表達山羊α干擾素的重組畢赤酵母及其構建方法和應用

表達山羊α干擾素的重組畢赤酵母及其構建方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一株表達山羊α干擾素的重組畢赤酵母及其構建方法和應用。本發明首先公開了根據畢赤酵母的密碼子偏嗜性進行優化的山羊α干擾素基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。本發明進一步公開了一株表達優化的山羊α干擾素基因的重組畢赤酵母，其微生物保藏編號為：CGMCC No.9088。本發明所構建的重組畢赤酵母能夠穩定的表達山羊α干擾素，不僅表達量大，而且抗病毒活性高。本發明重組畢赤酵母表達的山羊α干擾素在牛源細胞和羊源細胞上均具有高度抗病毒活性，能夠作為抗病毒感染的藥物或疫苗佐劑使用，用于預防或治療牛和羊等反芻動物病毒性傳染病。CGMCC No.908820140424
【專利說明】
表達山羊α干擾素的重組畢赤酵母及其構建方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及優化的山羊α干擾素基因，本發明還涉及一株穩定高效表達山羊α干擾 素的重組畢赤酵母及其構建方法，本發明進一步涉及該優化的山羊α干擾素基因以及重組 畢赤酵母在制備預防或治療牛羊等反芻動物病毒性傳染病藥物中的應用，屬于表達山羊α 干擾素的重組畢赤酵母的構建及應用領域。
【背景技術】
[0002] 由病毒引起的動物傳染性疾病嚴重制約了各個國家和地區養殖業的健康發展，同 時也對人類健康構成嚴重的威脅。中國羊產業規模巨大，是畜牧業的支柱性產業。對養羊業 的最大威脅是病毒性傳染病，例如羊痘、藍舌病和羊傳染性膿皰等。小反芻獸疫是養羊業的 頭號威脅，2007年從西藏阿里地區傳入中國內地，雖然及時控制沒有蔓延，然而2014年初該 病從新疆傳入中國內地，先后擴散到甘肅、寧夏、內蒙西部，進入4月已傳入遼寧、湖南、江 蘇、安徽等許多省區，給中國羊產業造成巨大的經濟損失。烈性病毒病的緊急應對策略是使 用α干擾素，因此干擾素對于急性烈性動物病毒性傳染病的防治具有極其重要的經濟價值。
[0003] 干擾素（Interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強免疫功能的細胞 因子，主要是由動物細胞在病毒等誘生劑的作用下誘導產生的。許多動物，包括人、哺乳動 物、鳥類等細胞均能產生干擾素。目前已知的干擾素分為三大類：1型、II型和III型。I型干 擾素主要包括人體內發現的α、β、ω、ε和κ干擾素，以及在反芻動物中發現的τ以及小鼠中發 現的ζ等幾個亞類，其中IFN-α至少有17個亞群。Π 型干擾素只有一種γ干擾素。最近發現的 λ干擾素（IFN-λ)被認為是新的一類干擾素，國際最新分類標準里將它命名為m型干擾素， 共有3個亞群，分別為IFN-λΙ、IFN-X2和IFN-X3。I型干擾素是天然免疫的關鍵成員，是組成 抗病毒感染的第一道防線。其中α干擾素在機體內發揮廣譜、高效抗病毒作用的機制是抑制 病毒蛋白質的合成，并能選擇性地作用于受感染細胞，而對正常宿主細胞無作用或作用輕 微。
[0004] 巴斯德畢赤酵母表達系統是一種真核表達系統，具有發酵工藝成熟、易于擴大工 業化、培養成本低廉、又具有真核表達系統可進行蛋白翻譯后修飾、加工和折疊等優點，因 此畢赤酵母系統是表達功能蛋白的一種理想的選擇。由于該表達系統的諸多優點，人們越 來越多地利用它作為外源基因的表達系統來生產目的蛋白。自1987年Gregg等首次在畢赤 酵母中表達乙型肝炎表面抗原(HbsAg)以來，國內外利用畢赤酵母已成功地表達了多種有 價值的藥用或疫苗用蛋白，顯示其在基因工程疫苗開發中的潛力。
[0005] 因此，利用畢赤酵母系統高效的表達具有高度抗病毒活性的山羊α干擾素，對于有 效地預防和治療牛羊等反芻動物病毒性傳染病，將具有廣泛的應用價值。

【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的第一個技術問題是提供優化的山羊α干擾素基因；
[0007] 本發明所要解決的第二個技術問題是提供表達所述優化的山羊α干擾素基因的重 組畢赤酵母；
[0008] 本發明所要解決的第三個技術問題是將所述優化的山羊α干擾素基因及表達該優 化的山羊α干擾素的重組畢赤酵母應用于制備預防或治療反芻動物病毒性傳染病的藥物或 疫苗佐劑。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：
[0010]本發明首先公開了優化的山羊α干擾素基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。 本發明參考GenBank發表的山羊α干擾素(GoIFN-α)基因序列(FJ959074)，根據畢赤酵母密 碼子偏嗜性進行密碼子優化得到了多條優化的山羊α干擾素基因；其中，SEQ ID NO. 1所示 的核苷酸序列在畢赤酵母中的表達效率以及穩定性遠遠優于其它優化的山羊α干擾素基 因。
