由干細胞分化誘導心肌細胞的方法

專利名稱：由干細胞分化誘導心肌細胞的方法
技術領域：
本發明涉及由ES細胞等多能性干細胞選擇性地且高效率地制備心肌細胞的方法，以及通過該方法得到的再生醫療用細胞。
背景技術：
一般來說，心肌細胞在出生前邊進行自律搏動，邊活躍地進行細胞分裂，從剛出生后就喪失了其分裂能力，另外由于不具有未分化的前體細胞，所以因暴露于心肌梗塞或心肌炎等各種壓力下，一旦導致心肌細胞死亡，喪失的心肌細胞不能補充。結果殘存心肌細胞通過代償性肥大雖然能夠維持心功能，但各種壓力仍持續存在，一旦超過其容許范圍，會進一步誘使心肌細胞疲憊、死亡，表現出心肌功能低下(即，心力衰竭)的狀態。
以心力衰竭為首的心臟病已成在日本成為位居第二的死亡原因，其預后也非常差，心臟疾病患者的5年生存率為50％左右。因此，認為治療效果好的心力衰竭治療法的開發與醫療福利的巨大進步以及醫療經濟的改善緊密相關。作為心力衰竭治療藥，以往一直使用使心肌收縮力增加的洋地黃制劑或黃嘌呤制劑等強心劑，已知這些藥劑長期服用，由于心肌能量的過度消耗，會使病情惡化。而最近，雖然使用可通過交感神經系統或腎素-血管緊張素系統的亢進來減輕過度的心臟負荷的β抑制劑和ACE阻礙藥進行治療已經成為主流，這些藥物不過是對癥的治療法，并不是可使受到傷害的心組織本身恢復的藥物。此外，心臟移植是對于重癥心力衰竭的根本治療法，但由于臟器提供者不足以及醫療倫理、患者肉體的、經濟的負擔重等問題，難以將本法作為一般的治療法經常使用。
因此，認為對衰弱的或喪失的心肌細胞進行補充性移植的方法對于心力衰竭的治療非常有用。事實上，在使用動物的實驗中，已知從胎兒取得未成熟的心肌細胞，將它移植到發育成熟心臟組織，移植細胞可作為心肌細胞起到有效作用(參照非專利文獻1)。然而，難以用該方法取得大量心肌細胞，從倫理觀點看，也難以應用到臨床醫療。
因此，由未分化干細胞分化誘導心肌細胞，將該細胞作為移植用細胞而進行利用的方法近年來特別引人注目。目前，由于尚未發現能明確鑒定為可作為在發育成熟心臟組織中能產生心肌細胞的前體細胞或干細胞的細胞集團，為了實施上述方法，考慮使用更為未分化的而且具有多種細胞分化能力的多能性干細胞。
所謂多能性干細胞(pluripotent stem cells)被定義為通過體外培養仍保持未分化狀態，幾乎可進行永久或長期的細胞增殖，呈現正常的核(染色體)型，在適當的條件下，具有分化為三胚層(外胚層，中胚層和內胚層)所有譜系細胞的能力的細胞。現在，作為多能性干細胞，最熟知的有從初期胚分離的胚胎干細胞(embryonic stemcellsES細胞)、從胎兒期的原始生殖細胞分離的胚胎生殖細胞(embryonic germ cellsEG細胞)以及從發育成熟骨髓分離的成人型多能性干細胞(multipotent adult progenitor cellsMAPC)3種。
特別是ES細胞以前就知道通過體外培養可以分化誘導為心肌細胞。初期的研究幾乎都是使用來自小鼠的ES細胞進行的。如果對ES細胞在單一細胞狀態(通過實施酶處理等，細胞之間沒有粘附的各個細胞分散的狀態)下，在沒有白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactorLIF)等分化抑制因子存在下進行懸浮培養，ES細胞彼此粘附、凝集，形成稱為胚狀體(embryoid bodyEB)的類似初期胚的結構體。已知然后，通過以懸浮狀態或粘附狀態培養EB，出現了具有自發搏動性的心肌細胞。
上述那樣制備的來自ES細胞的心肌細胞呈現出與來自胎兒心臟的未成熟心肌細胞非常類似的特性(參照非專利文獻2，3)。此外，實際上，有將來自ES細胞的心肌細胞移植到發育成熟心臟組織的動物實驗例中，幾乎與移植了胎兒心肌的例子沒有變化，也確認表現出極高的有效性(參照專利文獻1，非專利文獻4)。
