專利名稱：體外構建同種生物心臟組織工程瓣膜的一種方法
技術領域：
本發明涉及一種體外構建同種生物心臟組織工程瓣膜的方法。
心臟組織工程瓣就是由無細胞的可吸收或降解的多聚體材料，或者是去除細胞的同種或異種生物瓣作為三維支架，種植自體細胞。先種植成纖維細胞，再種植單層內皮細胞(endothelial cells，ECs)包裹瓣葉，最后制造出的一種具有細胞活性的新型生物瓣植入體內，從而恢復或改進患者瓣膜的功能。目前國際上及國內均單純的采用大隱靜脈、臍帶動靜脈、頸外動靜脈，以及冠狀動靜脈等血管作為提取種植細胞——內皮細胞和成纖維細胞的來源；此外國外也有報道用骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作為種植細胞種植于生物瓣支架上。但未見有利用成人骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)體外定向誘導分化為內皮細胞作為種植細胞的報道。
將來源于MSCs誘導分化的內皮細胞作為種植細胞，種植于脫去了表面內皮細胞的同種生物心臟瓣膜支架上，以體外構建同種生物心臟組織工程瓣膜，檢索文獻目前國內外尚未見報道。
背景技術：
目前，大多數學者常采用大隱靜脈、臍帶動靜脈、頸外動靜脈，以及冠狀動靜脈等血管作為提取種植細胞的來源，其應用存在一些不足，如犧牲供體血管的完整性，增加了外科醫生的操作和患者的創傷；有些血管來源僅能在動物實驗中進行；此外，來源于成人血管的內皮細胞在體外很快進入增殖期，但4～6周后其增殖活性逐漸下降，特有的功能逐漸丟失，難以達到臨床需要。因此，種植細胞的研究工作在一定程度上是目前TEHV體外構建的一個限速過程。
應用人類骨髓間充質(MSCs)干細胞作為心臟組織工程瓣構建的種植細胞來源有幾個優點(1)用一個簡單的骨髓穿刺針，容易收集，可避免損傷血管的完整性；(2)具有潛在的分化為多種細胞系能力；(3)具有獨特的免疫特性，允許同物種異體基因的持續存在。正如Stock所指出的，MSCs定向分化的內皮細胞可能成為TEHV種植細胞的另一個來源。
此外，心臟組織工程瓣支架，國內外學者大多選擇多聚體支架材料，如聚乙二醇酸(PGA)、多聚乳酸(PLA)、聚羥基丁酸(PH4B)等；或異種生物瓣，如豬主動脈瓣等。目前應用人工合成的多聚體材料作為支架存在不足，如多聚體彈性與生物降解性之間的矛盾，以及缺乏最佳的機械性能；而異種生物瓣作為支架也存在不足(1)豬瓣與人瓣膜之間存在瓣口直徑、參數、瓣尖大小和形狀的差別；(2)由于細胞外基質存在異種免疫反應，基質彈性蛋白降解，植入異種帶瓣管道可能產生動脈瘤；(3)可能傳染與供體動物相關的動物源性疾病，還需要進一步調查。而應用同種生物瓣作為支架就可以避免上述缺點。
因此，將來源于MSCs誘導分化的內皮細胞與同種生物瓣支架兩者相結合，就顯示其巨大的優越性，具有廣闊的臨床運用前景。
發明內容
本發明的內容未公開發表，本領域的技術人員如不花費創造性勞動根本不能根據現有的技術推斷得到本發明的骨髓間充質干細胞體外定向誘導分化為內皮細胞的方法，以及種植于脫去內皮細胞的同種生物瓣支架上，以構建同種生物心臟組織工程瓣膜。
本發明的目的是提供一種體外構建心臟組織工程瓣膜的方法，為下一步建立動物移植實驗模型，并最終應用于臨床換瓣手術，尤其是在小兒先天性心臟病組織工程研究中的運用提供了良好的前景。
本發明利用經液氮保存的同種主動脈帶瓣管道作為生物瓣支架，用0.1％SDS脫去瓣膜表面的內皮細胞，并且用纖維連接蛋白(Fn，80μg/ml)預覆蓋瓣膜支架；來源于成人骨髓間充質干細胞經體外定向誘導分化的內皮細胞作為種植細胞，高密度(＞1.2×105/cm2)地種植于瓣膜支架上；種植細胞與生物瓣支架復合體靜態培養20天。分別在靜態培養的第7、14和20天進行硝酸銀染色和掃描電鏡觀察、攝片，以確定其再內皮化程度。實驗結果顯示同種生物瓣支架表面的內皮細胞完全脫去，而細胞外基質的主要成份彈力纖維和膠原纖維保存良好；骨髓間充質干細胞體外誘導分化的內皮細胞與生物瓣支架復合體靜態培養第7、14、20天，其再內皮化程度分別為73％、85％和92％。實驗結果證明我們體外構建的同種生物心臟組織工程瓣基本上實現了再內皮化的預期目標，為今后的動物實驗和臨床應用打下了堅實的基礎。
