專利名稱：一種捕食線蟲真菌菌株及制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體地說是一種捕食線蟲真菌菌株及制備方法。
背景技術：
植物寄生線蟲是農作物的重要病原物之一，可導致作物減產10～30％，有的甚至絕收。其中根結線蟲Meloidogyne、異皮線蟲Heterodera和莖線蟲Ditylenchus是制約生產的3個主要線蟲類群。對植物寄生線蟲的防治歷來以輪作、栽培措施、使用抗病品種、施用化學藥劑為主。但線蟲的胞囊或卵在土壤中存活時間長，給輪作、栽培措施防治帶來一定困難。抗病品種常導致在一個地區連續種植單一抗性品種，由于品種選擇壓力的作用，使線蟲的群體發生變化，最終導致品種抗性喪失。在目前的實際生產中，控制植物寄生線蟲危害的主要手段是使用化學殺線劑，如涕滅威、呋喃丹、各種土壤熏蒸劑等，它們大多為劇毒農藥，這些產品的殘余物可保持在地下水和土壤中，對環境造成嚴重污染；另一方面由于許多農作物產品是作為人們直接消費的食物，其殘留的藥物將直接威脅著人類的健康；另外，由于這些產品對人有毒，在許多發達國家，如美國、荷蘭、德國等很多化學殺線蟲劑都已禁用。利用線蟲的天敵來防治線蟲是一種安全而有效的生物防治方法，為世界各國的植保工作者所青睞。線蟲的天敵主要有真菌、細菌、病毒、捕食性線蟲、螨類、渦蟲、昆蟲和原生動物等，其中真菌就占了75％，是自然界中重要的線蟲控制因子。雖然目前有部分線蟲生防真菌制劑出現，但制備工藝大多比較復雜，同時，由于土壤環境中如土壤抑菌作用等的影響，使得生防菌在土壤中的存活定殖很困難，尤其是不能產生抗逆菌體結構的生防菌。
動物寄生線蟲是影響畜牧業發展的重要寄生蟲之一。其中血矛線蟲(Haemonchus)、食道口線蟲(Oesophagostomum)、仰口線蟲(Bunostomum)、奧斯特線蟲(Ostertagia)，夏伯特線蟲(Chabertia)和羊網尾線蟲(Dictyocaulus)是主要的寄生線蟲。其危害主要是引起成年家畜生產率下降、營養障礙和循環失調，以及幼年家畜的發育遲緩等。如何防治動物線蟲病害已成為提高畜牧業生產的關鍵因素之一。目前國內外用來防治動物線蟲的方法還主要立足于化學驅蠕蟲藥的使用上，即通過化學藥物來控制線蟲。而牧場是寄生線蟲的重要蟲源，線蟲隨動物進食攝入體內，一般藥劑無長期殺蟲作用；但長期使用可使線蟲種產生抗藥性；另外，藥物在動物體內的殘留可對人的健康造成直接或潛在的危害。因而人們開始從其它方面來尋找控制線蟲的途徑，而生物控制就是其中之一。其中利用捕食線蟲真菌控制動物寄生線蟲是一種主要的生物控制方法。雖然有的捕食線蟲真菌對線蟲有較高的捕食率，但由于不能抵御動物消化道的消化環境，因而不能方便地通過飼料添加、動物飼喂的方法來對環境中的寄生線蟲進行控制，使其使用受到限制。
1998年，Tepljakova T V；Zelenkov V N對植物、動物寄生線蟲捕食真菌生產工藝申請了專利(專利號RU2106092)。制劑首先通過節叢孢(Arthrobotrys oligospora)BKMF-3062D液體培養，然后大量提取菌絲，并按1∶2比例添加高嶺土或沸石作為載體，最后過篩、干燥，制成顆粒劑使用。該專利菌株和制成的顆粒劑沒有被描述能用于作為簡單的飼料添加。
另外，與其它微生物活體制劑一樣，殺線蟲微生物制劑同樣存在制劑保存期短的問題，一般在室溫下存放6個月以上，其活菌數往往減少80％以上。
因此，本發明的目的是提供一種能同時用于防治植物寄生線蟲和控制反芻動物腸道寄生線蟲的捕食線蟲真菌及其制備方法。
因此，本發明的目的之一就是使用一種來自自然的捕食線蟲真菌防治植物寄生線蟲，其對人及環境均無害。
本發明涉及一種可防治根結線蟲屬Meloidogyne、異皮線蟲屬Heterodera和莖線蟲屬Ditylenchus destructor線蟲的捕食線蟲真菌及其制備方法。
