專利名稱：螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種聚合酶鏈式反應芯片，特別是一種螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片。用于預防醫學與衛生領域。
背景技術：
在分子生物學的化學分析系統中，聚合酶鏈式反應是至關重要的組成環節，微機電技術(MEMS)的發展使聚合酶鏈式反應可以在芯片上完成。一般的微通道式聚合酶鏈式反應芯片，用三個溫度區分別控制變性、復性、延伸三個反應步驟，制作于芯片上的微流通道循環經過這三個溫度區的反復變化，使使通道內參予反應的混合試劑中，脫氧核糖核酸(DNA)分子的片段在微流通道中流動時獲得幾何級數級擴增。微通道式聚合酶鏈式反應芯片是當前聚合酶鏈式反應芯片研究的熱點，研究結果表明微通道式聚合酶鏈式反應芯片以其自身結構的特點克服了微室靜態反應芯片加熱緩慢、難以用于批量進樣和交叉污染的困難，使分子化學分析中的效率大大提高，可以廣泛應用于生物醫學、預防醫學與環境監測等領域。
聚合酶鏈式反應的效率與試劑在變性、復性、延伸三個環節的溫度和時間密切相關，試劑經歷的循環溫度變化過程與聚合酶鏈式反應溫度曲線吻合的程度在很大程度上影響產物的生成效率，但是，當前微通道式聚合酶鏈式反應芯片在微流路的設計上始終不盡合理，在多數的設計中，都會使微流體通道在經過三個溫度區后返回過程中，不可避免的經過一段中間等待期，它不僅使試劑中的微量脫氧核糖核酸DNA分子片段在經歷變性、復性、延伸三個溫度變化時無法完整符合聚合酶鏈式反應溫度曲線，也降低了聚合酶鏈式反應的速度，不利于擴增效率，。經文獻檢索發現，Ivonne Schneegaβ等人在《Reviews in MolecularBiotechnology》(《分子生物學評論》)2001，82101-121上發表的“Flow-throughpolymerase chain reactions in chip thermocyclers”(微通道式聚合酶鏈式反應芯片)，該文中提到的聚合酶鏈式反應芯片TC1997具有25個循環通道，采用減少中間等待期流體通道的截面積的設計，通道內流體流速得到了提高，然而，由于改變微流管道截面積，微通道內會產生阻礙聚合酶鏈式反應的氣泡，另外，由于其流速的不均勻性，這種微通道式聚合酶鏈式反應芯片無法應用于批量進樣的需要，事實上，這種設計無法用于實際應用中。文中還提到了幾種結構的微通道式聚合酶鏈式反應芯片，雖然改進了熱區的設計布局，利用特殊工藝和材料提高了擴增效率，但在流體通道和三個溫度區的空間安排上與TC1997都存在相同的缺點，不利于高效率聚合酶鏈式反應需要。
發明內容
本發明的目的在于針對現有聚合酶鏈式反應芯片的溫度區設計不足和微通道布局不合理的缺陷，提出一種螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片，通過改變片上微流路布局和溫度區布局，使試劑在芯片上流動時，經歷的溫度變化符合聚合酶鏈式反應的擴增曲線，從而提高擴增的產率，解決了背景技術中存在的問題。
本發明是通過以下技術方案來實現的。本發明芯片包括密封蓋層，帶有微流通道的基底層、試劑樣品輸出口、試劑樣品輸入口，螺旋式微流通道、絕緣層以及金屬引線層、環形溫度傳感器、復性區散熱區以及環形變性區加熱器、環形延伸區加熱器。其連接方式為帶有微流通道的基底層上的微流通道為螺旋式微流通道，帶有微流通道的基底層與密封蓋層以鍵合技術密封在一起，在密封蓋層設有試劑樣品輸入口、試劑樣品輸出口，試劑樣品輸入口、試劑樣品輸出口分別與通道起點、通道終端相對應，帶有微流通道的基底層的另一側設有環形變性區加熱器、環形延伸區加熱器以及環形溫度傳感器，另外金屬薄膜形成的復性區散熱區位于芯片右下方，在芯片的絕緣層和帶有微流通道的基底層之間，負責在復性區溫度區的過高時參予強制散熱，帶有微流通道的基底層上沉積絕緣層和金屬引線層。
螺旋式微流體通道，在布局上分內環帶微流體通道和外環帶微流體通道，內環帶微流體通道在芯片中心區域，負責試劑預加熱和反轉錄聚合酶鏈式反應時反轉錄酶的失活，外環帶微流體通道與位于芯片底部的各個溫度加熱器相對應，分為變性區、復性區、延伸區。
帶有微流通道的基底層和密封蓋層組成芯片的基本結構，在芯片底部設有試劑預加熱區加熱器、變性區環形薄膜加熱器、復性區散熱區、延伸區環形薄膜加熱器，試劑樣品在螺旋式微流通道上運動時，穩定的流經預加熱區、變性區、復性區、延伸區，其溫度通過位于芯片下部的各區環形薄膜加熱器和環形溫度傳感器監控，倍增產物樣品由試劑樣品輸出口導出。為了平滑試劑樣品流動，螺旋式微流通道在拐點區段的銜接處設計了圓角。
