專利名稱：生物催化制備(s)－4－氯－3－羥基丁酸酯的菌種和方法
所屬領域本發明涉及一株產高立體選擇性羰基還原酶的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC No.1244，以及利用該出芽短梗霉菌催化不對稱還原反應生產手性鹵代羥基丁酸酯的微生物轉化方法。
背景技術：
4-氯-3-羥基丁酸乙酯(ethyl 4-chloro-3-hydroxybutyrate，CHBE或ECHB)是一種重要的有機中間體，分子中有多功能基團，其手性單一對映異構體體(R)和(S)-CHBE均是非常有前景的重要的手性砌塊，還可經由氯基的置換反應、還原等反應，導入所需的手性藥物中間體。(R)-CHBE可用于合成L-肉堿及1，4-二氫吡啶類β-阻滯劑等，(S)-CHBE可用于很多活性藥物的合成，如他汀類藥物——羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑和4-羥基吡咯烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等。
由于4-氯乙酰乙酸乙酯(ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate/ethyl4-chloroacetoacetate，COBE/ECAA/CAAE)易于合成且價格低廉，以其為底物進行不對稱還原反應獲取手性CHBE是非常經濟有效的制備途徑。而且反應產物(S)-CHBE不易為微生物代謝利用，用微生物活細胞催化方法制備(S)-CHBE非常有利。
目前所知的從COBE還原為手性醇的方法主要有三條路徑1、化學催化劑不對稱還原法所用催化劑包括銠、釕等金屬的價格昂貴，另外的問題是產物立體選擇性不夠高，催化還原反應需要很高的氫氣壓，耗能高；2、酶催化不對稱還原法，用提取純化后的酶(商品酶)如乙醛還原酶等進行不對稱還原，缺點是需要添加昂貴的輔酶；3、微生物催化不對稱還原法，即通過完整的微生物細胞(如面包酵母)的立體選擇性生物催化來實現，但要篩選獲得高立體選擇性的優良微生物菌株比較困難；同時也需要添加輔酶，并不斷供給能量物質，另外還有底物對菌體的毒性及在水溶液中的不穩定性問題。
技術方案本發明的目的是提供一種產高立體選擇性羰基還原酶的微生物新菌株，提供一種新的能有效催化不對稱還原反應生產手性鹵代羥基丁酸酯的方法，并利用該微生物菌株催化COBE不對稱還原，以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度的(S)-CHBE。
本發明的能有效催化不對稱還原反應生產手性鹵代羥基丁酸酯的微生物新菌株，在麥芽汁瓊脂培養基上，菌落初期粘稠，白色，之后轉變為淡綠色，長時間放置后變成黑色皮革狀，菌落邊緣呈明顯的絲狀。從細胞形態上觀察，該菌具有酵母型及菌絲型形態特征。培養初期的幼齡菌絲通常壁薄，透明，分隔，隔距較長。菌絲分枝，菌絲的各處均可出芽形成出芽型的分生孢子，分生孢子形狀為細長的橢圓形；通常二次分生孢子是由初級分生孢子的酵母狀出芽過程中形成的；隨著菌體的老化，菌絲分節斷裂形成分節型的厚垣孢子。據其形態特征和孢子產生的特征，按照Hermanides-Nijhof的分類系統(De Hoog G S andHermanides-Nijhof E J.The black yeasts and allied hyphomycetes.Studies inMycology，1977，15141-177)，初步認為應屬于短梗霉屬的出芽短梗霉，擬命名為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)SW0202。
此菌株是選擇出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW13-02為出發菌株，按常規方法進行紫外線、Co-60誘變處理制得。紫外線照射為15W，距離27cm，時間2～3分鐘；Co-60照射為劑量2～8萬倫琴，時間為20～30分鐘。經處理的菌絲體移種到含0.1％～1.0％COBE的麥芽汁瓊脂培養基上，20～40℃培養3～7天，檢出在含高濃度COBE培養基上生長的菌落。
含COBE的麥芽汁瓊脂培養基由麥芽粉配成10°Be′的麥芽汁加2％的瓊脂制成。
此菌株已于2004年11月17日保存在中國北京中關村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保存號CGMCC No.1244。