因此，本發明的另一目的就是使用一種來自自然的捕食線蟲真菌，通過飼料添加的方法使反芻動物攝取并通過腸道排泄到環境中來控制動物寄生線蟲對反芻動物的感染，其對動物、環境及人均無害。作為控制目標的線蟲主要包括血矛線蟲(Haemonchus)、食道口線蟲(Oesophagostomum)、仰口線蟲(Bunostomum)、奧斯特線蟲(Ostertagid)，夏伯特線蟲(Chabertia)和羊網尾線蟲(Dictyocaulus)。
因此，本發明的另一目的就是提供一種能在保存1年以后，使制劑中有效微生物個體含量超過50％以上的捕食線蟲真菌及其制備方法。
發明內容
有害線蟲的生物防治，就是利用拮抗微生物來防止或減少有害線蟲對植物和動物的為害。本發明的目的是針對目前還沒有非常經濟有效的用于防治有害線蟲的微生物制劑，而提供一種從土壤中分離篩選培養出的特定的捕食線蟲真菌，用于防治植物寄生線蟲和反芻動物腸道寄生線蟲，本發明還提供了該捕食線蟲真菌的制備方法。
為有效地分離到捕食線蟲真菌株，本發明通過用線蟲作誘餌并挑取捕食線蟲真菌捕食器官的方法，分離得到捕食線蟲真菌BJNF-1隔指孢(Dactylella sp.)，該菌種已在中國專利局指定的微生物保藏單位，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏登記號為CGMCC No.1051。
BJNF-1隔指孢(Dactylella sp.)具有下述性質培養特征在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上，25℃，3天可形成大量三維捕食菌網，并產生分生孢子和厚垣孢子，氣生菌絲發達，絮狀，菌落淺褐色，6天菌落直徑75mm，10天產生大量厚垣孢子。
在玉米粉瓊脂培養基(CMA)上，25℃，菌落白色，菌絲匍匐，無色，菌落菌絲極為致密，菌落靠邊一圈產生分生孢子和大量厚垣孢子，6天菌落直徑70mm，10天產生大量厚垣孢子。
在酵母培養基上，25℃，6天菌落直徑70mm，菌落正面蒼白色，背面黃褐色，氣生菌絲極發達，絨氈狀，外緣菌絲較為稀疏，呈草帽狀，能產生大量分生孢子。
在營養瓊脂培養基(NA)上，25℃，6天菌落直徑50mm，菌落正面菌絲不發達，稀疏，白色，背面淺褐色，產生可溶性褐色素，有少量分生孢子產生。
鏡檢形態新生菌絲無隔，老菌絲有隔，營養菌絲寬2.5～7.0μm。
分生孢子梗單生，直立，分隔，極少分枝，梗長250～300μm，基部寬6.5～7.5μm，頂部寬4.0～5.5μm，梗頂端著生1～數個分生孢子，孢子產生方式為全壁芽殖式，孢子梗頂端不膨大。
分生孢子擬倒棒狀，近基部急變窄，似瓶頸，基部平截，無分隔或1個分隔；有分隔孢子分隔一般在中部偏下，部分孢子在分隔處縊束；部分無隔分生孢子在中部稍凹陷；大多分生孢子頂部鈍圓，極少數鈍尖，分生孢子大小35.0～45.0×9.0～11.0μm。
厚垣孢子在人工培養基上形成大量厚垣孢子，厚垣孢子間生或頂生，可在基內菌絲上形成，也可在三維粘性菌網上產生，厚垣孢子球形或擬球形，黃褐色，成熟厚垣孢子具表面疣突，大小為32.0～35.0×27.0～32.0μm捕食器官為不很發達三維粘性菌網，可在無線蟲存在時在不同的人工培養基上大量產生，三維菌網具有很強的捕食線蟲能力，在菌網初形成為菌絲狀時即可捕捉線蟲，在菌網上可產生厚垣孢子。
上述捕食線蟲真菌按以下方法分離培養用線蟲做誘餌加到接有土壤樣品的瓊脂培養基上，25～28℃暗培養5～8天后，將產生的捕食菌網挑至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，培養基內含青霉素、鏈霉素和金霉素分別為20μg/ml、40μg/ml、30μg/ml，培養得該捕食線蟲真菌。
上述捕食線蟲真菌的制備方法，其特征在于該制備方法按以下步驟進行(1).試管培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，將該菌接種在試管培養基上，25～30℃培養3～5天。
