大第二幫助型T細胞(Th2)在細胞內極化的活化路徑，可參見J.Deng，R.H.Dekruyff，G.J.Freeman，D.T.Umetsu，and S.Levy，Criticalrole of CD81 in cognate T-B cell interactions leading to Th2 responses，Intl.Immunol.14(2002)513-523。
最近的體外研究顯示，C型肝炎病毒顆粒可以連結CD81，而且此連結是由CD81的第二細胞外圈及C型肝炎病毒外封套的第二醣蛋白所調節，可參見P.Pileri，Y.uematsu，S.Campagnoli，G.Galli，F.Falugi，R.Petracca，A.J.Weiner，M.Houghton，D.Rosa，G.Grandi，and S.Abrignani，Binding of hepatitis C virus to CD81.Science 282(1998)938-941。既然只藉由CD81及E2的交互作用就可有效地連結整個C型肝炎病毒顆粒，可以假設CD81在C型肝炎病毒連結及進入細胞時，扮演接受器的角色，可參見M.Flint，C.Maidens，L.D.Loomis-Price，C.Shotton，J.Dubuisson，P.Monk，A.Higginbottom，S Levy，and J.A.McKeating，Characterization of hepatitis C virus E2 glycoprotein interactionwith a putative cellular receptor CD81.J.Virol.73(1999)6235-6244。但是，至今仍未有決定性的證據去論證CD81確實介入細胞吸入C型肝病病毒粒子。最近，研究顯示憑借單獨以甲型干擾素或混合雷巴威林處方治療，可以明顯地調降患者體內外圍血液細胞及肝細胞中的膜結合CD81蛋白，可參見B.Kronenberger，B.Ruster，R.Liez，S.Weber，A.Piier，J.H.Lee，W.K.Roth，and S.Zeuzem，Interferon alfadown-regulates CD81 in patients with chronic hepatitis C.Hepatology33(2001)1518-1526。此外，C型肝炎患者的外圍血液淋巴球中的CD81蛋白質總量也顯著地高于健康者。另外，以治療四周后患者的初始病毒反應與無初始病毒反應者相比，細胞表面相關的CD81蛋白質數值降低，因此推論證明甲型干擾素及雷巴威林可調節CD81在體內、體外的表現，而且CD81的表現與C型肝炎患者的初始病毒反應相關。但是，甲型干擾素及雷巴威林對CD81的詳細表現調節機制則仍不清楚。再者，對于不同患者對治療所表現出的不同的CD81表現水準，尤其是在持續治療時的基礎理由則仍需要更多基因學層次上的研究才能得知。
發明內容
因此，本發明提供了一種顯示出與甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療C型肝炎患者有關聯性的CD81基因編碼序列的單離多核苷酸，該多核苷酸包含以甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應相關的基因多態性，因此可用來作為篩檢C型肝炎患者是否適合以甲型干擾素及雷巴威林混合處方來做治療的探針或探子(probe)。
本發明也提供CD81單套型信息的連鎖不平衡構造，可用來預測對治療有潛力的反應者。
本發明還提供偵測CD81基因多態性及其相關區域的方法，以及使用本發明分離出的多核苷酸來檢測以甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療的反應傾向的方法。
圖1顯示表1，列出以模版引導的終止染料分子并入的螢光偏極化偵測法(FP-TDI)決定CD81的單核苷酸多態性的引物；圖2顯示反應者與不反應者在基因rs800136處及其鄰近區域的序列軌跡；圖3顯示反應者與不反應者在基因rs800137處及其鄰近區域的序列軌跡；圖4顯示反應者與不反應者在基因rs800334處及其鄰近區域的序列軌跡；圖5顯示反應者與不反應者在基因pos1989603處及其鄰近區域的序列軌跡；圖6顯示反應者與不反應者在基因rs8002522012及rs8002522013處及其鄰近區域的序列軌跡；圖7顯示反應者與不反應者在基因rs800335處及其鄰近區域的序列軌跡；圖8顯示表2，列出華人C型肝炎患者的CD81基因單核苷酸多態性分布；圖9顯