本發明催化COBE不對稱還原生產(S)-CHBE的微生物轉化方法，包括以下3個步驟步驟(1)將菌株SW0202，進行常規培養、發酵，發酵液過濾獲得濕菌體；步驟(2)以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為原料，用磷酸鹽緩沖溶液配制成溶液，或直接加入反應體系作為生物催化用底物；
步驟(3)將步驟(1)的發酵液、濕菌體或用載體固定化后加入到步驟(2)的底物溶液中進行轉化反應。
其中步驟(3)中底物溶液濃度為0.1-50％，加濕菌體量為1～40g/g底物，酶反應溫度為20-50℃，酶解時間為1-20小時。
步驟(1)中產酶發酵培養的培養基組成為麥芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸銨0.1～1.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.5％，硫酸鎂0.01～0.1％，pH值為4～9，溫度20-40℃，培養1-5天。
步驟(3)中用載體固定化是指濕菌體用生理鹽水制成菌懸液，以載體包埋制得固定化細胞，載體為海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、幾丁質。
步驟(3)的轉化反應可以采用分批補料轉化法或有機溶劑/水雙相體系轉化法，有機溶劑/水雙相體系轉化法是指培養細胞在含20～60％有機溶劑與水的雙相體系中進行生物轉化，有機溶劑為癸醇、十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷或十二烷。
反應完畢后得到的轉化液，用乙酸乙酯萃取，再脫水，脫色，蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(S)-CHBE。
以下具體描述各個步驟催化用菌株的培養和發酵斜面培養配制含葡萄糖1～10％，麥芽粉浸汁5～30％，瓊脂1～2.5％，pH6～9的培養基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，下同。100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20～40℃培養3～7天。
種子培養和發酵麥芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸銨0.1～1.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.5％，硫酸鎂0.01～0.1％，pH值為4～9的培養基，裝液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃滅菌，20～50分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量5～10％，20～40℃，搖瓶轉速100～250r/min。在上述條件下進行搖瓶發酵試驗，培養1～5天，分別作為種子或發酵培養液。
底物COBE溶液的制備以常規化學合成方法制備得到的商品COBE，檢驗合格后用0.1M，pH6.6磷酸鹽緩沖溶液配制成所需濃度溶液，或直接按需要量加入反應體系，經微孔濾膜無菌過濾后作為生物催化用底物。
微生物轉化反應
用培養后的發酵液獲得的濕菌體作為酶源，以COBE磷酸鹽緩沖溶液為底物，底物濃度為0.1-50％，加濕菌體量為1～40g/g底物，轉化反應溫度為20～50℃，轉化反應時間為1～20小時。在此條件下所得的轉化液進行手性氣相色譜分析(GC)測定表明，已轉化的主要組分為(S)-CHBE。
或者，發酵產得濕菌體，或用生理鹽水制成菌懸液，以海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、幾丁質等載體包埋等方法制得固定化細胞。以此作為酶源進行生物轉化。菌絲體或固定化細胞可反復回用，進行多次生物轉化反應。
分批補料轉化法于發酵培養基中，或菌體懸浮液中，每小時一次加入0.1～2.0％的COBE底物進行轉化，連續6～7次，最后一次加底物后再轉化1小時，產物(S)-CHBE的濃度可以達到1.5～20％，摩爾轉化率70～80％，對映體過量值為97～98％e.e.。
有機溶劑/水雙相體系轉化法培養細胞在含20～60％的癸醇，或十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷、十二烷等有機溶劑與水的雙相體系中，在最佳條件下，定期添加COBE，葡萄糖，有機相中(S)-CHBE的濃度可以達到20～60g/L，mol轉化率80～100％，對映體過量值為97～98％e.e.