(2).擴大培養采用液體馬鈴薯葡萄糖培養基，將上述試管中培養菌接種在灌裝液體培養基的錐形瓶中，于搖床上25～30℃振蕩暗培養5～6天作為固體培養用種子。
(3).固體培養采用麥秸桿馬鈴薯葡萄糖固體培養基將干麥秸稈切成2mm長秸稈段，將麥秸稈段吸水并使飽和后瀝干水；將馬鈴薯用適量水煮熟并使其成糊狀；使干麥秸稈、馬鈴薯、葡萄糖，三者質量比為25∶10∶1，混合、拌均勻；121℃高壓蒸汽滅菌30～60分鐘，冷卻至室溫。按質量比固體培養基∶液體種子為50∶1的比例，將擴大培養種子接種到固體培養基上，混勻，28℃暗培養5～7天得到捕食線蟲真菌固體培養物。
上述所得捕食線蟲真菌固體培養物經過常溫(25℃)自然干燥或35℃人工恒溫干燥后的厚垣孢子含量達106個每克干重；捕食線蟲真菌固體培養物經過常溫(25℃)自然干燥保存3年后，其厚垣孢子存活率為15％。捕食線蟲真菌固體培養物經一定工藝流程制成捕食線蟲真菌制劑，用于防治植物寄生線蟲和防止或減少反芻動物腸道寄生線蟲對反芻動物的感染。
采用本發明的捕食線蟲真菌對土壤中的植物寄生線蟲根結線蟲屬Meloidogyne、異皮線蟲屬Heterodera和莖線蟲屬Ditylenchus destructor線蟲進行防治，一方面可以利用該菌分解土壤中植物殘體的纖維素、幾丁質等，增加土壤中的營養成分含量，促進土壤中有機質轉化；又可以改善土壤肥力，減少化肥、農藥造成的環境污染；該菌能在土壤中長期存活，從而可對土壤中的線蟲實行持續控制并降低防治成本。
采用本發明的捕食線蟲真菌對反芻動物腸道寄生線蟲，主要包括血矛線蟲(Haemonchus)、食道口線蟲(Oesophagostomum)、仰口線蟲(Bunostomum)、奧斯特線蟲(Ostertagia)，夏伯特線蟲(Chabertia)和羊網尾線蟲(Dictyocaulus)進行防治，通過在飼料中添加捕食線蟲真菌制劑，通過動物的消化道排泄到環境中對線蟲起作用；一方面使用方法簡便；另外通過該菌對霉菌的抑制，可使飼料存儲更加安全，減少霉菌對飼料的污染。
本發明的微生物來自耕作土壤，對植物和人畜無害，易生產、耐儲存，易于產業化商品化開發，為農業可持續發展創造條件。
具體實施例方式實施例1將BJNF-1接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上，25℃暗培養3天，可形成大量三維捕食菌網，并開始產生厚垣孢子和少量的分生孢子，氣生菌絲發達，絮狀，菌落淺褐色，6天菌落直徑可達75mm，10天后產生大量厚垣孢子，菌落變成褐色或深褐色。
實施例2將干麥秸稈切成2mm長秸稈段，將麥秸稈段吸水并使飽和后瀝干水；將馬鈴薯用適量水煮熟并使其成糊狀；使干麥秸稈、馬鈴薯、葡萄糖，三者質量比為25∶10∶1，混合、拌均勻；121℃高壓蒸汽滅菌60分鐘，冷卻至室溫。制成麥秸桿馬鈴薯葡萄糖固體培養基。
實施例3將BJNF-1接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基斜面上，25℃培養5天。將試管斜面上的培養菌體全部刮下，接種在灌裝液體馬鈴薯葡萄糖培養基的500ml錐形瓶中，培養基裝量100ml/瓶，置于搖床上25℃振蕩暗培養6天作為固體擴大培養用種子。按質量比固體培養基∶液體種子為50∶1的比例，將擴大培養種子接種到麥秸桿馬鈴薯葡萄糖固體培養基上，充分混勻，28℃暗培養7天得到BJNF-1固體培養物。
實施例4BJNF-1固體培養物在常溫(25℃)下自然風干，用振動篩分離厚垣孢子，用無菌水對厚垣孢子進行梯度稀釋，用計數皿(線蟲計數皿)進行厚垣孢子計數，厚垣孢子含量達106個每克干重。
實施例5BJNF-1固體培養物經過常溫(25℃)下自然風干后，室溫干燥保存六個月、一年、兩年、三年后，分別取一定量的菌體培養物，加入定量無菌水，用振蕩器將厚垣孢子洗下，梯度稀釋后吸取厚垣孢子懸液，涂布于PDA平板上，25℃暗培養3天后，在體視鏡下統計厚垣孢子總數和已經萌發的厚垣孢子數，計算厚垣孢子存活率。，室溫干燥保存六個月后厚垣孢子存活率為98％、一年后厚垣孢子存活率為85％、兩年后厚垣孢子存活率為60％、三年后其厚垣孢子存活率為15％。