[0011]本發明進一步公開了含有所述優化的山羊α干擾素基因的重組表達載體及含有該 重組表達載體的宿主細胞。將優化的山羊α干擾素基因與表達載體進行可操作的連接，即得 到表達山羊α干擾素的重組表達載體。可以采用任何轉化方法將本發明所構建的重組表達 載體導入到目標細胞中，得到轉化體;所述的轉化方法包括:電轉化法、脂質體法、顯微注射 法、磷酸鈣共沉淀法等;所述的目標細胞包括原核細胞或真核細胞，例如包括但不限于:大 腸桿菌細胞或畢赤酵母細胞等。
[0012]本發明進一步公開了表達所述優化的山羊α干擾素基因的重組畢赤酵母。
[0013]本發明將密碼子優化的山羊α干擾素成熟蛋白編碼基因插入PPIC9K載體的EcoR I 和Not I位點間，獲得重組載體pPIC9K-G〇IFN-a，然后轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，獲得 了43個重組酵母菌陽性克隆。Dot-ELISA鑒定結果顯示，陽性克隆7-18、19、20、24-28、33、 35、36、38、40、42、43經誘導后均能夠分泌表達6〇正^€[蛋白，而其他克隆不能分泌表達 GoIFN-a蛋白。本發明進一步將上述能夠分泌表達GoIFN-a蛋白的陽性克隆在相同條件下進 行誘導，Dot-ELISA鑒定表明，陽性克隆18#表達GoIFN-a蛋白的量最大，上清中表達的重組 蛋白濃度約為61yg/mL，而其余陽性克隆的表達量均低于50yg/mL。因此，本發明選擇陽性克 隆18#進行后續鑒定和優化。將克隆18#分泌表達的可溶性GoIFN-a蛋白經鎳柱純化后獲得 純化的重組蛋白，測定蛋白濃度為0.2mg/mL。
[0014] 本發明將表達量最高的陽性克隆18#進行連續傳代，不同代次的重組菌誘導表達 后取上清進行Western blot分析，結果表明從F2代到F10代重組菌表達的GoIFN-a蛋白表 達量沒有明顯差異，證明本發明篩選的重組畢赤酵母菌能夠穩定攜帶GoIFN-a基因，并且穩 定地表達。
[0015] 本發明將穩定高效表達所述優化的山羊α干擾素基因的重組畢赤酵母陽性克隆 18#(即rGS115/GoIFN-a)提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No .9088;分類命名為：巴斯德畢赤酵母Pichia pastor is。保藏單位：中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心;保藏時間是2014年04月24日；保藏地址:北京市朝陽區北辰西 路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0016] 本發明進一步公開了所述優化的山羊α干擾素基因及所構建的重組畢赤酵母在制 備預防或治療反芻動物病毒性傳染病的藥物或疫苗佐劑中的應用。將本發明所述優化的山 羊α干擾素基因與表達載體進行可操作的連接并導入宿主細胞，表達重組的山羊α干擾素； 或者，培養本發明所構建的重組畢赤酵母 rGS115/G〇IFN-a，誘導表達重組山羊α干擾素。該 重組的山羊α干擾素具有高度抗病毒活性，可以用于制備預防或治療牛羊等反芻動物的病 毒性傳染病藥物或疫苗佐劑。本發明所述的反芻動物病毒性傳染病包括但不限于:羊痘、藍 舌病或羊傳染性膿皰中的任意一種或多種。
[0017] 本發明采用目前國際公認的細胞病變抑制法測定畢赤酵母表達的山羊干擾素 GoIFN-α的抗病毒活性，結果表明，畢赤酵母表達上清中的GoIFN-α和純化的GoIFN-α均表現 出較高的抗病毒活性，能有效地抑制VSV在細胞上產生CPE，而且在不同的細胞上表現出的 活性不同。將抑制50%細胞病變(CPE)的干擾素的最高稀釋度確定為1個干擾素單位，結果 表明，上清中GoIFN-a的抗病毒活性為1.78~3.16 X 107U/mL，而純化的GoIFN-a抗病毒活性 為3.16~5.62X 109U/mg。本發明還對山羊a干擾素抗口蹄疫病毒(FMDV)、牛腸道病毒(BEV) 和山羊痘病毒(GPV)活性進行了測定，結果表明，上清中GoIFN-a的抗病毒活性為3.16~ 5.62 X 107U/mL，而純化GoIFN-a的抗病毒活性為5.62 X 109U/mg。不同劑量干擾素的抗病毒 實驗結果表明，無論何種病毒和細胞，干擾素 GoIFN-a的抗病毒活性均呈現劑量依賴性:干 擾素的含量越高，抗病毒活性越強，反之則越弱，這與已報道的其他干擾素的特性相一致。
[0018] a干擾素具有抑制細胞增殖的活性，但是對不同的細胞抑制效果不同。本發明使用 原代胎羊皮膚細胞、MDBK和IBRS2細胞測定表達的GoIFN-a蛋白對細胞增殖的抑制活性，結 果表明，在干擾素 GoIFN-a作用下，三種細胞的增殖程度沒有顯著差異;不管細胞種類的不 同，山羊a干擾素對細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，隨著干擾素稀釋倍數增加，對細胞 的抑制作用減弱，這與報道的其他干擾素特性相一致。
[0019] 重組山羊a干擾素的臨床應用結果表明，本發明畢赤酵母表達的山羊a干擾素對牛 羊的重要傳染病口蹄疫，羊的重要傳染病羊痘等均具有顯著的預防和治療效果。