底物COBE與產物CHBE的氣相色譜(GC)測定反應結束后，用適量的乙酸乙酯萃取，無水MgSO4脫水，過濾，用GC分析。使用VARIAN3900氣相色譜儀，VARIAN CP WAX 52CB極性色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)，色譜條件為進樣量0.5μl，進樣口250℃，檢測器250℃，流量2.0ml/min，采用程序升溫100℃保留2min，以5℃/min升溫至180℃，保留7min，載氣H2流速30ml/min，尾吹N2流速25ml/min，燃燒氣H2流速30ml/min，空氣流速300ml/min。
產物CHBE對映異構體過量值(e.e.)測定采用手性氣相色譜法(Allan C.Dahland Jorgen gaard Madsen；TetrahedronAsymmetry，1998，9，4395～4417)。樣品處理方法取乙酸乙酯萃取液0.5ml，置于5ml具塞試管中，常溫蒸發去溶劑。然后，滴入2滴乙酸酐和2滴吡啶，置于沸水浴中保持1h，冷后加5ml乙酸乙酯稀釋；手性色譜柱CP-Chirasil Dex CB 0.25mm×25m 0.25um；色譜條件為110℃保留2min，以2℃/min升溫至126℃，保留2min，以5℃/min升溫至160℃，保留2min；進樣量0.2ul；柱流速2.0ml/min；載氣H2流速30ml/min，燃燒氣H2流速30ml/min，空氣流速300ml/min，尾吹N2流速25ml/min；進樣口250℃，檢測器250℃，分流比50∶1。
產物(S)-CHBE的提取轉化反應結束后，將反應液離心(10,000rpm，20min，4℃)，上清液用等體積的乙酸乙酯進行萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，再向其中加入1～5％(w/v)的無水硫酸鎂，攪勻后靜置過夜，除去殘余的水份。將有機相用濾紙過濾，收集有機相。40℃水浴旋轉蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(S)-CHBE。取(S)-CHBE 0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5ml，用GC-MASS進行定性分析，樣品與標準品(Sigma Co.)的離子流圖與質譜圖對照，確定為同一物質。
有益效果本發明微生物轉化法相對于傳統的化學不對稱合成法、面包酵母氧化還原方法或用添加輔酶NADH/NAD+的酶催化不對稱還原方法具有以下優點①生成的(S)-CHBE對映體過量值高，達到97％e.e.以上；②生物催化劑為微生物菌體，可以自行發酵生產，質量穩定，成本低廉，還可制備成固定化細胞，進行多次生物轉化反應；③在水/溶劑雙相體系中，通過供給能量物質，連續補加底物，可以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度；④在整個反應過程中不需要添加輔酶；⑤反應條件溫和，環境友好。
本發明的特點是選育了一株高對映體選擇性菌株——出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC1244)，在單一水相體系中催化不對稱還原COBE生成的產物(S)-CHBE對映體過量值達到97％e.e.。在水/溶劑雙相體系中，通過供給能量物質，連續補加底物，可以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度，更主要的是在整個反應過程中不需要添加輔酶。本發明的轉化工藝可以直接用發酵培養液添加底物COBE進行轉化，也可以用發酵后分離得到的游離菌體或其固定化細胞加底物COBE溶液進行轉化，菌體或其固定化細胞可反復利用多次。
實施例實施例1斜面培養培養基為100ml麥芽汁(含麥芽粉10％)，葡萄糖2g，瓊脂2g，pH6.5，121℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為表1所示的各種微生物菌株，28℃培養2天，作為斜面活化種子。
種子培養和發酵培養基為麥芽糖3％，酵母膏2％，蛋白胨0.5％，(NH4)2SO40.5％，KH2PO40.2％，MgSO4·7H2O 0.07％，pH7.0，裝液量為250ml三角瓶裝液50ml，120℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，160轉/分鐘搖床，28℃培養2天，作為種子或發酵酶液。