下面用實施例對本發明進行進一步詳細說明。
四
附圖1MSCs細胞表面標志的流式細胞儀檢測結果CD166 99.9％，CD105 100％，CD29 100％，CD13 100％，CD34 0.08％，HLA-DR 0.60％，CD45 0.15％。
附圖2.0.1％SDS脫細胞后主動脈瓣的表面(SEM，×500)附圖3.MSCs誘導的ECs種植于脫ECs的同種主動脈支架上靜態培養20天時的掃描電鏡照片(SEM×500)附圖4.同種瓣支架種植內皮細胞靜態培養第20天，再內皮化程度92％(0.5％硝酸銀染色，立體顯微鏡，×57)
五具體實施例方式
實施例1成人骨髓間充質干細胞的體外分離、純化和擴增及鑒定一方法1.無菌條件下采集非血液系統疾病的人骨髓(取自軍事醫學科學院附屬醫院全軍造血干細胞移植中心健康成人獻髓員，年齡25～40歲)。
2.骨髓以含10％胎牛血清(FBS，Stem Cell公司，美國)的低糖DMEM(DMEM-LG，GIBCO公司，美國)培養液對半稀釋后，以Percoll細胞分離液(比重1.073g/ml，Pharmacia，美國)梯度離心(900g×30min)，取中間界面層的單個核細胞(mononuclear cells，MNCs)層面，制成MNCs懸液。
3.細胞經PBS洗滌兩遍后計數，按2×105cells/cm2(T-75培養瓶)的密度接種于含10％FBS的LG-DMEM培養液中，置于37℃、5％CO2，飽和濕度的孵箱(model5400，NAPCO公司，美國)內培養。
4.培養72h后更換培養基，以去除懸浮細胞；繼續培養，每3～4d天換液。
5.貼壁層細胞達到90％以上融合后，經0.125％胰蛋白酶消化按6×103cells/cm2的密度接種于傳代培養瓶(T-75)中進行擴增培養。
6.原代培養當出現典型成纖維細胞樣形態和細胞密度融合達到80％～90％時，進行細胞攝像。
7.MSCs細胞培養擴增到第二代時，用胰蛋白酶消化收獲細胞，分別取2×105個細胞與鼠抗人CD13、CD29、CD34、CD45、CD105和HLA-DR抗體室溫中反應30min，用PBS洗滌兩次去除未反應的抗體后與FITC標記的二抗避光反應15min。
8.取2×105個細胞與CD166直標抗體室溫避光孵育20min，1％BSA-PBS清洗2遍，加入500μl PBS重懸，并設IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC5為對照。
9.應用流式細胞儀(COULTER Epics XL-AD 2517，BECKMAN COULTER公司，美國)檢測至少10,000個細胞，用Cofit軟件分析結果。
注以上操作均嚴格按照無菌操作規程二.結果經上述方法可從5.0×105個原代MSCs在體外擴增15代后，獲得8.0×1012個MSCs，擴增了約1.6×107倍。流式細胞儀檢測MSCs的表面抗原特性。CD34、CD45和HLA-DR表達呈現陰性；而CD105、CD13、CD29和CD166表達呈現陽性，均在98％以上。經過2代以上的傳代后(細胞大約分裂14次)，體外擴增的MSC在形態和細胞表型上達到了95％以上的均一(見說明書附圖1)。
實施例2.MSCs向內皮細胞的定向誘導分化及鑒定一.方法1.選擇第3～10代的MSCs作為實驗材料。