1995年，Thomson等人首次通過由靈長類建立ES細胞，使用來自多能性干細胞的心肌細胞的心肌再生治療法的實際應用成為可能(參照專利文獻2，非專利文獻5)。接下來他們還成功地實現了從人初期胚分離、建立人ES細胞株(參照非專利文獻6)。另外，Gearhart等人也由人原始生殖細胞建立了hEG細胞株(參照非專利文獻7，專利文獻3)。
Kehat等人(參照非專利文獻8)以及Chunhui等人(參照專利文獻4，非專利文獻9)報告了與小鼠ES細胞同樣，也可以由人ES細胞分化誘導心肌細胞。如果根據這些報告，不用說由人ES細胞分化誘導的心肌細胞具有自發搏動能力，在表達、產生肌球蛋白重鏈/輕鏈和α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白I、心房性利尿肽(artial natriureticpeptide；ANP)等心肌特異性蛋白質、GATA-4或Nkx2.5、MEF-2c等心肌特異性轉錄因子的同時，微細解剖學的觀察以及電生理學的解析也表明保持著胎兒期的未成熟心肌細胞的特性，預期可用于再生醫療。
另外，作為將來自多能性干細胞的心肌細胞用于細胞移植治療或其它目的時的重要問題，例如使用以往方法由ES細胞或EG細胞形成的EB除了發育為心肌細胞以外，還可發育為包括血細胞、或血管細胞、神經細胞、腸細胞、骨/軟骨細胞等在內的其它種類的細胞。另外，在這些分化的細胞中，心肌細胞所占比例不太高，只不過為整體的5～20％左右。
作為從混有其它種類細胞的細胞溶液中有選擇性地只挑選心肌細胞的方法，例如，通過對ES細胞的基因進行人為修飾，賦予耐藥性或異地表達(ectopic expression)能力，回收心肌細胞或具有作為其前體細胞特性的細胞的方法。例如，Field以及共同研究者等構建了通過將在α型肌球蛋白重鏈啟動子調控下，可表達新霉素(G418)耐性基因的基因序列組導入小鼠ES細胞，只在該ES細胞向心肌細胞分化，并伴隨分化進行α型肌球蛋白重鏈基因表達時，可在添加了G418的培養基中存活的體系(參照專利文獻1，非專利文獻4)。通過該方法作為G418耐性細胞挑選的細胞以99％以上的概率確認是心肌細胞。然而，使用該方法，雖然心肌細胞的純度非常高，但最終得到的心肌細胞數不過為全細胞數的百分之幾程度，不容易獲得移植治療所必需的心肌細胞。
最近，Chunhui等人報告了通過用5-氮雜胞(嘧啶核)苷對人ES細胞進行處理，EB中的肌鈣蛋白I陽性(心肌)細胞由15％增加到44％(參照非專利文獻9)，在該方法中，心肌細胞所占比例沒有超過EB中的50％。另外，脫甲基化劑5-氮雜胞(嘧啶核)苷是通過使與DNA結合的甲基脫掉，使基因的表達狀態變化的藥劑，由于藥劑直接作用于染色體，所以不合適作為制備移植用細胞的藥劑。
另外，作為使由ES細胞更高效率地產生心肌細胞的方法，已知例如，在小鼠ES細胞中添加視黃酸(參照非專利文獻10)或抗壞血酸(參照非專利文獻11)、TGFβ、BMP-2(參照非專利文獻12)，PDGF(參照非專利文獻13)、Dynorphin B(參照非專利文獻14)、或使細胞內的活性氧類(reactive oxigen speciesROS)(參照非專利文獻15)和Ca2+(參照非專利文獻16)增加的處理可起到促進心肌細胞的分化誘導作用。然而，無論使用那一種方法，心肌細胞特異的或有選擇性的分化誘導都尚未成功。
分泌性蛋白質頭蛋白(Noggin)和索蛋白(Chordin)當初作為非洲爪蟾胚中的神經誘導因子被鑒定(參照非專利文獻17，18，專利文獻5～8)。已報道通過其后的研究，頭蛋白和索蛋白通過與具有抑制神經細胞的發育、分化效果的BMP(Bone Morphogenic Protein；骨形成因子)家族分子結合，阻斷其信號傳導，表現出神經誘導效果(參照非專利文獻19～21)。實際上，即使在使用小鼠ES細胞的實驗中，也表明通過對頭蛋白基因或索蛋白基因進行恒定表達，可誘導向神經細胞的分化(參照非專利文獻22)。
另外，據報道如果將人ES細胞用添加頭蛋白的培養基進行培養，通過抑制ES細胞內因性產生的BMP-2的作用，ES細胞向胚體外內胚層細胞的分化被抑制，在ES細胞保持未分化狀態的同時，通過繼續在神經分化培養條件下進行培養，可促進向神經細胞的分化誘導(參照專利文獻9)。
