一種人干擾素IFN-γ與LL-37的融合蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域
【背景技術】
[0002] 人Y干擾素屬于II型干擾素，屬于分泌型蛋白，分泌后去除信號膚后其分子由 143個氨基酸組成，相對分子量為40kDa，W同源二聚體或四聚體的形式存在。人Y干擾素 由人T細胞和NK細胞產生，其合成的相關基因位于人的12號染色體上。Y干擾素在臨床 上常用于抗病毒和抗腫瘤。
[0003] Y干擾素可抑制多種病毒的繁殖，從而在病毒感染的治療方面獲得廣泛的應用。 Y干擾素抗病毒活性具有種間選擇性，在異種細胞或機體內，其抗病毒活性會顯著降低。同 時，Y干擾素
[0004]Y干擾素在體內能抑制腫瘤細胞生長，防治腫瘤的轉移和復發。臨床應用表明， Y干擾素對毛細胞白血病、黑色素瘤、皮膚瘤、慢性髓樣白血病、神經膠質瘤、淋己瘤及骨髓 瘤等均具有良好療效。y干擾素既可通過誘導腫瘤細胞調亡和干擾腫瘤細胞的生長周期等 方式直接殺死腫瘤細胞，也可通過抗腫瘤組織的血管生長從而抑制腫瘤細胞生長，還可通 過調節人體免疫系統增強人體自身對腫瘤細胞的清除能力。
[0005] 人化-37全長37個氨基酸，分子內無二硫鍵，其N端絲氨酸被己獻化，但缺少己 獻化對其活性影響不大。由于基因工程菌的重組人化-37無法實現己獻化，為此考慮將人 化-37置于融合蛋白的C端。因此如何設計一個適合連接膚是該分子設計的關鍵。若連接 膚太長，兩個藥物的協同作用可能減弱，若太短，可能影響到干擾素Y與受體的結合，只有 適宜的連接膚不僅將兩個藥物連接成一個大分子，而且不會影響到兩個藥物保持各自的功 能。該融合蛋白采用十幾個氨基酸殘基的連接膚，使得兩個藥物不僅較好地保持各自的功 能，而且具有協同效果。
【發明內容】
[000引 1.人α-37與IFN-YDNA序列的密碼子優化
[0007] 在保證人化-37與IFN-Υ氨基酸序列完整性的前提下，按照Ρ.pastoris對密碼 子的偏好性特點，對他們的DM序列進行優化。
[0008] 2重組人化-37和人干擾素Y基因的連接
[0009]先用引物化sense(5 ' -GACTCGAGTTCGCCTTGTTGGGTGACTTCTTCA-3 ')和化a ntU5 ^-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGACTCGGTTCTTGGAACCAAGTTT-3 ^ ) 擴增α-37 基因，用引物IFNsens巧'-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG CAGGACCCGTACGTTAAAGAA-3 ')和IFNanti巧'-CGTCTAGACTACTGAGATCTTTTACGTTTAC C-3')擴增干擾素Y基因，并分別純化。再W化-37和IFN-Y為模板，用引物化sense和 IFNanti進行重疊PCR，將IFN-Y與化-37基因連接在一起。
[0010] 3重組人化-37和人干擾素Y融合蛋白表達載體構建
[0011] 對IFN-γ與化-37基因連接產物進行甜aI、化οI雙酶切，同時對載體pPICZaA 也進行甜al、化〇1雙酶切，再用瓊脂糖凝膠電提取，然后用T4DM連接酶將雙酶切后的 載體pPICZaA和目的基因IFNY-α-37進行連接，W將IFNY-α-37插入到載體pPICZaA 中。然后轉化感受態E.coliT0P10,涂布含25mg/100ml博來霉素的培養皿來篩選重組質粒 pPICZaA/IFNy-a-37。
[0012] 4重組質粒轉化畢赤酵母