示表3，列出以甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療患者的反應傾向相關的CD81基因及其兩側區域的單核苷酸多樣性標記；圖10顯示表4，列出CD81-SNPrs800136的等位基因及相關治療反應狀態；圖11顯示表5，列出CD81-SNPrs800137的等位基因及相關治療反應狀態；圖12-1和圖12-2顯示表6及7，列出CD81-SNPrs800334的等位基因、基因型及相關治療反應狀態；圖13-1和圖13-2顯示表8及9，列出CD81-SNPpos1989603的等位基因、基因型及相關治療反應狀態；圖14-1和圖14-2顯示表10及11，列出CD81-SNPrs2522012的等位基因、基因型及相關治療反應狀態；圖15-1和圖15-2顯示表12及13，列出CD81-SNPrs2522013的等位基因、基因型及相關治療反應狀態；圖16-1和圖16-2顯示表14及15，列出CD81-SNPrs800335的等位基因、基因型及相關治療反應狀態；圖17顯示以甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療患者的反應相關的包含3’及5’端的CD81基因單套型區段、CD81的基因內區域及單核苷酸多態性位置；圖18顯示表16，列出CD81-SNPrs800136及rs800137的單套型及相關治療反應狀態；以及圖19顯示表17，列出CD81-SNPrs800334、pos1989603、rs2522012、rs2522013及rs800335的單套型及相關治療反應狀態。
具體實施例方式
為使本領域的技術人員對本發明的目的及優點能夠更清處地了解，現配合圖式所作的詳細敘述如下。
本發明直接探究臨床上以甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療C型肝炎患者的臨床反應度與CD81基因內及周圍的基因多態性的關聯，結果顯示治療的反應度與宿主的CD81基因型有關，發現CD81的基因上游的等位基因及基因型的單核苷酸多態性分布在反應群及不反應群中有很重大的差異存在。進一步分析CD81基因的連鎖不平衡構造，發現一些重要的單核苷酸多態性分布群聚在兩個明顯的連鎖不平衡區段中，此外，在這兩個區段中的單套型分布在反應群及不反應群中有很重大的差異存在。所有的結果顯示CD81可能直接參與治療的反應路徑，而且其基因變異度在決定治療結果上扮演重要的角色。
為供參考，附錄提供CD81的核苷酸序列及其往5端上游延伸一5K的外子1及往3端下游延伸1Kb的結尾序列(poly-A tail)。
方法及材料<研究對象>
取自臺大醫院就診的九十二名患有慢性C型肝炎的華人患者，所有患者的血樣都是抗C型肝炎病毒陽性及C型肝炎核糖核酸陽性。當患者符合以下的狀況條件，則被排除以干擾素來治療中性球總數每立方厘米少于1,500個細胞、血紅素于女性每100毫升少于12克或男性每100毫升少于13克、血小板總數每立方厘米少于90,000個細胞、病史中有不易控制的攝護腺疾病者、以及血清肌酸酐大于平時篩檢上限標準1.5倍的患者。
對所有患者都施以每天1,200毫克的雷巴威林及每周3次每次3-5百萬單位甲型(2a或2b)干擾素混合處方治療六個月，并在療程后以臨床、血生化及血清學標志追蹤治療反應一年以上。
將慢性C型肝炎患者在療程后六個月體內的C型肝炎核糖核酸由陽性轉為陰性者，定義為對以甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療有持續反應者。患者同時患有B或D型肝炎者也被排除在研究之外。每個患者須填寫告知后同意的研究協議書。此研究協議遵照1975年在赫爾辛基頒布的倫理準則，并經學會檢閱委員會核準。
<基因體去氧核糖核酸的分離>
依據制造商的說明，使用QIAamp(商品名)去氧核糖核酸血液套組將基因體去氧核糖核酸由血樣中分離，并馬上使用洋菜膠體電泳分析抽出基因體去氧核糖核酸，以分光光度計定量后，儲存于-80℃中備用。
<單核苷酸多態性的分析>
以去氧核糖核酸直接定序法或是以由X.Chen等人發展出來的模版引導的終止染料分子并入的螢光偏極化偵測法分析單核苷酸多態性，可參見X.Chen，L.Levine，and P.-Y.Kwok，Fluorescence polarization inhomogeneous nucleic acid analysis.Genome Res.9(1999)492-8。