[0020] 本發明還公開了一種構建所述重組畢赤酵母的方法，包括以下步驟：（1)將SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列克隆至pPIC9K載體，獲得重組質粒pPIC9K-GoIFN-a;(2)將重組質粒 pPIC9K-GoIFN_a線性化，轉化畢赤酵母感受態細胞，篩選鑒定，即得。
[0021] 其中，步驟(1)克隆時刪除了優化的山羊a干擾素(GoIFN-a)基因的信號肽序列（1-69bp);另外，為了便于后期蛋白純化，本發明在GoIFN-a基因3 '末端加入6 X His標簽;將優 化的山羊a干擾素基因用EcoR I和Not I雙酶切，插入pPIC9K載體的EcoR I和Not I位點間， 獲得重組質粒pPIC9K-GoIFN_a;步驟(2)用限制性內切酶Sal I對重組質粒pPIC9K-GoIFN_a 進行線性化。
[0022] 本發明進一步公開了一種誘導所述重組畢赤酵母表達山羊a干擾素的方法，包括 以下步驟：（1)培養所述重組畢赤酵母，誘導山羊a干擾素表達；（2)純化所表達的山羊a干擾 素，即得。其中，步驟（1)所述誘導的條件包括:誘導溫度為22°C-30°C，誘導時間為6h-48h， 菌密度〇D_ nm值為0.2-1.0，甲醇濃度為0.2%-1 % (v/v);優選的，步驟(1)所述誘導的條件 包括:誘導溫度為22°C，誘導時間為24h，菌密度0D6Q() nm值為0.2-1.0，甲醇濃度為0.2%-1 % (v/v) 〇
[0023] 本發明對誘導重組畢赤酵母表達山羊a干擾素的誘導條件，包括溫度、時間、菌密 度和甲醇濃度進行優化。不同誘導時間的誘導表達結果表明，誘導后6h即可見GoIFN-a表 達，到24h后表達量達到最高峰，并且持續到48h。不同誘導溫度進行誘導表達的結果表明， 在22°C條件下Go IFN-a表達量相對較高，24 °C-30°C條件下蛋白表達量差異不大。不同菌密 度轉接后可見，〇D6Q()nm值0.2-1.0均可誘導GoIFN-a表達，并且表達量差異不大，說明不同菌 密度對GoIFN-α表達量的影響不大。不同甲醇濃度誘導的結果表明，甲醇濃度對GoIFN-α表 達量的影響不大，〇.2%_1%均可為適合濃度。綜上，本發明確定重組畢赤酵母表達山羊α干 擾素的最佳誘導條件為22°C誘導24h，菌密度和甲醇濃度對表達量影響不大。最佳誘導條件 下，重組畢赤酵母rGS 115/Go IFN-α上清中表達的重組Go IFN-α濃度約為0. lmg/mL。
[0024] 本發明技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：
[0025] 本發明利用畢赤酵母系統表達山羊a干擾素，屬于中國首次報道。畢赤酵母表達系 統表達山羊a干擾素，具有表達量高、安全性好、成本低等優點。本發明構建的重組畢赤酵母 表達山羊a干擾素，不僅表達量大，而且比活性高，搖瓶培養條件下表達量約為l〇〇 mg/L，上 清中分泌的重組GoIFN-a抗病毒活性3.16 X 107U/mL，而純化的GoIFN-a抗病毒活性為5.62 X109U/mg，對牛和羊的病毒性傳染病具有明顯的預防和治療作用，可作為抗病毒感染藥物 和疫苗佐劑使用，具有廣泛的應用價值。
[0026] 本發明所涉及到的術語定義
[0027] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域 的普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0028] 術語"核苷酸"或"多核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核 苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸 的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生的 核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括 PNA(肽核酸）、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指 定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取 代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選(或 所有）密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡并密碼子取代 (Batzer等人，Nucleic Acid Res · 19:5081 (1991) ;0htsuka等人，J.Biol ·Chem. 260: 2605-2608( 1985);和Cassol等人，（1992) ;Rossolini等人，Mol Cell .Probes 8:91-98(1994))。