[0013] 用化〇1單酶切pPICZaA-FaU-IFN成線性重組質粒，通過電擊轉化法將其轉入 P.pastorisGS115 中構建重組菌P.pastorisGS115LI。電擊條件為 1500kV，200Q，25uF。 轉化液涂布于MD平板3(TC靜止培養3天，挑選陽性克隆，搖瓶后，用真菌基因組提取試劑盒 提取基因組進行PCR鑒定。引物為化sense和IFNanti，退火溫度為55°C，WGS115基因組 及未加模板的體系為對照組。
[0014] 5重組菌表型鑒定及多拷貝篩選
[0015] 通過甲醇利用情況進行重組菌表型鑒定。將PCR鑒定的陽性轉化子編號，并將每 菌株用滅菌牙簽同時接種MD和MM平板，3(TC靜止培養5天，觀察各菌株在兩種平板上的生 長情況。
[0016] 通過遺傳霉素（G418)濃度梯度篩選多拷貝重組株。首先制備遺傳霉素質量濃度 為0. 25、0. 5、1. 0、2. 0、3.Omg/mL的YPD平板，然后將前面篩選的表型正常的重組菌株用滅 菌牙簽點在5個遺傳霉素梯度平板上，3(TC靜止培養4天，觀察結果，能在高濃度下生長良 好的菌株為多拷貝菌株。
[0017] 6融合蛋白發酵與純化
[0018] 將篩選的重組菌株，接種于25血BMGY培養液中，30°C250巧m/min培養約16h，至 菌液ODe。。W5,4°C4000巧m/min離必5min，收集菌體，用25血BMMY培養液重懸細胞，誘 導培養，每2地按體積比為0.5%加入純甲醇，連續誘導14地^上，41：12000巧111/111111離必 5min，收集上清于-2(TC凍存待用。
[0019] 上清液中的融合蛋白先用85%飽和度（NH4)2S04鹽析，4°C靜止20~24小時， 12000巧m/min離必15分鐘收集鹽析沉淀并溶于適量去離子水，用抑7. 2、10mmol/L磯酸緩 沖液透析除硫酸倭。透析結束后離必除不溶物得到粗融合蛋白溶液。將融合蛋白粗液先在 起始緩沖液中平衡，然后上CM32陽離子交換纖維素柱，從0.Imol/L至0.3mol/LAAB梯度洗 脫，收集含IFN-Y-α-37融合蛋白的洗脫成分。將上柱收集液用抑7. 5、25mmol/L磯酸緩 沖液平衡后上DEAE-52陰離子交換纖維素柱，從含0.Imol/L至0. 3mol/L的化C1的化7. 5、 25mmol/L磯酸緩沖液梯度洗脫，收集含IFN-Y-α-37融合蛋白的洗脫成分。再將上述收集 液經冷凍干燥濃縮至1半體積，上Se地adexG-100凝膠層板柱，用抑7. 5、25mmol/L磯酸緩 沖液洗脫，收集含IFN-Y-α-37融合蛋白的洗脫成分。
[0020] 7IFN-Υ與α-37融合蛋白的檢測
[0021] 7. 1融合蛋白純度檢測
[002引用SDS-PAGE法檢測融合蛋白純度，檢測參照文獻進行。WTakara蛋白分子質量 標準（低）為Marker。W未經誘導的發酵液為空白對照。
[0023] 7. 2融合蛋白濃度檢測
[0024]W牛血清白蛋白為標準，按Low巧法測定融合蛋白濃度。
[0025] 7. 3融合蛋白產物活性分析
[0026] 培養液中IFN-Y的活性分析參照《中國藥典2010版》中《干擾素效價測定（細胞 病變抑制法）》。活性標準品購自廣州市藥品檢測所。W總IFN-Y活性計算純化過程中的 回收率。
[0027] 培養液中化-37的活性測定參照文獻17。用大腸桿菌ATCC25922W及ML35p作 為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法測定。底層培養基上打直徑3mm的圓孔，每孔加10μL發 酵液，