以去氧核糖核酸直接定序法分析單核苷酸多態性從基因體去氧核糖核酸多重擴增CD81片段CD81片段藉由兩階段的聚合酶連鎖反應(PCR)擴增，初始的擴增步驟是一包含12對不同引物的多重聚合酶連鎖反應，反應混合物包含50ng基因體去氧核糖核酸、各0.1μM的12對不同引物、0.25mM去氧核糖核酸(dNTP)混合物、100mM氯化鉀、20mM三氫氧甲胺基甲烷-氯化氫鹽(Tris-HCl)pH8.3、0.2％Triton X-100(接口活性劑商品名)、5mM氯化鎂、10單位VioTaq(商品名)去氧核糖核酸聚合酶(VIOGENE公司)、以及0.05單位pfu去氧核糖核酸聚合酶(Stratagene公司)的總體積100μL混合反應物。此反應以觸減程序(touchdown programs)進行，其包含94℃4分鐘的初始變性分離反應、10回合40秒94℃融解反應、從72℃每回合減少1℃的40秒粘合反應、以及72℃1分30秒的延伸反應，在接下來的25回合中，變性分離及延伸程序的條件不變，但是將粘合反應溫度改為62℃，以及最終一回合72℃10分鐘的延伸反應。擴增是使用美商應用生命系統公司(ABI)的2700聚合酶連鎖反應器執行，擴增后的產物依廠商的說明以美商密理博生命科學公司(Millipore)的超濾膜及多篩檢的聚合酶連鎖反應盤純化。在下一個步驟中，在聚合酶連鎖反應緩沖液中使用從上述的78-72℃觸減程序中同時被擴增的產物純化后的多重產物當作模板，而將CD81產物的特異791對堿基擴增。在此引證美國專利申請號10/446,940，以提供更多以觸減程序進行兩階段聚合酶連鎖反應的細節。
以染料標記終止物將聚合酶連鎖反應產物定序每一個擴增純化后的反應產物被分入96個定序反應，該定序反應在聚合酶連鎖反應器中進行，每一反應混合物包含聚合酶連鎖反應產物、大染料終止物預備反應混合物(Big Dye Terminator Ready-Reaction-Premix)及10皮摩爾(pmol)的定序引物。反應的進行包含94℃30秒28回合、48℃30秒、以及58℃2分鐘。反應產物藉由乙醇沉淀法純化，再以超純水重新溶出，并加載ABI 3700毛細管序列發生器中。
定序分析及尋找等位基因去氧核糖核酸定序資料及軌跡由ABI公司的去氧核糖核酸定序儀控制，等位基因的尋找以Phred(商品名)進行，且以Phrad作定序組合。依據Q值大于20后才進行分析以確定數據質量，并以PolyPhred(商品名)作為初始具潛力的單核苷酸多態性位置的鑒定。單核苷酸多態性位置的鑒定由三位熟練的研究者獨立地以手工方式證實，如果取得至少兩個研究者的確認，可被視為是真的單核苷酸多態性位置。同樣地，各別的受試個體的基因型也是先由計算機軟件決定，再經由手工確認其單核苷酸多態性位置。
單核苷酸多態性位置的基因型模版引導的終止染料分子并入的螢光偏極化偵測法的分析流程如下(1)引物設計，(2)聚合酶連鎖反應擴增，(3)額外的聚合酶連鎖反應引物及去氧核糖核酸降解，(4)單核苷酸延伸反應，以及(5)螢光偏振測量。
(1)引物設計為每一單核苷酸多態性位置設計4個引物，其中兩個用在擴增包含此單核苷酸多態性位置的去氧核糖核酸片段的聚合酶連鎖反應，另外兩個則用在模版引導的終止染料分子并入的螢光偏極化偵測反應。使用primer3設計聚合酶連鎖反應引物，該引物被設計為融解溫度在54℃至56℃之間。模版引導的終止染料分子并入的螢光偏極化偵測反應的引物設計使用一原始由Vieux等人發展的程序，可參見E.F.Vieux，P.-Y.Kwok，R.D.Miller，Primer design for PCR and sequencing in high-throughput analysis ofSNPs.Biotechniques.(2002)Suppl28-30，32.，并經本發明研究內部的生物信息小組修飾為融解溫度在50℃至55℃之間，長度介于20至30基座(約一萬道爾頓)。本研究中用來決定CD81的單核苷酸多態性基因型的引物表列于圖1的表1中。
(2)聚合酶連鎖反應擴增人體基因去氧核糖核酸(5ng)是在包含1x聚合酶連鎖反應緩沖液(ABI)、2.5mM氯化鎂、50μM去氧核糖核酸、0.1μM每對正向及反向的引物、以及0.2單位AmpliTaq Gold(商品名)去氧核糖核酸聚合酶的總體積10μl的反應混合物中擴增。此反應混合物先于95℃反應10分鐘來活化AmpliTaq Gold去氧核糖核酸聚合酶，然后進行35回合的擴增反應。每一回合包含初始95℃10秒的變性分離、55℃20秒的引物粘合反應、以及72℃30秒的引物延伸反應，最終一回合72℃10分鐘的引物延伸反應，并將產物保存于4℃中備用。