本發明中，基底上的螺旋式微流體通道在布局上分內環帶和外環帶，內環帶微流體通道的作用是試劑在內環帶微流體通道流動時，經過試劑預加熱區加熱器的作用，在進入循環前獲得充分解鏈，提高產率，而對于另一種特別聚合酶鏈式反應-反轉錄聚合酶鏈式反應，在反應過程中，混入液態試劑樣品中的反轉錄酶會抑制聚合酶鏈式反應，當試劑從內環帶微流體通道流動時，利用試劑預加熱區的加熱過程可以令反轉錄酶失活，使其不至于進入擴增反應環節。而外環帶微流體通道由變性區、復性區、延伸區構成，當試劑依次流過各區時，位于芯片下部的各區集成環形薄膜加熱器會循環加熱和冷卻試劑，使聚合酶鏈式反應的循環過程得以進行。
螺旋式微流通道的中心區域即內環帶微流體通道底部設有預加熱區加熱器，而與外環帶微流體通道變性區、延伸區相對應的是環形變性區加熱器、環形延伸區加熱器和環形溫度傳感器，螺旋式微流通道的各個拐點區段的銜接處采用圓角平滑試劑樣品流動，預加熱區加熱器和環形變性區加熱器、環形延伸區加熱器均為環形。
本發明將現有聚合酶鏈式反應芯片中運載試劑樣品的逶迤式微管道變換成螺旋式微管道。試劑在預加熱、變性區、復性區、延伸區的加熱時間由熱區面積、流體的流速和微通道在片上的形狀來決定，螺旋式微通道在基底上的形狀由系列漸開線參數決定，各熱區的溫度調節由位于芯片底部的各區集成環形薄膜加熱器和環形傳感器來實現，螺旋式微通道的內環周長小于外環，液態試劑樣品從試劑樣品輸入口注入后，先進入內環帶微流體通道，開始擴增進程，隨著試劑內靶序列濃度的升高，試劑開始進入外環帶微流體通道，在負責聚合酶鏈式反應的三個溫度區的加熱時間也隨之延長，倍增后產物由位于螺旋微通道外環末端的試劑樣品輸出口流出。芯片下部的環形薄膜加熱器和環形傳感器由計算機進行精確控制保證芯片上聚合酶鏈式反應的進行。本發明可以進一步減小芯片體積，從而使其更容易整合進入擁有綜合分析處理能力的芯片集總分析系統內。
本發明用玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)兩種材質制作封裝成形，利用軟光刻工藝在PDMS上制作出具有螺旋式微流體通道的基底，與玻璃封蓋封裝后使其密閉，玻璃封蓋上的試劑樣品輸入口、試劑樣品輸出口負責試劑的輸入和產物的輸出，微通道層的基底下即芯片下部集成了環形薄膜加熱器和環形傳感器控制溫度，薄膜加熱器和傳感器采用濺射鉑金屬(Pt)或銦錫氧化物(ITO)薄膜來實現。在集成環形薄膜加熱器和環形溫度傳感器上再形成絕緣層，最后布引線和電極。
本發明具有實質性的特點和進步，本發明改變了已有微通道聚合酶鏈式反應芯片的流體通道布局，使熱區的分布更趨合理，樣品試劑得溫度循環更接近擴增溫度曲線，因而提高了擴增效率。通過設計內環預加熱區流體通道，和芯片下部與內環通道相應薄膜加熱器和傳感器，擴大了本芯片的使用范圍，增強芯片的效率，同時縮小了芯片體積，提高了芯片的兼容性和可集成性。
圖1本發明結構示意2本發明左視圖分解示意3本發明右視圖分解示意4本發明螺旋式微流路通道結構示意5本發明環形薄膜加熱器結構示意圖具體實施方式
如圖1、2、3、4、5所示，本發明包括密封蓋層1，帶有微流通道的基底層2、螺旋式微流通道4、試劑樣品輸出口6、試劑樣品輸入口7、絕緣層12以及金屬引線層13、環形溫度傳感器18、復性區散熱區19以及環形變性區加熱器21、環形延伸區加熱器22，其連接方式為帶有微流通道的基底層2上的微流通道為螺旋式微流通道4，帶有微流通道的基底層2與密封蓋層1封裝為一體，在密封蓋層1設有試劑樣品輸入口7、試劑樣品輸出口6，試劑樣品輸入口7、試劑樣品輸出口6分別與通道起點14、通道終端16相對應，帶有微流通道的基底層2的另一側設有環形變性區加熱器21、環形延伸區加熱器22以及環形溫度傳感器18，另外金屬薄膜形成的復性區散熱區19位于芯片右下方，如圖3，在芯片的絕緣層12和帶有微流通道的基底層2之間，負責在復性區溫度區的過高時參予強制散熱，帶有微流通道的基底層2上沉積絕緣層12和金屬引線層13。
如圖2、4，螺旋式微流體通道4，在布局上分內環帶微流體通道和外環帶微流體通道，內環帶微流體通道在芯片中心區域，負責試劑預加熱和反轉錄聚合酶鏈式反應時反轉錄酶的失活，外環帶微流體通道與位于芯片底部的各個溫度加熱器相對應，分為變性區、復性區、延伸區。
