原核表達重組質粒pET-IFNγ、干擾素及用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種干擾素，尤其是由重組質粒pET-IFNy制得的干擾素，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]隨著水產養殖業的發展、高密度養殖技術的普及和養殖產量的迅速增加，水產養殖動物疾病的發生越來越頻繁、越來越嚴重，由此造成的損失逐年增加。每年有1/10的養殖面積受到病害的影響，造成了巨大的經濟損失。尤其是魚類的病毒性疾病，至今都是無法有效控制的世界性難題。病毒性疾病的病原體微小，在宿主細胞內復制，潛伏期長短不一、癥狀復雜多變、傳染性強、死亡率高。迄今已發現的魚類病毒有70多種，流行比較嚴重的如草魚出血病、鯉春病毒血癥、傳染性造血組織壞死病等。
[0003]草魚作為我國最主要的經濟魚類，其產量約占我國淡水魚類養殖產量的20%。在其養殖的過程中受到各種病害的威脅，其中以由草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV)引起的草魚出血病最為嚴重，死亡率高達90%，造成了我國淡水漁業巨大損失。目前，對于魚類傳染性疾病的防治仍然沒有很有效的方案。一方面，魚類病毒病尚無有效的防治藥物，使用的化學藥劑和抗生素往往會導致藥物殘留和耐藥性的產生，甚至污染水環境。預防水產動物疾病發生流行的有效途徑是免疫接種。然而，在病毒疫苗使用過程中，存在很多無法克服的障礙。魚用疫苗可分為三種類型：第一種為減毒及滅活疫苗；第二種為重組亞單位疫苗和合成多肽疫苗；第三種是核酸疫苗。第一、二種疫苗雖然在生產實踐中得到了較大程度的應用，然而在生產成本、效價穩定性、保護力等方面還存在一定的問題。疫苗免疫不適于大面積水面養殖；弱毒疫苗還有毒力返強的潛在危險。近年來，核酸疫苗雖開辟了疫苗學的一個新領域，但是由于免疫效果不穩定，以及免疫機制、安全性問題在理論上還沒有解決，因此大大限制了核酸疫苗的推廣應用。因此，目前預防和治療措施仍然不能經濟而有效地控制我國疫病的發展，迫切需要找到一種有效的防治措施或治療方法。
[0004]干擾素（interferon，IFN)是最先發現的細胞因子，早在1957年，Issacs等發現，流感病毒處理的細胞產生一種因子，可抵抗病毒的感染，干擾病毒的復制，因而命名為干擾素。是一類具有廣泛生物學活性的蛋白質，如抗病毒、抗腫瘤、調節機體免疫反應等，是機體防御系統的重要組成部分。干擾素系統是目前所知的機體防御反應中出現最早的細胞功能調節系統，在病毒感染幾小時之內就起作用，并幾乎作用于病毒復制的每一階段。IFN具有廣泛的抑制病毒增殖的活性，既可抑制多種RNA病毒，又可抑制多種DNA病毒的增殖，但不同病毒對INF的敏感性不同，相對而言，有囊膜的病毒最敏感。干擾素抗病毒作用表現在病毒繁殖量減少以及減輕細胞的損傷。干擾素系統被激活后，使動物在1-3周時間內對其它病毒的重復感染有抵抗。IFN的抗病毒作用可體現在病毒感染的各個階段：（1)感染初期：感染細胞IFN的釋放與新病毒粒子的產生幾乎同時發生，因此在體液免疫和細胞免疫作用之前，IFN反應是限制病毒繁殖和擴散的主要手段。（2)感染擴散期間：血清干擾素在幾分鐘內擴散到身體的各種器官，而細胞接觸干擾素只需幾分鐘就產生抗病毒狀態，并可顯著降低病毒血癥水平。（3)病毒感染靶器官后：在感染恢復機制中，干擾素是促進感染恢復的重要因子。數十年的研究表明，干擾素系統與免疫系統的關系十分密切，在抗病毒免疫中可互相協調、互相作用。
[0005]盡管干擾素具有抗病毒、調節免疫等諸多優點，但是目前對于干擾素的應用主要是在人類疾病上。在水產動物界干擾素的應用不常見，且水產界有關干擾素的應用研究多集中的在I型干擾素，對于II型干擾素抗病毒作用的研究幾乎沒有。
【發明內容】
[0006]本發明要解決上述技術問題，從而提供一種重組質粒pET-IFN y。
[0007]本發明解決上述問題的技術方案如下：
重組質粒pET-IFN y，它是通過以下方法制備的：
(1)、以草魚RNA為模板，用反轉錄試劑盒進行反轉錄和PCR擴增，制得擴增產物；
(2)、擴增產物純化后連接到T載體，制得連接產物；
(3)、連接產物轉化至大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆產物；
(4)、陽性克隆產物進行質粒抽提，用BamHI、Hind III進行雙酶切，酶切產物回收IFN y片段，插入原核表達載體pET-30a的多克隆位點，轉化大腸桿菌DH5a，然后抽提質粒進行酶切，得到重組質粒pET-IFN y ；
所述反轉錄試劑盒的引物如下：
pET-IFN y -U ：CGCGGATCCgattcttggctcaacatgat (酶切位點 BamH I )pET-IFN y -L ：CCCAAGCTTtcattgaacctttttgtg (酶切位點 Hind III)。