[0029] 術語"宿主細胞"或"重組宿主細胞"意指包含本發明多核苷酸的細胞，而不管使用 何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的 其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。 宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。
[0030] 術語"表達"意指內源性基因或轉基因在細胞中的轉錄和/或翻譯。
[0031] 可互換使用的術語"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動物中 誘導免疫應答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護動物免受由于感染 的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強活性組分的免疫活性的一種或多種另外 組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對于疫苗或疫苗組合物典型的進一步組分，包括例 如佐劑或免疫調節劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經修飾的活疫苗中作為經減毒的生物體，或在經殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領域技術人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時超 過一種上述組分。
[0032] 術語"佐劑"意指包括一種或多種物質的組合物，所述物質增強疫苗組合物的抗原 性。佐劑可以充當緩慢釋放抗原的組織儲存，并且還充當非特異性增強免疫應答的淋巴樣 系統激活。通常，在不存在佐劑的情況下，用單獨抗原的初次疫苗接種將無法引發體液或細 胞免疫應答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、礦物質凝膠例如氫氧化 鋁、表面活性物質。
【附圖說明】
[0033] 圖 1 為重組質粒酶切鑒定；其中，M:DL 10000DNA Ladder;Lane l-2:pPIC9K-GoIFN-a2個克隆EcoR I和Not 頂每切;Lane 3;pPIC9K EcoR I和Not 頂每切；
[0034] 圖2為重組酵母菌的Dot-ELI SA鑒定;其中，1-18、19-28、29-43分別為三個批次不 同克隆的編號，9k為空載體轉化后作為陰性對照；
[0035] 圖3為重組酵母菌SDS-PAGE及Western blot分析；其中，（A)重組酵母菌的SDS-PAGE電泳；（B)重組酵母菌Western b 1 〇t分析；（C)純化GoIFN-α蛋白的SDS-PAGE電泳;Μ:蛋 白Marker;Lane 1:重組酵母菌誘導前上清;Lane 2:重組酵母菌誘導后上清;Lane 3:純化 的GoIFN-a。
[0036] 圖4為Western blot分析重組酵母菌遺傳穩定性；其中，Μ:蛋白Marker;Lane 1:重 組酵母菌18#誘導前上清;F2、F4、F6、F8和F10:不同代次的重組酵母菌的誘導后上清；
[0037]圖5為不同劑量純化Go IFN-α的抗病毒活性；
[0038]圖6為純化GoIFN-a抑制細胞增殖的活性；
[0039]圖7為重組酵母菌誘導條件優化的Western blot分析；其中，（A)不同誘導時間； (B)不同誘導溫度；（C)不同菌密度(0D6Q());(D)不同甲醇濃度（％)。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領域 技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和 形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0041] 實施例1表達山羊a干擾素的重組畢赤酵母的構建及鑒定
[0042] 1、實驗方法
[0043] 1.1實驗材料
[0044] 1.1.1載體、菌株、細胞和病毒
[0045] 畢赤酵母GS115菌株、表達載體pPIC9K及抗生素 G418購自Invitrogen公司；YPD、 BMGY、BMMY等培養基均按照Invitrogen公司畢赤酵母表達說明書配制；山羊干擾素單克隆 抗體由本發明人實驗室制備。山羊痘疫苗株(GPV AV41)購自中國獸醫藥品監察所；口蹄疫 病毒(FMDV)為本發明人實驗室用反向遺傳技術拯救的病毒（中國發明專利申請公布號CN 101724636 A);牛腸道病毒(BEV)(中國發明專利申請公布號CN 102776155 A)為本發明人 實驗室分離并保存。抗山羊干擾素鼠陽性血清由本發明人實驗室制備及保存。原代胎羊皮 膚細胞由本發明人實驗室制備;MDBK和IBRS2細胞為本發明人實驗室保存。
[0046] 1.1.2主要試劑