螺旋式微流通道4的中心區域即內環帶微流體通道底部設有預加熱區加熱器20，而與外環帶微流體通道變性區、延伸區相對應的是環形變性區加熱器21、環形延伸區加熱器22和環形溫度傳感器18。預加熱區加熱器20和環形變性區加熱器21、環形延伸區加熱器22均為環形。螺旋式微流通道4的各個區段的拐點區段的銜接處采用圓角5、15、17設計以平滑試劑樣品流動。
本發明采用了多層結構模式，帶有微流通道的基底層2和密封蓋層1形成芯片的基本結構，芯片下部為試劑預加熱區加熱器10和控制變性區溫度的環形薄膜加熱器9、控制復性區散熱的薄膜加熱器11、控制延伸區溫度的薄膜加熱器8，試劑樣品在螺旋式微流通道4上運動時，依次流過變性、復性、延伸區，位于芯片下部的相應加熱器和傳感器控制溫度，最終的倍增產物樣品由試劑樣品輸出口6導出。
權利要求
1.一種螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片，包括密封蓋層(1)，帶有微流通道的基底層(2)、螺旋式微流通道(4)、試劑樣品輸出口(6)、試劑樣品輸入口(7)、絕緣層(12)以及金屬引線層(13)、環形溫度傳感器(18)、復性區散熱區(19)以及環形變性區加熱器(21)、環形延伸區加熱器(22)，其特征在于，帶有微流通道的基底層(2)上的微流通道為螺旋式微流通道(4)，帶有微流通道的基底層(2)與密封蓋層(1)封裝為一體，在密封蓋層(1)設有試劑樣品輸入口(7)、試劑樣品輸出口(6)，試劑樣品輸入口(7)、試劑樣品輸出口(6)分別與通道起點(14)、通道終端(16)相對應，帶有微流通道的基底層(2)的另一側設有環形變性區加熱器(21)、環形延伸區加熱器(22)以及環形溫度傳感器(18)，另外金屬薄膜形成的復性區散熱區(19)位于芯片右下方絕緣層(12)和帶有微流通道的基底層(2)之間，帶有微流通道的基底層(2)上沉積絕緣層(12)和金屬引線層(13)。
2.根據權利要求1所述的螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片，其特征是，采用了多層結構模式，帶有微流通道的基底層(2)和密封蓋層(1)形成芯片的基本結構，芯片下部為試劑預加熱區加熱器(10)和控制變性區溫度的環形薄膜加熱器(9)、控制復性區散熱的薄膜加熱器(11)、控制延伸區溫度的薄膜加熱器(8)。
3.根據權利要求1所述的螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片，其特征是，所述的螺旋式微流體通道(4)，在布局上分內環帶微流體通道和外環帶微流體通道，內環帶微流體通道在芯片中心區域，負責試劑預加熱和反轉錄聚合酶鏈式反應時反轉錄酶的失活，外環帶微流體通道與位于芯片底部的各個溫度加熱器相對應，分為變性區、復性區、延伸區。
4.根據權利要求1或3所述的螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片，其特征是，所述的螺旋式微流通道(4)的內環帶微流體通道底部設有預加熱區加熱器(20)，與外環帶微流體通道變性區、延伸區相對應的是環形變性區加熱器(21)、環形延伸區加熱器(22)和環形溫度傳感器(18)，預加熱區加熱器(20)和環形變性區加熱器(21)、環形延伸區加熱器(22)均為環形。
5.根據權利要求1或3所述的螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片，其特征是，所述的螺旋式微流通道(4)的各個拐點區段的銜接處采用圓角(5、15、17)平滑試劑樣品流動。
全文摘要
一種螺旋式微通道聚合酶鏈式反應芯片，用于預防醫學與衛生領域。本發明帶有微流通道的基底層上的微流通道為螺旋式微流通道，帶有微流通道的基底層與密封蓋層以鍵合技術密封在一起，在密封蓋層設有試劑樣品輸入口、試劑樣品輸出口，分別與通道起點、通道終端相對應，帶有微流通道的基底層的另一側設有環形變性區加熱器、環形延伸區加熱器以及環形溫度傳感器，金屬薄膜形成的復性區散熱區位于芯片右下方絕緣層和帶有微流通道的基底層之間，帶有微流通道的基底層上沉積絕緣層和金屬引線層。本發明提高了擴增效率，擴大了芯片的使用范圍，增強芯片的效率，同時縮小了芯片體積，提高了芯片的兼容性和可集成性。
文檔編號C12P19/00GK1584043SQ20041002470
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月27日 優先權日2004年5月27日
發明者陳文元, 賈曉宇, 牛志強, 張衛平 申請人:上海交通大學