[0008]本發明的另一個目的是提供一種干擾素蛋白。
[0009]干擾素蛋白，它是通過以下方法制備的：
誘導表達：上述重組質粒PET-IFNY轉化大腸桿菌，涂布于含抗生素的平板上，培養至平板上出現單克隆菌落，挑取單克隆菌落接種于含抗生素的培養基，培養；得到含有pET-IFNy質粒的大腸桿菌菌種；
重組干擾素蛋白的純化：將含有pET-IFNy質粒的大腸桿菌菌種接種于含抗生素的培養基，培養，加入IPTG，誘導表達；離心收集菌體，洗滌后，重懸菌體，并加入溶菌酶，超聲至液體清亮，離心，分離沉淀和上清，溶解沉淀，然后經Ni-NTA親和層析獲得純化的融合蛋白。
[0010]本發明的再一個目的是提供上述干擾素蛋白的用途。
[0011]干擾素蛋白的用途，上述干擾素蛋白在鯉科魚類的免疫保護方面的應用。
[0012]本發明的最后一個目的是提供一種降低鯉科魚類死亡率的方法。
[0013]降低鯉科魚類死亡率的方法，將上述純化的融合蛋白注射于鯉科魚類腹腔。
[0014]作為上述技術方案的優選，純化的融合蛋白注射量為0. 5?10Pg/g魚體重。
[0015]作為上述技術方案的優選，純化的融合蛋白注射量為0. 5?5Pg/g魚體重。
[0016]作為上述技術方案的優選，純化的融合蛋白注射量為1?3Pg/g魚體重。
[0017]本發明具有以下有益效果：
1、本發明提供了一種草魚干擾素原核表達質粒，還提供了一種干擾素蛋白；
2、本發明還通過試驗驗證了該干擾素蛋白的有效性：為確定IFNy重組蛋白在草魚體內誘導ISG表達的效果，本技術用2l^g/g魚體重的IFNy重組蛋白腹腔注射免疫草魚，并通過實時熒光定量PCR方法檢測草魚肝、脾、腎、腸等4種組織中的ISG，包括IFN、IRF1、IRF7、PKR、STAT3、Mx等基因的轉錄水平的變化情況；經重組干擾素刺激后，與對照組相比較，這些ISG基因在4種組織中均被強烈誘導表達，其中大多數ISG基因在24 h達到最高水平，在72h內回落到正常水平。這從另一個方面證實IFNy重組蛋白的抗病毒效果。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發明的重組質粒pET-IFNy構建圖（A)及酶切鑒定圖（B);
圖2是本發明的重組質粒pET-IFNy誘導表達電泳圖；
圖3是本發明草魚干擾素重組蛋白純化效果圖；
圖4是本發明IFNy重組蛋白對CO細胞的抗病毒活性效果圖；
圖5是本發明經不同劑量IFNy蛋白免疫草魚抗GCRV的累計死亡率分析圖；
圖6是本發明腹腔注射IFNy重組蛋白對草魚IFN刺激基因表達情況的影響圖（肝臟和脾臟）;
圖7是本發明腹腔注射IFNy重組蛋白對草魚IFN刺激基因表達情況的影響圖（腎臟和腸)。
【具體實施方式】
[0019]以下結合附圖對本發明進行進一步的解釋說明。
[0020]本【具體實施方式】僅僅是對本發明的解釋，并不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀了本發明的說明書之后所做的修改，只要在權利要求的范圍內，都將受到法律的保護。
[0021]一、草魚II型干擾素IFNy基因克隆健康草魚以5ML/g魚體重的Poly I:C (lmg/mL)腹腔注射草魚，誘導3 d后取脾臟組織lOOmg，提取脾臟組織的總RNA，用TRizol (Takara，大連）提取總RNA，實驗操作依據說明書進行。提取的RNA用Nanodrop 2000 (Thermo，USA)測定濃度及純度，用反轉錄試劑盒SMART? MMLV Reverse Transcriptase (TAKARA，大連）進行反轉錄和 PCR 擴增，引物如下：pET-IFN y -U ：CGCGGATCCgattcttggctcaacatgat (酶切位點 BamH I )pET-IFN y -L ：CCCAAGCTTtcattgaacctttttgtg (酶切位點 Hind III)
擴增產物采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (愛思進，USA)進行純化，然后再連接到T載體（Takara，大連)，具體操作步驟均按照說明書所示。連接產物轉化至大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆進行測序鑒定，轉化和鑒定方法參照《分子克隆實驗指南》進行。
[0022]二、草魚干擾素原核表達載體的構建上述陽性克隆采用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (愛思進，USA)試劑盒進行質粒抽提，然后用BamH I、Hind III (Takara，大連）進行雙酶切，酶切產物用AxyPrep DNA GelExtraction Kit (愛思進，USA)回收IFN y片段，插入原核表達載體pET_30a的多克隆位點，轉化大腸桿菌DH5a，然后抽提質粒進行酶切和測序鑒定，重組質粒構建圖及酶切鑒定圖如圖1所