[0047] 限制性內切酶Sal I、EcoR I、Not I、PRMSTAR DNA Polymerase，DNA Marker， T4DNA連接酶、大腸桿菌DH5a感受態細胞均購自大連寶生物工程有限公司，小量質量提取試 劑盒、核酸凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。
[0048] 1.1.3儀器設備
[0049] 各種規格移液器及5415R、5810R高速臺式低溫離心機(德國Eppendorf公司）;MC〇- 15AC二氧化碳培養箱、MDF-U32V超低溫冰箱（日本SANYO公司）；1X51倒置顯微鏡(OLYMPUS公 司）；生物二級安全柜(美國LABC0NC0公司）；DK-8D電熱恒溫水槽(上海精宏）；空氣浴恒溫搖 床(KYC100B，上海福瑪實驗設備有限公司）；旋渦混合器(QL-901，江蘇海門麒麟醫用儀器 廠）；GIS-2020全自動凝膠成像系統（上海天能）；YDS60/210液氮罐(新鄉豫新航空低溫容 器）;ASTACUS小型超純水儀(德國MEMBRAPURE公司）。
[0050] 1.1.4主要溶液的配制
[0051 ] 10 X YNB:將134g YNB加入至lj 1 OOOmL水中，使其完全融解，過濾除菌，4°C保存。
[0052] 500XB:將20mg biotin加入至100mL水中，使其完全融解，過濾除菌，4°C保存。
[0053] 10XD:將200g D-葡萄糖加入到1000mL水中，使其完全融解，過濾除菌，或者高壓 滅菌。
[0054] 10 XM:將5mL甲醇和95mL水混合均勻，過濾除菌，4°C保存。
[0055] 10XGY:將100mL甘油和900mL水混合均勻，過濾除菌，或者高壓滅菌，室溫保存。
[0056] 1M potassium phosphate buffer(pH 6 · 0):將 132mL 1M K2HPO4和868mL 1M KH2P〇4混合均勻，調整pH=6.0 ±0.1 (用Κ0Η或者H3P〇4)，室溫保存。
[0057] YPD(IL):將10g酵母提取物和20g酵母用蛋白胨加入到900mL水中，若是配制YPD平 板，則需要加入20g瓊脂，高壓滅菌，加入100mL 10XD，4°C保存。
[0058] MGY(IL):將800mL滅菌水和 100mL 10XYNB、2mL 500XB、100mL 10XGY混合均勻， 4°C保存。
[0059] BMGY(IL):將10g酵母提取物和20g酵母用蛋白胨加入到700mL水中，高壓滅菌，7令 卻至室溫，加入 100mL 1M PPB(pH 6.0)、100mL 10XYNB、2mL 500XB、100mL 10XGY混合均 勻，4°C保存。
[0060] BMMY(IL):將lOg酵母提取物和20g酵母用蛋白胨加入到700mL水中，高壓滅菌，7令 卻，4°C保存。
[0061 ] 1.2實驗方法
[0062] 1.2.1羊α干擾素基因密碼子的優化
[0063] 參考GenBank發表的山羊α干擾素(GoIFN-α)基因序列（FJ959074)，根據畢赤酵母 密碼子偏嗜性進行密碼子優化并人工合成該優化的基因，克隆時刪除了信號肽序列（1-69bp)。核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0064] 1.2.2表達載體的構建
[0065] 將pPIC9K載體與合成基因 GoIFN-a分別用EcoR I和Not I雙酶切、膠回收，凝膠回 收操作按試劑盒說明書進行。將載體與外源片段以摩爾比1:3的比例混合，用T4DNA連接酶 于16°C連接2-3h，然后轉化E.coli DH5a感受態細胞，提取質粒，經EcoR I和Not I雙酶切及 PCR鑒定，測序驗證后，獲得陽性重組質粒pPIC9K-GoIFN-a。
[0066] 1.2.3酵母細胞的電轉化
[0067]用限制性內切酶Sal I對制備的重組表達質粒進行線性化，酚-氯仿-異戊醇抽提， 乙醇沉淀回收后，與畢赤酵母GS115感受態細胞混合，用BI〇-RAD(Serial NO.411BR 3336) 電轉儀進行電轉化(2.01^、25以？、20(^)，然后立即加入1此預冷的1111〇1/1山梨醇，溫浴后將 內容物分別涂布于含 〇.2511^/1]1]^、0.5〇11^/1]1]^、0.7511^/1]1]^、111^/1111^418抗性的￥]：)0平板，30°〇 培養3-7d。
[0068] 1.2.4重組酵母菌的誘導表達
[0069] 挑取單克隆重組酵母菌落接種于5mL BMGY培養基中，30°C250rpm培養至0D6QQ為2- 6時，取lmL菌液經2500rpm離心5min收集菌體，轉接至5mL BMMY培養基繼續培養3d，每隔24h 取樣并同時加入0.5%的甲醇。
[0070] 1.2.5重組蛋白的0〇七41^3厶檢測
[0071]取誘導后的酵母培養液上清1〇μ1，滴在NC膜上，待膜干燥后，用5%脫脂乳室溫封 閉lh，加入GoIFN-α單克隆抗體（1:2500 X )，室溫孵育lh，PBST洗3次，5min/次，加入的HRP標 記的兔抗鼠186(1:5000\)，室溫孵育111，？851'洗3次，51^11/次，最后用二氨基聯苯胺(0八8) 顯色。