2.其誘導培養體系的組成為DMEM-HG，20％FBS(天津市川頁生化制品有限公司，批號030509)、VEGF(10ng/ml，Pepro Tech EC LTD公司，英國)、bFGF(5ng/ml，Pepro Tech EC LTD公司，英國)、L-谷氨酰胺(2mmol/L)、青霉素液(100U/ml)、鏈霉素液(100μg/ml)。
3.每2～3d更換培養液，當貼壁層細胞達到90％以上融合后，經0.125％胰蛋白酶消化傳代；按6×103cells/cm2的密度接種于25cm2培養瓶中。重復上述細胞傳代的操作即可實現細胞的有效擴增。
4.當光鏡下誘導的細胞長成單層，呈“鵝卵石”(cobblestone)樣時制備細胞懸液，分別用5％戊二醛和1％四氧化鋨固定，制成電鏡標本行透射電鏡(TEM，JEM-1010，日本)觀察。
5.VIII因子(vWF)和Tie-2相關抗原的免疫組化檢測(ABC法)選擇MSCs經誘導分化培養體系14～21天的細胞，消化后用離心涂片機涂片于載玻片上，丙酮固定細胞。采用ABC法進行檢測，并設陰性對照組；滴加1∶100的兔抗人VIII因子抗體(一抗)和1∶200的鼠抗人單克隆抗體。Nikon倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)下觀察，拍照。細胞漿內出現棕褐色顆粒為陽性反應。
二.結果MSCs在加入誘導分化培養體系大約14～21d后，形態多不固定，貼壁的細胞表現為較大，呈扁平、大多角形、長梭形、園形、橢原形或板狀，細胞有豐富的胞漿和不規則突起。長成單層的胞，呈典型的“鵝卵石”樣，為內皮細胞形態學特征。TEM下胞漿內可見Weible-palade小體(簡稱W-P小體)，是ECs特有的顆粒。VIII(vWF)因子和Tie-2相關抗原的免疫組化結果顯示細胞呈多角型或圓型，胞漿內布滿細密的棕褐色顆粒，細胞核內未見著色，呈一片陰性對照區，證明培養的是內皮細胞。
實施例3.脫內皮細胞的同種生物瓣支架制備一.方法1.液氮保存的同種帶瓣管道復蘇，用D--Hank’s混合液充分漂洗。該混合液中含有抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100U/ml)；鏈霉素(100μg/ml)；制霉菌素(100U/ml)；HEPES液(10mmol/L，pH 7.6)。
2.漂洗后的同種帶瓣管道貯存于新鮮配制的PBS液中。PBS液中含有EDTA(0.1％，w/v)；抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100U/ml)；鏈霉素(100μg/ml)；制霉菌素(100U/ml)。
3.細胞溶解。用低滲Tris緩沖液溶解瓣膜的細胞，室溫下孵育18～24h。低滲Tris緩沖液的組成Tris緩沖液(10mmol/L)；EDTA(0.1％，w/v)；抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100U/ml)；鏈霉素(100μg/ml)；制霉菌素(100U/ml)。
4.采用細胞洗滌劑來脫細胞，即將SDS加入低滲Tris緩沖液中，室溫下孵育24h。0.1％SDS(w/v)用于脫瓣膜的細胞和脫主動脈壁的細胞。
5.用等滲Tris緩沖液充分沖洗。等滲Tris緩沖液的組成Tris緩沖液(50mmol/L，pH 8.0)；NaCl(0.15M)；EDTA(0.1％，v/v)；抑肽酶(10KIU/ml)；青霉素(100U/ml)；鏈霉素(100μg/ml)；制霉菌素(100U/ml)。
6.形態學觀察及半定量判斷6.1 H-E染色用10％(v/v)中性福爾馬林液作固定、脫水、石蠟包埋，用于觀察大體結構。
6.2改良Van Gieson染色用于確定彈性纖維(elastic fiber，EF)。EF被染成深藍色。