發酵酶液中濕菌體量為2.5g/100ml，離心10分鐘(8,000轉/分鐘)收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH6.6)清洗兩次，將菌體轉入25ml含葡萄糖的相同的緩沖液中，使菌體濃度為發酵液中的兩倍，同時加入0.3g底物(COBE)，于30℃，160轉/分鐘下反應。反應結束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4干燥過夜，過濾后進行氣相色譜分析(S)-CHBE含量與對映體過量值。結果如表1表1產羰基還原酶微生物菌株的篩選
實施例2用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC 1244)，按實例1方法發酵培養48小時后，稱取12g濕菌體加于250ml三角瓶裝50ml 0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液中，含底物COBE量為0.5g，分別添加0％，1％，3％，5％，7％，9％的葡萄糖，于30℃，160r/min下進行轉化反應，反應過程中必要時用Na2CO3調節pH使其維持pH6.5～pH6.6，反應4小時后結束，測定其產物量及對映體過量值。反應液離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4干燥，過濾后進行氣相色譜分析(S)-CHBE含量與對映體過量值。結果如表2表2添加不同葡萄糖濃度對轉化的影響
由表2可以看出，添加葡萄糖并不影響產物的對映體過量值，而其產率則隨葡萄糖濃度的增加有所增加。
實施例3用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202(即CGMCC1244)，按實例1方法發酵培養48小時后，發酵酶液中濕菌體量為2.5g/100ml，稱取3～18g濕菌體加于250ml三角瓶裝0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液50ml(測定干菌體濃度約為16～96g/L)，起始底物COBE量為0.5g，于30℃，160轉/分鐘下進行轉化反應。4小時后反應結束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4干燥，過濾后進行氣相色譜分析(S)-CHBE含量與對映體過量值。結果如表3表3不同的菌體量對轉化的影響
實施例4
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實例1方法發酵產酶，按實例2方法進行轉化反應，50ml反應體系中含底物COBE量為1.22g。于反應不同時間取樣，進行氣相色譜分析(S)-CHBE含量并計算轉化產率。結果如表4表4轉化時間曲線
實施例5用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實例1方法發酵產酶，于250ml三角瓶裝0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液50ml，加入12g濕菌體，加入溶解有3.6g COBE的苯二甲酸二丁酯溶液50ml，按實例2方法進行轉化反應，8小時后反應結束，用手性柱進行氣相色譜分析，反應液有機相中(S)-CHBE含量達到58.8g/L，水相中(S)-CHBE含量10.0g/L，相應mol轉化率為94.8％(w/w)，(S)-CHBE對映體過量值為97.1％e.e.。
實施例6用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實例1方法發酵產酶，于250ml三角瓶裝0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液50ml中加入12g濕菌體(測定干菌體濃度約為49.2gDCW/L)，按實例5方法進行轉化反應，轉化4小時，取樣測定反應液有機相中(S)-CHBE含量，反應結束后分離出反應液有機相，再次加入新的有機相底物(含底物COBE量為2％的乙酸正丁酯)與葡萄糖，進行轉化，在同一條件轉化4小時，如此反復轉化重復利用5次。結果如表5所示。
表5發酵濕菌體反復分批轉化結果
實施例7按實例1方法，發酵，得濕菌體100g，加100ml生理鹽水制成菌體懸液，30℃保溫；另稱取20g卡拉膠，加400ml生理鹽水，加熱溶解后，冷卻到55℃保溫。兩者在50℃以下混勻，倒入平皿，冷卻，加KCl溶液，放冰箱中硬化3小時，稱重得約500g固定化細胞。將此固定化細胞，按實例5方法進行轉化。反復分批轉化5次結果見表6。
表6固定化細胞反復分批酶轉化結果
實施例8用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實例1方法發酵產酶，按實例2方法進行轉化，于0.1M，pH6.6磷酸鉀緩沖液100ml中，加濕菌體50g，加入3.65g的COBE，分為一次性加入、兩次加入、三次加入、五次加入和十次加入。每次加入量，分別為3.65g，1.825g，1.217g，0.913g，0.73g，0.365g。同時測定pH，若低于pH6.6，則用1mol/LNa2CO3調至pH6.6，反應結束，進行氣相色譜分析，結果如表7表7分次添加底物的轉化結果