[0072] 1 ·2·6重組蛋白的Western blot鑒定
[0073] 挑選Dot-ELISA初篩的陽性克隆進行Western blot鑒定。取酵母表達上清進行 SD S-PAGE后，轉至硝酸纖維素膜(NC)上，用5 %脫脂乳封閉，加入Go I FN-a單克隆抗體（1: 2500 X )，于37°C孵育lh，PBS洗3次，5min/次，加入的HRP標記的兔抗鼠 IgG( 1:5000 X )，室溫 孵育lh，PBS洗3次，5min/次，最后用二氨基聯苯胺(DAB)顯色。
[0074] 1.2.7重組蛋白的純化及濃度測定
[0075]為了便于后期蛋白純化，本發明設計在GoIFN-a基因3'末端加入6XHis標簽。將誘 導后的培養上清4°C12000rpm離心30min，進行鎳柱純化(Ni-NTA agarose，Qiagen)，具體步 驟參見Qiagen Ni-NTA操作手冊。將純化后的GoIFN-α進行Western blot鑒定。為了準確測 定蛋白濃度，采用天根BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白含量，同時將SDS-PAGE進行紅外掃 描，用AlphaView SA軟件(Cell Biosciences，Inc.)分析目標蛋白濃度。
[0076] 1.2.8重組畢赤酵母的遺傳穩定性
[0077]挑取表達量高的陽性克隆，進行連續傳代。將單菌落接種YPD，30 °C 250rpm搖菌，待 0D6QQnm= 1-2時，再次轉接YPD進行下一代次搖菌，連續傳10代。每代收取上清進行蛋白表達 量鑒定。
[0078] 1.2.9重組山羊α干擾素的抗病毒活性
[0079]誘導后的酵母上清與純化的rGoIFN-α蛋白均具有抗病毒活性。分別用原代胎羊皮 膚細胞、IBRS2和MDBK細胞進行測定，采用水泡性口炎病毒(VSV)微量細胞病變抑制法，具體 方法如下：
[0080]在96孔板按常規方法培養細胞，待細胞長成單層后，去除生長液，用維持液清洗兩 遍。每孔加入連續10倍稀釋的酵母上清和純化rGoIFN-aO.lmL，每個稀釋度接4孔，37°C孵育 過夜。去除干擾素稀釋液，用維持液清洗兩遍后，加入0. lmL lOOTCIDsoVSV病毒進行攻毒。設 只用GoIFN-a處理不攻毒的對照組、正常細胞對照組和攻毒對照組，每個稀釋度接4管。37°C 培養24h后，在倒置顯微鏡下觀察結果。另外，酵母上清和純化rGoIFN-a抗其他病毒(GPV、 BEV、FMDV)活性進行測定，接毒劑量為1000TCID5Q的GPV、BEV和FMDV，方法同上。結果判定:將 抑制50%細胞病變的干擾素的最高稀釋度定為1個干擾素單位。由于羊源干擾素沒有國家 標準品，只能根據l〇〇TCID5QVSV接毒條件下測得的干擾素效價。待對照孔細胞全部發生明顯 的細胞病變時，傾去維持液，用PBS洗滌，5 %甲醛固定IOmin，加入結晶紫染色液染色30min， PBS洗滌后，加入lOOul甲醇洗脫，OD595nm讀值。
[0081 ]原代胎羊皮膚細胞制備方法：去流產母羊的胎兒，取皮膚組織，在無菌狀態下用 PBS洗3遍，剪碎，胰酶消化后，吹打成單個細胞接到細胞瓶中培養，待細胞長成后傳到96孔 板，進行干擾素活性測定。
[0082] 1.2.10重組羊α干擾素抑制細胞增殖活性
[0083]在96孔板按常規方法培養原代胎羊皮膚細胞、MDBK和IBRS2細胞，待細胞長成單層 后，去除生長液，用維持液清洗兩遍。每孔加入連續10倍稀釋的酵母上清中rGoIFN-α和純化 rGo IFN-a〇. 1 mL，每個稀釋度接4孔。37 °C孵育72h后，每孔加入10μ1 CCK-8試劑，37 °C孵育 lh后測定0D45twf直。
[0084] 2、實驗結果
[0085] 2.1重組質粒的鑒定
[0086]將密碼子優化并人工合成的山羊a干擾素成熟蛋白編碼基因，用EcoR I和Not I雙 酶切，插入PPIC9K載體的EcoR I和Not I位點間，獲得重組載體pPIC9K-GoIFN-a，酶切鑒定 可見9kb和0.5kb的片段(圖1)，與預期相符。
[0087] 2.2重組6〇正~-€[的表達及鑒定
[0088]挑取G418抗性平板上的單菌落，進行誘導表達，72h后收獲上清，進行Dot-ELISA初 步鑒定。共做了三批，第一批挑菌標號為1-18,第二批挑菌標號19-28,第三批挑菌標號為 29-43。0(^1^15厶結果顯示（圖 2)，標號 7-18、19、20、24-28、33、35、36、38、40、42、43 的克隆 誘導72h后均能夠與GoIFN-a單克隆抗體發生特異性反應，而其他克隆以及轉化空載體9k的 畢赤酵母菌株沒有反應，表明這些克隆均能分泌表達GoIFN-a蛋白。將這些陽性克隆在相同 條件下進行誘導，Dot-ELISA鑒定，克隆18#的表達量為61yg/mL，其余克隆的表達量均低于 50yg/mL，因此選擇克隆18#進行后續鑒定和優化。