(3)額外的聚合酶連鎖反應引物及去氧核糖核酸降解在聚合酶連鎖反應完成之后，加入2μl聚合酶連鎖反應清理試劑于5μl聚合酶連鎖反應混合物中，此聚合酶連鎖反應清理試劑包含1單位蝦堿性磷酸及1單位大腸桿菌第一外切核酸酶于蝦堿性磷酸緩沖液(25mM三氫氧甲胺基甲烷-氯化氫鹽pH8.5及2.5mM氯化鎂)。此降解反應在37℃中進行一小時，然后培養于80℃中15分鐘進行酵素活性的不活化反應。
(4)單核苷酸延伸反應在Exo-SAP酵素性處理聚合酶連鎖反應產物(7μl)中加入13μl模版引導的終止染料分子并入的螢光偏極化偵測反應雞尾酒液(AcycloPrime-FP混合物，Perkin Elmer公司)，此雞尾酒液包含進行反應的成分，0.25M單核苷酸酸多態性引物、1μl Acyclo終端混合物(Perkin Elme公司)、以及0.25單位AcycloPol去氧核糖核酸聚合酶(Perkin Elmer公司)，并最終濃度為一倍的反應緩沖物(Perkin Elmer公司)。于95℃保持反應2分鐘，接著進行95℃15秒及55℃30秒的25至50回合的反應，并于反應結束后，保存產物于4℃。
(5)螢光偏振測量螢光偏振測量藉由Perkin Elmer公司的螢光讀取機(Victor2)進行。螢光偏振測量值由以下公式定義p＝(Ivv-Ivh)/(Ivv+Ivh)[Eq.1]此處，Ivv為當激發及放射極化濾光器平行時測量出的放射強度，而Ivh為當濾光器垂直時測量出的放射強度。此測量值經數學轉換為表示千分之一的偏振測量值mP＝1000×(Ivv-(G×Ivh))/(Ivv+(G×Ivh)) [Eq.2]其中G是量值接近1的閘門因子，用來調整因使用兩個光學路徑造成的微小差異。G值是以30mP值使用的染劑為基準，以假定的mP值去估計四個不同染劑來測量Ivv和Ivh的值。
基因型的決定每一樣品的基因型確認是借助制造商提供的基因尋找程序SNPScorer。簡而言之，兩個表示兩種可能等位基因其中之一的染劑mP值，被標示在橫坐標上，使用一資料叢集算法將資料區分為四個分開的群組，而將每個樣品的基因型獨立地分派在所屬的群組中。
圖2至圖7分別顯示反應者與不反應者在CD81的單核苷酸多態性等位基因及其鄰近區域的序列軌跡。圖2顯示反應者與不反應者在基因rs800136處及其鄰近區域的序列軌跡。圖3顯示列出反應者與不反應者在基因rs800137處及其鄰近區域的序列軌跡。圖4顯示反應者與不反應者在基因rs800334處及其鄰近區域的序列軌跡。圖5顯示列出反應者與不反應者在基因pos1989603處及其鄰近區域的序列軌跡。圖6顯示反應者與不反應者在基因rs8002522012處及rs8002522013處及其鄰近區域的序列軌跡。圖7顯示反應者與不反應者在基因rs800335處及其鄰近區域的序列軌跡。
單套型及其出現頻率估計基于未定性的基因型資料，藉計算機程序PHASE(商品名)估計單套型及其出現頻率，可參見Stephens等人(2001)作品內的描述。PHASE使用一貝氏(Bayesian)算法，將未知的單套型視為一未察覺的隨機量，并對其評估出現頻率及于雙套族群中有條件分布的多基因座單套型。
連鎖不平衡構造的統計分析起初的連鎖不平衡構造分析是依據比較所有的單核苷酸多態性基因座的等位位置表現而推算，顯著的位準是由卡方試驗(x2test)來決定，由對應的2×2表格，擁有一出現頻率小于0.05的次要等位基因單核苷酸多態性被排除在連鎖不平衡構造分析以外。許多廣泛使用連鎖不平衡構造統計的連鎖不平衡構造也被推算出來，包括D、D’及r2。以基因座L1及L2，各分別包含等位基因1及2，當基因座等于i時(i＝1，2)，使pi代表等位基因1的出現頻率，且使qi＝1-pi代表等位基因2的出現頻率。使p11代表單套型11的出現頻率，并使pjk代表單套型jk的出現頻率，不平衡系數D是在已發現的單套型出現頻率與獨立統計下的預期頻率之間的差值D＝p11-p1p2。等位基因的標示可能會影響D的符號，但不影響其絕對值。相關的不平衡D’出現范圍從1至-1，由可能的最大值(絕對值)除D而得到(D′＝D/|D|max，若D＜0，則|D|max＝max(p1p2，q1q2)，若D＞0，則|D|max＝min(q1p2，p1q2))，并獨立于等位基因出現頻率外。相關系數r2＝D2/p1p2q1q2。此研究報告的D’、r2、x2及P值都依據x2而來。
相關研究的統計分析每一單核苷酸多態性的等位基因出現頻率及基因于R(反應者)與NR(不反應者)之間的出現頻率使用卡方試驗或費雪準確檢定(Fisher exacttest)來比較。R作為一對照組，優劣比用來測試哪一個等位基因或是基因型是危險因子。依據優劣比，等位基因及基因型相關的反應度或不反應度可被定義出來。卡方試驗或費雪準確檢定同時也被用來評估在一相同基因或路徑上所含的單核苷酸多態性的聯合基因型。所有統計用的試驗皆為雙尾性及P值小于0.05，是經過考慮有統計上的意義的。此分析使用SAS第8版的統計軟件來制作。