6.3 Masson’s trichrome染色法用來確定膠原纖維(collagen fiber，CF)，CF被染成綠色，。
6.4掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察標本用5％戊二醛固定3～12h，然后用30％、50％、70％、90％及100％的乙醇逐級脫水，再用醋酸異戊酯固定置換，CO2臨界干燥點干燥，種植片表面噴金后，即可于SEM下觀察。
6.5人類同種瓣的形態學結構被半定量1級(好)在H-E染色下觀察無形態學改變，彈力纖維(EF)和膠原纖維(CF)基本無紊亂；2級(可接受程度)較小程度的EF和CF結構紊亂；3級(差)膠原纖維和彈力纖維明顯的結構紊亂，纖維間的空隙增加。
二.結果光鏡和SEM下觀察兩者的內皮細胞基本被脫去，而中心部位的成纖維細胞有一部分被保留了下來，彈力纖維和膠原纖維在脫細胞前后均無明顯改變，其形態學結構半定量為1級(好)(見說明書附圖2)。
實施例5.來源于MSCs的ECs種植于同種生物瓣支架上及靜態培養一.方法1.選擇生長良好的第4～8代ECs細胞制成懸液，調整內皮細胞種植密度為1～2×105cell/cm2。
2.去內皮細胞的同種生物瓣在無菌條件下，剪切成0.8×0.8cm2的大小，置入24孔培養培養板內，其上放置自制的玻璃圈以防止瓣膜漂浮。
3.用纖維連接蛋白(Fn，80μg/ml)預覆蓋瓣膜，并置入含有內皮細胞懸液的DMEM-HG培養體系，內含20％FBS、VEGF(10ng/ml)；FGF(10ng/ml)；L-谷氨酰胺(2mmol/ml)；青霉素(100U/ml)；鏈霉素液(100U/ml)；37℃、5％CO2濕潤孵箱中，每隔3～4天換液一次。靜態培養天共計20天。
4.組織形態學顯微鏡觀察分別在靜態培養的第7天、第14天和第20天結束時進行0.5％硝酸銀染色和掃描電鏡(SEM)觀察、攝片。
4.生物瓣再內皮化程度判斷用百分數來(％)來表示瓣膜被內皮細胞覆蓋的面積，即表面內皮化程度。
二.結果在靜態培養的第7、14、20天同種生物瓣支架內皮化程度分別為73％、85％和92％，基本實現了生物瓣體外再內皮化構建的預期目標，為下一步脈動流培養，以及動物移植實驗和臨床應用提供了材料基礎(見說明書附圖3、4)。
權利要求
1.體外構建同種生物心臟組織工程瓣的一種方法。其特征在于生物瓣支架選擇經液氮保存的同種主動脈帶瓣管道，用0.1％SDS脫去瓣膜表面的內皮細胞，并且用纖維連接蛋白(Fn，80μg/ml)預覆蓋瓣膜支架；來源于成人骨髓間充質干細胞經體外定向誘導分化的內皮細胞作為種植細胞，高密度(＞1.2×105/cm2)地種植于瓣膜支架上；種植細胞與生物瓣支架復合體靜態培養20天。分別在靜態培養的第7、14和20天進行硝酸銀染色和掃描電鏡觀察、攝片，以確定其再內皮化程度。實驗結果顯示同種生物瓣支架表面的內皮細胞完全脫去，而細胞外基質的主要成份彈力纖維和膠原纖維保存良好；骨髓間充質干細胞體外誘導分化的內皮細胞與生物瓣支架復合體靜態培養的第7、14、20天，其再內皮化程度分別為73％、85％和92％。實驗結果證明我們體外構建的同種生物心臟組織工程瓣基本上實現了再內皮化的預期目標，是一種心臟瓣膜組織工程學研究的有效方法。
全文摘要
本發明包括利用經液氮保存的同種主動脈帶瓣管道作為生物瓣支架，用0.1％SDS脫去瓣膜表面的內皮細胞；來源于成人骨髓間充質干細胞經體外定向誘導分化的內皮細胞作為種植細胞，高密度(＞1.2×10
文檔編號C12N5/08GK1629284SQ20031012113
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月16日 優先權日2003年12月16日
發明者劉迎龍, 馮濱, 龔茹, 馮凱, 謝寧, 宋來鳳 申請人:劉迎龍, 馮濱