權利要求
1.一種微生物，其特征在于它是一種用于植物寄生線蟲和反芻動物腸道寄生線蟲生物防治的捕食線蟲真菌BJNF-1隔指孢(Dactylella sp.)，其保藏登記號為CGMCC No.1051。
2.按權利要求1所述的微生物的培養方法，其特征在于上述捕食線蟲真菌按以下方法分離培養用線蟲作誘餌加到接有土壤樣品的瓊脂培養基上，25～28℃暗培養5～8天后，將捕食菌網挑至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，培養基內含青霉素、鏈霉素和金霉素分別為20μg/ml、40μg/ml、30μg/ml，培養得該捕食線蟲真菌。
3.按權利要求1或2所述的微生物的制備方法，其特征在于該制備方法按以下步驟進行(1).試管培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，將該菌接種在試管培養基上，25～30℃培養3～5天。(2).擴大培養采用液體馬鈴薯葡萄糖培養基，將上述試管中的培養菌接種在灌裝液體培養基的錐形瓶中，于搖床上25～30℃振蕩暗培養5～6天作為固體培養用種子。(3).固體培養采用麥秸桿馬鈴薯葡萄糖固體培養基，按質量比固體培養基∶液體種子為50∶1的比例，將擴大培養種子接種到固體培養基上，混勻，28℃暗培養5～7天得到固體培養物。
4.按權利要求3所述的麥秸桿馬鈴薯葡萄糖固體培養基，其特征在于將干麥秸稈切成2mm長秸稈段，將麥秸稈段吸水并使飽和后瀝干水；將馬鈴薯用適量水煮熟并使其成糊狀；使干麥秸稈、馬鈴薯、葡萄糖，三者質量比為25∶10∶1，混合、拌均勻；121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫。
5.按權利要求3所述的固體培養物，其特征在于經過常溫自然干燥后的固體培養物厚垣孢子含量達106個每克干重。經過常溫自然干燥后的固體培養物經過常溫自然狀態干燥保存3年后，其厚垣孢子存活率為15％。
6.按權利要求1所述的植物寄生線蟲，其特征在于主要包括根結線蟲屬Meloidogyne、異皮線蟲屬Heterodera和莖線蟲屬Ditylenchus destructor線蟲。
7.按權利要求1所述的反芻動物腸道寄生線蟲，其特征在于主要包括血矛線蟲(Haemonchus)、食道口線蟲(Oesophagostomum)、仰口線蟲(Bunostomum)、奧斯特線蟲(Ostertagia)，夏伯特線蟲(Chabertia)和羊網尾線蟲(Dictyocaulus)。
8.按權利要求1所述的微生物的應用，其特征在于將捕食線蟲真菌用于防治植物寄生線蟲和反芻動物腸道寄生線蟲。
全文摘要
一種捕食線蟲真菌菌株及制備方法，本發明提供了一種用于植物寄生線蟲和反芻動物腸道寄生線蟲生物防治的捕食線蟲真菌隔指孢(Dactylella sp.)，其保藏登記號為CGMCC No.1051。利用該捕食線蟲真菌在一定條件下進行培養，并用其制備捕食線蟲真菌制劑。用于防治植物寄生線蟲和控制反芻動物腸道寄生線蟲。利用該菌分解土壤中植物殘體纖維素、幾丁質等，增加土壤營養成分，減少化肥、農藥造成的污染。如果在飼料中添加該制劑，通過該菌對霉菌的抑制，可減少霉菌對存儲飼料的污染。本發明的微生物來自耕作土壤，對植物和人畜無害，易生產、耐儲存，易于產業化商品化開發，為農業可持續發展創造條件。
文檔編號C12N1/14GK1775942SQ20041009081
公開日2006年5月24日 申請日期2004年11月15日 優先權日2004年11月15日
發明者繆作清, 劉杏忠, 李世東, 郭榮君, 張擁華, 孫漫紅 申請人:中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所