專利名稱：大規模液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種大規模液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖工藝。
背景技術：
樺褐孔菌(Fuscoporia obliqua)又名白樺茸，在俄羅斯和東歐民間叫Chaga，屬擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，生于白樺樹、銀樺、榆樹、赤楊等的樹皮下或活立木的樹皮下或砍伐后樹木的枯干上。
16-17世紀以來，俄羅斯、波蘭、芬蘭等民間就廣泛利用其野生子實體來防治各種疑難雜癥，如各種癌癥(胃癌、肝癌、腸癌等各種消化器官癌癥)以及心臟病和糖尿病等。波蘭自1961年以來就廣泛使用樺褐孔菌來治療癌癥。日本的研究人員高度評價俄國這種民間的藥物，并認為這是上帝賜給苦難人類的一種奇特的禮物，可用來防治肝癌、愛滋病和O-157大腸桿菌中毒。據報道，俄羅斯的堪索莫樂斯基(Komsomlski)制藥公司生產的樺褐孔菌精粉對糖尿病的治愈率達93％。樺褐孔菌的水煎煮物具有顯著的抗腫瘤活性。樺褐孔菌的糖漿劑早已用于治療癌癥。由于來源稀少，其野生子實體的價格是桑黃(Phellinus igniarius)的7-8倍。
發明內容
本發明的目的是以生產樺褐孔菌水提取物及多糖為目標，發明一種廉價高效的樺褐孔菌水提取物及多糖的大規模液體深層發酵工藝，為今后的產業化應用打下基礎。
實現本發明的技術方案以樺褐孔菌真菌為出發菌株，采用斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和發酵培養。在發酵結束后，將終了發酵液繼續加熱到一定溫度，攪拌維持一定時間，攪拌停止后，將發酵液噴霧干燥得發酵菌粉。如將發酵液經板框壓濾，清液濃縮，噴霧干燥得到樺褐孔菌水提取物，如將清液濃縮后用適量乙醇沉淀，取沉淀物加適量水溶解，噴霧干燥可得樺褐孔菌多糖。
本菌株購自山東金鄉真菌研究所。
實現本發明的具體步驟如下(1)取出斜面菌種接入配制的新鮮斜面培養基中，培養溫度25-33℃，培養150-250小時。
(2)將步驟1中的斜面菌種轉接入裝有搖瓶培養基的搖瓶中，25-33℃培養，轉速120-180rpm/min，培養70-120小時后進行搖瓶的擴大培養。
(3)將步驟2中的搖瓶菌種轉接入裝有搖瓶擴大培養基的搖瓶再進行擴大培養，25-33℃培養，轉速120-180rpm/min，培養35-60小時后接入一級種子罐進行培養。
(4)將步驟3中的搖瓶菌種轉接入一個裝有種子培養基的一級種子罐中，接種量為4-10％，保持罐溫25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發酵35-60小時，然后轉接入發酵罐發酵。
(5)將一級種子罐中的菌種轉接入一個裝有發酵培養基的發酵罐中，接種量為4-10％，保持罐溫25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發酵90-150小時。發酵液還原糖含量降低到1.0-2.0％左右時為發酵終了，放罐。
本發明中斜面培養基的配方是(g/100m1)馬鈴薯15-25，葡萄糖1-3，瓊脂1.5-2.5，加水定容至所需體積，pH值自然。
本發明中搖瓶培養基的配方是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.5，麩皮汁1.0-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.5。
本發明中搖瓶擴大培養基的配方是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.7，玉米粉0.5-2，麩皮汁1.0-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.5。
本發明中一級種子培養和發酵培養的培養基配方是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.7，玉米粉0.5-2，黃豆粉0.5-2，麩皮汁1-3，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.5。
本發明步驟2和3中搖瓶培養基與搖瓶容積比為1∶5。
本發明步驟4中一級種子罐的容積為100-300L，在該一級種子罐中裝有的一級種子培養基相應為50-180L；步驟5中發酵罐的容積為1000-5000L，在該發酵罐中裝有的發酵培養基相應為500-3500L。
本發明的放罐標準是發酵液開始變得粘稠，還原糖含量降低到1.0-2.0％左右，鏡檢發現菌絲體開始衰老。
如需獲取其水提取物及多糖，則在本發明所述的發酵終止后，將發酵終了液溫度加熱到60-100℃，攪拌速度為150-250rpm/min，維持2-4小時，攪拌停止后，將發酵液噴霧干燥得發酵菌粉。如需獲取樺褐孔菌水提取物，用泵將發酵液輸送到貯罐中，經板框壓濾，得清液。濾液經濃縮，使最后體積為原液的1/4-1/10，取濃縮液噴霧干燥得到樺褐孔菌水提取物。如加入適量乙醇使乙醇濃度達75％，醇析20-30小時，取沉淀用去離子水溶解，噴霧干燥即得到樺褐孔菌多糖。
本發明的有益效果本發明適用于大規模液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖，對于今后的工業化生產和相關的應用產業的發展具有重要意義。本發明所得樺褐孔菌水提取物和多糖顏色為褐色。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。
實施例1在斜面培養基中接種購自山東金鄉真菌研究所的樺褐孔菌菌絲體，培養溫度28℃，培養時間180小時。將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養基的500ml三角瓶中，28℃搖床培養96小時，搖床轉速150rpm/min。然后將所得搖瓶菌種轉接入裝有100ml培養基的500ml三角搖瓶中進行擴大培養，28℃搖床培養45小時，搖床轉速150rpm/min。然后將三角瓶擴大的菌種2200ml轉接入裝有50L種子培養基的100L一級種子罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.7kPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間45小時。將一級種子罐菌種轉接入裝有800L發酵培養基的1500L發酵罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.7kPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間120小時，發酵菌粉以干重計為3.5％，多糖含量為22％。
本實施例1中斜面培養基組成是(g/100ml)馬鈴薯20，葡萄糖2，瓊脂2，加水定容至所需體積，pH值為自然。
本實施例1中搖瓶培養基組成是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨0.2，麩皮汁2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至所需體積，pH值為5.0。