結果(1)挑選CD81基因的單核苷酸多態性選取華人C型肝炎病毒患者族群，包含CD81基因及往3端及5端各延伸30Kb的近70Kb的染色體區域上辨識出共包含18個單核苷酸多態性及一個插入點。在圖8的表2中總結列出出現的位置、序列及等位基因出現頻率。在這些多態性位置中，16個單核苷酸多態性的次要等位基因出現頻率大于10％，被視為是分析與治療反應相關的基因多態性的信息性標記。
(2)CD81上的基因及其兩側區域的相關單核苷酸多態性標記與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性在圖9的表3中，包含19個單核苷酸多態性，其中七個顯示出與基因及治療反應狀態有關。此七個單核苷酸多態性中有五個在反應群及不反應群間的基因型分布有顯著的不同。統計分析的結果總結表列在表4至14。
(3)CD81上的SNPrs800136等位基因與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性將CD81-SNPrs800136等位基因分布情形及其治療反應狀態總結表列于圖10的表4中，發現CD81-SNPrs800136上的T等位基因與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的等位基因。
(4)CD81上的CD81-SNPrs800137等位基因與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性將CD81-SNPrs800137等位基因分布情形及其治療反應狀態總結表列于圖11的表5中，發現CD81-SNPrs800137上的T等位基因與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的等位基因。
(5)CD81上的CD81-SNPrs800334與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性將CD81-SNPrs800334等位基因及基因型分布情形及其治療反應狀態總結表列于圖12-1和圖12-2的表6及7中，發現CD81-SNPrs800334上的G等位基因及GG基因型與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的等位基因。
(6)CD81上的CD81-SNPpos1989603與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性將CD81-SNPpos1989603等位基因及基因型分布情形及其治療反應狀態總結表列于圖13-1和圖13-2的表8及9中，發現CD81-SNPpos1989603上的A等位基因及AA基因型與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的等位基因。
(7)CD81上的CD81-SNPrs2522012與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性將CD81-SNPrs2522012等位基因及基因型分布情形及其治療反應狀態總結表列于圖14-1和圖14-2的表10及11中，發現CD81-SNPrs2522012上的T等位基因及TT基因型與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的等位基因。
(8)CD81上的CD81-SNPrs2522013與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性將CD81-SNPrs2522013等位基因及基因型分布情形及其治療反應狀態總結表列于圖15-1和圖15-2的表12及13中，發現CD81-SNPrs2522013上的A等位基因及AA基因型與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的等位基因。
(9)CD81上的CD81-SNPrs800335與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性將CD81-SNPrs800335等位基因及基因型分布情形及其治療反應狀態總結表列于圖16-1和圖16-2的表14及15中，發現CD81-SNPrs800335上的T等位基因及TT基因型與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的等位基因。