[0089] SDS-PAGE(圖3A)和Western blot鑒定（圖3B)，結果可見，在17kDa附近有2條特異 性條帶，推測較小的條帶為降解的GoIFN-α蛋白。對SDS-PAGE膠進行紅外掃描，軟件分析， 18#上清中表達的重組蛋白濃度約為61yg/mL。由于分泌表達的可溶性GoIFN-a蛋白帶6個組 氨酸標簽，經鎳柱純化后獲得純化的重組蛋白（圖3C)，測定蛋白濃度為0.2mg/mL。
[0090] 2.3重組酵母菌的遺傳穩定性
[0091]將表達量較高的陽性克隆18#進行連續傳代，不同代次的重組菌誘導表達后取上 清進行Western blot分析（圖4)，結果表明，從F2代到F10代重組菌表達的GoIFN-a蛋白表達 量沒有明顯差異，證明本發明克隆篩選的重組畢赤酵母菌能夠穩定攜帶GoIFN-a基因、并且 穩定地表達。
[0092] 本發明將穩定高效的表達山羊干擾素 GoIFN-a蛋白的重組畢赤酵母陽性克隆18# 命名為rGS115/GoIFN-a，并提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保 藏，其微生物保藏編號為:CGMCC No.9088。
[0093] 2.4重組GoIFN-a的抗病毒活性
[0094] 采用目前國際公認的細胞病變抑制法測定畢赤酵母陽性克隆18#表達的山羊干擾 素 GoIFN-a的抗病毒活性，分別在原代羊皮膚細胞、MDBK和IBRS2細胞上測定GoIFN-a的抵抗 水泡性口炎病毒(VSV)的活性。連續三次的檢測結果表明，畢赤酵母表達上清中的GoIFN-α 和純化的GoIFN-α均表現出較高的抗病毒活性，能有效地抑制VSV在細胞上產生CPE，而且在 不同的細胞上表現出的活性不同。正常細胞對照組、單用GoIFN-a蛋白不攻毒對照組的細胞 均無 CPE，而病毒對照組的細胞均出現CPE。將抑制50%細胞病變(CPE)的干擾素的最高稀釋 度確定為1個干擾素單位，結果見表1。上清中GoIFN-a的抗病毒活性為1.78~3.16 X 107U/ mL，而純化的GoIFN-a抗病毒活性為3.16~5.62 X 109U/mg。除此之外，對山羊a干擾素抗口 蹄疫病毒(FMDV)、牛腸道病毒(BEV)和山羊痘病毒(GPV)活性也進行了測定，結果如圖5和表 1所示，上清中GoIFN-a的抗病毒活性為3.16~5.62 X 107U/mL，而純化GoIFN-a的抗病毒活 性為5.62X 109U/mg。不同劑量干擾素的抗病毒實驗結果見圖5,無論何種病毒和細胞，干擾 素 GoIFN-a的抗病毒活性均呈現劑量依賴性:干擾素的含量越高，抗病毒活性越強，反之則 越弱，這與已報道的其他干擾素的特性相一致。
[0095] 表1重組GoIFN-a抗不同病毒活性的測定
[0096]
[0097] 注:a)上清中GoIFN-a的活性單位為U/mL;
[0098] b)純化的GoIFN-a的活性單位為U/mg。
[0099] 2.5重組GoIFN-a的抑制細胞活性
[0100] a干擾素具有抑制細胞增殖的活性，但是對不同的細胞抑制效果不同。本發明使用 原代胎羊皮膚細胞、MDBK和IBRS2細胞測定表達的GoIFN-a蛋白對細胞增殖的抑制活性，結 果見圖6。在干擾素 GoIFN-a作用下，三種細胞的增殖程度沒有顯著差異;不管細胞種類的不 同，山羊a干擾素對細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，隨著干擾素稀釋倍數增加，對細胞 的抑制作用減弱，這與報道的其他干擾素特性相一致。
[0101] 實驗例1表達山羊a干擾素的重組酵母誘導條件的優化
[0102] 1、實驗方法
[0103]對實施例1篩選獲得的表達量高的重組酵母菌株rGS115/G〇IFN_a(微生物保藏編 號為：CGMCC No . 90 88)進行誘導條件優化，在BMGY中培養菌體至0D6QQnm約為1時，轉接至 50mLBMMY中，在250mL的三角瓶內進行誘導表達及條件優化。
[0104] 1.1不同誘導時間
[0105] 30°C250rpm誘導，每6h取1.5mL上清液，并補加甲醇至終濃度為0.5%。將011~4811 的表達上清4°C12000rpm離心30min，各取100μ1與等體積2X上樣緩沖液混合，100°C煮沸變 性3min后，進行Western Blot鑒定。
[0106] 1.2不同菌體密度
[0107] 在BMGY中培養菌體至OD600約為1時，用BMMY重懸至不同0D值，分別于0D值= 0.2、 0.4、0.6、0.8和1進行誘導表達，24h后取上清，進行Western Blot鑒定。
[0108] 1.3不同溫度條件
[0109] 在BMGY中培養菌體至0D_約為1時，轉接至BMMY，分別在22°C、24°C、26°C、28°C和 30°C進行誘導表達，方法同前，24h后取上清，進行Western Blot鑒定。
[0110] 1.4不同甲醇濃度
[0111] 分別配制含0.2 %、0.4 %、0.6 %、0.8 %和1 % (v/v)甲醇的BMMY培養基。在BMGY中 培養菌體至OD600約為1時，分別轉接到不同甲醇含量的BMMY中誘導表達，24h后取上清，進行 Western blot鑒定。
[0112] 2、實驗結果