本實施例1中搖瓶擴大培養基組成是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨0.2，玉米粉1，麩皮汁2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至所需體積，pH值為5.0。
本實施例1中100L一級種子罐的培養基組成是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨0.2，玉米粉1.5，黃豆粉1，麩皮汁2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至50L，pH值為5.0。
本實施例1中1500L發酵罐的培養基配方是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨0.5，玉米粉1.5，黃豆粉1.0，麩皮汁2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至800L，pH值為5.0。
本實施例1中發酵結束標準是發酵液開始變得粘稠，還原糖含量降低到1.5％，鏡檢發現菌絲體開始衰老。
獲取樺褐孔菌發酵菌粉、水提取物及多糖的方法是在本發明所述的發酵終止后，將溫度加熱到90℃，攪拌速度為220rpm/min，維持3小時，攪拌停止后，將發酵液噴霧干燥得發酵菌粉。或用泵將發酵液輸送到貯罐中，經板框壓濾，濾液經濃縮，使最后體積為原液的1/5，取濃縮液噴霧干燥得到樺褐孔菌水提取物。如需獲取多糖，則將濃縮液加入適量乙醇使乙醇濃度達75％，醇析24小時，取沉淀用去離子水溶解，噴霧干燥得到樺褐孔菌多糖。
權利要求
1.一種液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是以樺褐孔菌真菌(Fuscoporia obliqua)為出發菌株，采用斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和發酵培養得樺褐孔菌菌絲體發酵液，在發酵結束后，將發酵液噴霧干燥得發酵菌粉，或將終了發酵液繼續加熱到一定溫度，攪拌維持一定時間，發酵液經板框壓濾，清液濃縮，噴霧干燥得到樺褐孔菌水提取物，或將清液濃縮后用適量乙醇沉淀，取沉淀物加適量水溶解，噴霧干燥可得樺褐孔菌多糖。
2.根據權利要求1所述的液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是以購自山東金鄉真菌研究所的樺褐孔菌真菌為出發菌株。
3.根據權利要求1所述的液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的斜面菌種培養，培養基組成是(g/100ml)馬鈴薯15-25，葡萄糖1-3，瓊脂1.5-2.5，加水定容至所需體積，pH值為自然，斜面菌種培養溫度25-33℃，培養150-250小時。
4.根據權利要求1所述的液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的搖瓶培養，培養基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.5，麩皮汁1.0-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.5，培養條件是培養溫度25-33℃，轉速120-180rpm/min，培養70-120小時，然后轉接入搖瓶進行擴大培養。
5.根據權利要求1所述的液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的搖瓶擴大培養，培養基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.7，玉米粉0.5-2，麩皮汁1.0-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.5，培養條件是培養溫度25-33℃，轉速120-180rpm/min，培養35-60小時，然后轉接入一級種子培養。
6.根據權利要求1所述的液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的一級種子培養，培養基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.7，玉米粉0.5-2，黃豆粉0.5-2，麩皮汁1-3，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.5，接種量為4-10％，培養條件是培養溫度25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發酵35-60小時，然后轉接入發酵罐發酵。
7.根據權利要求1所述的液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的發酵培養，發酵培養基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.7，玉米粉0.5-2，黃豆粉0.5-2，麩皮汁1-3，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.5，接種量為4-10％，培養條件是培養溫度25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發酵90-150小時，當發酵液還原糖含量降到1.0-2.0％時，為發酵終了。
8.根據權利要求1所述的液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的發酵培養，可選擇1000-5000L的發酵罐進行發酵培養。
9.根據權利要求1所述的液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖的工藝，其特征是將終了發酵液溫度加熱到60-100℃，攪拌速度為150-250rpm/min，維持2-4小時，攪拌結束后，將發酵液用噴霧干燥可得樺褐孔菌發酵菌粉；或用泵將發酵液輸送到貯罐中，經板框壓濾得到清液，清液濃縮至體積為原體積的1/4-1/10，噴霧干燥得到樺褐孔菌水提取物；或將清液濃縮后用適量乙醇沉淀，醇析液乙醇濃度為75％，醇析20-30小時，取沉淀物加適量水溶解，噴霧干燥可得樺褐孔菌多糖。
全文摘要
大規模液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖工藝。本發明以大規模液體深層發酵生產樺褐孔菌水提取物及多糖為目標，以山東金鄉真菌研究所的樺褐孔菌真菌為出發菌株，采用斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和發酵培養，最終發酵罐體積達1000－5000L。發酵結束后，將終了發酵液溫度加熱到60－100℃，攪拌速度為150－250rpm/min，維持2－4小時，用泵將發酵液輸送到貯罐中，經板框壓濾，清液濃縮，噴霧干燥得到樺褐孔菌水提取物，如將清液濃縮后用適量乙醇沉淀，取沉淀物加適量水溶解，噴霧干燥可得樺褐孔菌多糖。
文檔編號C12P19/00GK1556194SQ200410013868
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月7日 優先權日2004年1月7日
發明者敖宗華, 符慧子, 鄒錫良 申請人:敖宗華, 符慧子, 鄒錫良