(10)CD81基因的連鎖不平衡構造CD81的基因及往3端及5端各延伸30Kb，由選取的16個有意義的單核苷酸多態性群(SNPs)基因型組成連鎖不平衡構造，在近70Kb的去氧核糖核酸染色體片段上，辨識出9個單套型區段(HAP Blocks)，描述于圖17中。
(11)第四單套型區段中的單套型群與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性第四單套型區段中包含兩個單核苷酸多態性群，單套型群的分布及其治療反應狀態總結表列于圖18的表16中，發現單套型GG與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的單套型。
(12)第七單套型區段中的單套型群與C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療反應度的關聯性第七單套型區段中包含的單套型群由五個有意義的單核苷酸多態性群標記組成。單套型群的分布及其治療反應狀態總結表列于圖19的表17中，發現單套型TGGCC與反應狀態有關，是對藥物治療反應有利的單套型。相反地，單套型GATAT被發現與不反應狀態有關，是對藥物治療反應不利的單套型。
以上對于本發明的優選實施例所作的敘述僅為闡明的目的，而無意限定本發明精確地為所揭露的形式，基于以上的教導或從本發明的實施例學習而作修改或變化是可能的，實施例的為解說本發明的原理以及讓熟習本領域的技術人員以各種實施例利用本發明在實際應用上而選擇及敘述，本發明的技術思想企圖應由權利要求的保護范圍來決定。
權利要求
1.一種為檢測個體對甲型干擾素及雷巴威林混合處方的療效反應傾向的方法，其包含分析來自個體存在CD81基因中基因多態性的多核苷酸樣品，該基因多態性與甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療的反應有關聯。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述多態性為一單核苷酸多態性。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述單核苷酸多態性為SNPrs800136。
4.如權利要求2所述的方法，其中所述單核苷酸多態性為SNPrs800137。
5.如權利要求2所述的方法，其中所述單核苷酸多態性為SNPrs800334。
6.如權利要求2所述的方法，其中所述單核苷酸多態性為SNPpos1989603。
7.如權利要求2所述的方法，其中所述單核苷酸多態性為SNPrs2522012。
8.如權利要求2所述的方法，其中所述單核苷酸多態性為SNPrs2522013。
9.如權利要求2所述的方法，其中所述單核苷酸多態性為SNPrs800335。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述分析多核苷酸樣品的步驟以一程序執行，該程序選自一群組，包含偵測特異性的雜交、測量等位基因的大小、限制酶片段的多態性分析、特異等位基因雜交的分析、單核苷酸的引物延伸反應、以及擴增后的多核苷酸定序。
11.一種為檢測個體對甲型干擾素及雷巴威林混合處方的療效反應傾向的方法，其包含在CD81基因上及其兩側區域的單套型的分析。
全文摘要
本發明涉及為檢測個體對甲型干擾素及雷巴威林混合處方的療效反應傾向的方法，從CD81基因及其鄰近區域所單離出的多核苷酸序列，其包含C型肝炎患者對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療的反應傾向相關的基因多態性，因而可用來作為篩檢C型肝炎患者是否會對甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療有反應的探針。本發明還提供在一特定的連鎖不平衡區段中，CD81基因及單套型信息的連鎖不平衡構造，其可被用來預測對C型肝炎患者施予甲型干擾素及雷巴威林混合處方治療的結果。
文檔編號C12Q1/68GK1576373SQ200310115138
公開日2005年2月9日 申請日期2003年11月20日 優先權日2003年7月15日
發明者陳瑞麟, 丁敏珮, 朱文碧, 黃渝棋, 王述經, 陳桂苓, 姚琬琳, 陳廣典, 陳定信, 陳培哲, 賴明陽 申請人:賽亞基因科技股份有限公司