[0113] 將表達量最高的陽性重組菌18#(微生物保藏編號為：CGMCC No.9088)轉接到 250mL三角瓶進行誘導表達，對誘導條件，如溫度、時間、菌密度和甲醇濃度進行優化， Western blot鑒定分析蛋白表達情況。不同誘導時間的誘導表達結果（如圖7A)顯示，誘導 后6h即可見GoIFN-α表達，到24h后表達量達到最高峰，并且持續到48h。不同誘導溫度進行 的誘導表達，結果(如圖7B)所示，可見在22°C條件下GoIFN-α表達量相對較高，24°C_30°C條 件下蛋白表達量差異不大。不同菌密度轉接后可見（圖7C)，0D值0.2-1.0均可誘導GoIFN-a 表達，并且表達量差異不大，說明不同菌密度對GoIFN-a表達量的影響不大。不同甲醇濃度 甲醇誘導的結果（如圖7D)可見，甲醇濃度對GoIFN-a表達量的影響不大，0.2 % -1 %均可為 適合濃度。綜合以上結果，確定最佳誘導條件為22 °C誘導24h，菌密度和甲醇濃度對表達量 影響不大。最佳誘導條件下，陽性重組菌18#上清中表達的重組GoIFN-a濃度約為O.lmg/ mL〇
[0114] 實驗例2重組山羊a干擾素的臨床應用
[0115] 山羊a干擾素對牛羊的多種疾病有較好的預防和治療效果，例如口蹄疫、羊痘等。 將實施例1構建的重組畢赤酵母(微生物保藏編號為:CGMCC No.9088)表達上清冷凍保存 后，分別在疾病流行的牛場和羊場使用，使用方法:肌肉注射，每天一次，幼畜劑量lml/頭； 育成牛或羊2ml/頭，成年牛羊劑量3ml/頭，連續注射3天，觀察使用效果。
[0116] 實例一:某肉牛場(60頭)發現并經RT-PCR確診為口蹄疫感染，對發病早期的牛肌 肉注射重組山羊a干擾素，連續注射三天后發現口蹄疫癥狀減輕或痊愈；同群未發病(后來 的觀察表明有些已經感染）的牛注射重組山羊a干擾素，結果已經感染牛隨后所表現的癥狀 明顯減輕，幾天后痊愈;同群未發病也未感染的牛，注射干擾素后均未發生口蹄疫。
[0117] 實例二:一般認為羊對口蹄疫不易感，感染后癥狀不明顯。但是近年來羔羊對口蹄 疫呈現高度易感，感染后常引起急性心肌炎突然死亡，羊群中羔羊一般死亡率5-10%，最高 可到40-60%，剖檢可見虎斑心。某綿羊場（120只）發現兩只成年羊腿瘸，一些羔羊不明原因 死亡，剖檢可見虎斑心，經RT-PCR診斷是口蹄疫感染。對發病羊群中的羔羊注射重組山羊a 干擾素，羔羊死亡率明顯降低，證明干擾素具有明顯的治療和預防效果。
[0118] 實例三:羊痘是感染山羊和綿羊的重要接觸性傳染病。某山羊場（110只）突然發生 疫情，經實驗室診斷確診為羊痘感染，對發病早期的山羊和同群未感染的山羊進行緊急接 種重組山羊a干擾素，結果已感染的山羊癥狀明顯減輕、逐漸痊愈，同群未感染的山羊始終 沒有感染。
[0119] 以上實驗表明，本發明畢赤酵母表達的山羊a干擾素對牛羊的重要傳染病口蹄疫、 羊的重要傳染病羊痘具有顯著的預防和治療效果。
【主權項】
1. 優化的山羊α干擾素基因，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。2. 含有權利要求1所述優化的山羊α干擾素基因的重組表達載體。3. 含有權利要求2所述的重組表達載體的宿主細胞。4. 表達權利要求1所述優化的山羊α干擾素基因的重組畢赤酵母。5. 按照權利要求4所述的重組畢赤酵母，其特征在于，其微生物保藏號為：CGMCC No.9088 〇6. -種構建權利要求4或5所述重組畢赤酵母的方法，其特征在于，包括以下步驟：（1) 將SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列克隆至pPIC9K載體，獲得重組質粒pPIC9K-GoIFN-a;(2) 將重組質粒pPIC9K-GoIFN_a線性化，轉化畢赤酵母感受態細胞，篩選鑒定，即得。7. -種誘導權利要求4或5所述重組畢赤酵母表達山羊α干擾素的方法，其特征在于，包 括以下步驟：（1)培養權利要求4或5所述重組畢赤酵母，誘導山羊α干擾素表達；（2)純化所 表達的山羊α干擾素，即得； 其中，步驟（1)所述誘導的條件包括:誘導溫度為22°C-30°C，誘導時間為6h-48h，菌密 度OD6QQnm值為0.2-1.0，甲醇濃度按體積比計為0.2%-1 % ; 優選的，步驟(1)所述誘導的條件包括:誘導溫度為22°C，誘導時間為24h，菌密度OD600nm 值為0.2-1.0，甲醇濃度按體積比計為0.2 % -1 %。8. 權利要求1所述優化的山羊α干擾素基因在制備預防或治療反芻動物病毒性傳染病 的藥物或疫苗佐劑中的應用。9. 權利要求4或5所述的重組畢赤酵母在制備預防或治療反芻動物病毒性傳染病的藥 物或疫苗佐劑中的應用。10. 按照權利要求8或9所述的應用，其特征在于，所述的反芻動物病毒性傳染病包括： 羊痘、藍舌病或羊傳染性膿皰中的任意一種或多種。
【文檔編號】A61K39/39GK105907766SQ201610269580
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】于力, 王芳
【申請人】中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所