實施例9
用出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，按實例1方法發酵產酶，按實例7方法進行轉化，轉化反應結束后，將反應液離心(10,000轉/分鐘，20分鐘，4℃)得上清液，上清液用等體積的乙酸乙酯進行萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，再向其中加入1～3％(w/v)的無水硫酸鎂，攪拌后靜置過夜，除去殘余的水份。將所得有機相用濾紙過濾，收集有機相。40℃水浴旋轉蒸干溶劑，所得油狀物用減壓蒸餾的方法提純，在4～6mmHg條件下，收集80～84℃的餾分，經GC分析，純度為78.04％。
粗產品用精餾方法或硅膠柱純化(己烷/乙酸乙酯＝3/1，v/v)，得到(S)-CHBE成品(含量98％，光學純度97.8％e.e.)，[α]D25＝-21.40°(c＝7.0，CHCl3)。用GC-MASS進行定性分析，與標樣離子流圖和質譜圖對照，確定樣品與標準品為同一物質(圖譜略)。
權利要求
1.一種高對映體選擇性羰基還原酶的微生物菌株，它是出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)SW0202，即CGMCC No.1244。
2.一種制造手性鹵代羥基丁酸酯的方法，包括以下3個步驟步驟(1)將權利要求1所述的菌株SW0202，進行常規培養、發酵，發酵液過濾獲得濕菌體；步驟(2)以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為原料，用磷酸鹽緩沖溶液配制成溶液，或直接加入反應體系作為生物催化用底物；步驟(3)將(1)的發酵液、濕菌體或用載體固定化后加入到(2)的底物溶液中進行轉化反應。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中底物溶液濃度為0.1-50％，加濕菌體量為1～40g/g底物，酶反應溫度為20-50℃，酶解時間為1-20小時。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中產酶發酵培養的培養基組成為麥芽糖0.5～5.0％，酵母膏1～5％，蛋白胨0.5～2％，硫酸銨0.1～1.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.5％，硫酸鎂0.01～0.1％，pH值為4～9，溫度20-40℃，培養1-5天。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中用載體固定化是指濕菌體用生理鹽水制成菌懸液，以載體包埋制得固定化細胞，載體為海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、幾丁質。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)的轉化反應采用有機溶劑/水雙相體系轉化法培養細胞在含20～60％有機溶劑與水的雙相體系中進行生物轉化，有機溶劑為癸醇、十二醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯、辛烷、壬烷、十一烷或十二烷。
全文摘要
本發明涉及一株產高立體選擇性羰基還原酶的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC No.1244，以及利用該出芽短梗霉菌催化不對稱還原反應生產手性鹵代羥基丁酸酯的微生物轉化方法。該方法在優化條件下發酵產酶，游離酶或其固定化細胞用于4－氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的不對稱還原，生成(S)－4－氯－3－羥基丁酸乙酯(S－CHBE)；在單一水相體系中微生物酶催化不對稱還原COBE生成的(S)－CHBE對映體過量值達到97％e.e.，在水/溶劑雙相體系中，通過供給能量物質，連續補加底物，可以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度，更主要的是在整個反應過程中不需要添加輔酶。
文檔編號C12P7/62GK1778889SQ20041009111
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月18日 優先權日2004年11月18日
發明者孫志浩, 鄭璞, 何軍邀, 鐘萍 申請人:江南大學