另外，據報道在使用雞胚(參照非專利文獻23)，非洲爪蟾胚(參照非專利文獻24)或小鼠胚胎癌細胞(參照非專利文獻25)的以往的解析中，對于心肌細胞的發育和/或分化，BMP家族分子起著促進作用，如果通過頭蛋白刺激阻礙其作用，心肌細胞的發育和/或分化也就被抑制了。
因此，通過利用頭蛋白、或索蛋白或其它BMP信號抑制因子，促進心肌細胞發育、分化的嘗試到目前為止完全沒有。
專利文獻1美國專利第6015671號說明書專利文獻2美國專利第5843780號說明書專利文獻3美國專利第6090622號說明書專利文獻4國際專利公開第03/06950號小冊子專利文獻5國際專利公開第94/05791號小冊子專利文獻6美國專利第5,679,783號說明書專利文獻7美國專利第5,846,770號說明書專利文獻8美國專利第5,986,056號說明書專利文獻9國際專利公開第01/98463號小冊子非專利文獻1
Soonpaa等人，Science，26498，199非專利文獻2
Maltsev等人，Mech.Dev.，4441，199非專利文獻3
Maltsev等人，Circ.Res.，75233，199非專利文獻4
Klug等人，J.Clin.Invest.，98216，199非專利文獻5
Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927844，199非專利文獻6
Thomson等人，Science，282114，1998非專利文獻7
Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9513726，1998非專利文獻8
Kehat等人，J.Clin.Invest.，108407，200非專利文獻9
Chunhui等人，Circ.Res.，91508，200非專利文獻10
Wobus等人，J.Mol.Cell.Cardiol.，291525，199非專利文獻11
Takahashi等人，Circulation，1071912，200非專利文獻12
Behfar等人，FASEB J.，161558，200非專利文獻13
Sachinidis等人，Cardiovasc.Res.，58278，200非專利文獻14
Ventura等人，Circ.Res.，92623，200非專利文獻15
Sauer等人，FEBS Lett.，476218，2000非專利文獻16
Li等人，J.Cell Biol.，158103，200非專利文獻17
Smith & Harland，Cell，70829，199非專利文獻18
Sasai等人，Cell，79779，199非專利文獻19
Re′em-Kalma等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9212141，199非專利文獻20
Zimmerman等人，Cell，86599，199非專利文獻21
Piccolo等人，Cell，86589，199非專利文獻22
Gratsch & O′Shea，Dev.Biol.，24583，200非專利文獻23
Schultheiss等人，Genes Dev.，11451，199非專利文獻24
Sparrow等人，Mech.Dev.，71151，1998非專利文獻25
Monzen等人，Mol.Cell.Biol.，197096，1999發明內容發明要解決的課題本發明以提供將未分化的干細胞高效率而且有選擇性地分化誘導為心肌細胞的方法，通過該方法得到的心肌細胞和將該細胞進行以心臟病為靶的細胞移植、注入以及在其它治療中使用的方法等作為課題。
用于解決課題的手段本發明主要涉及到以下內容。
(1)由干細胞分化誘導心肌細胞的方法，其特征是在抑制BMP信號傳導物質存在下，對干細胞進行分化誘導的培養。
(2)上述(1)所述的方法，其中，用于分化誘導的干細胞的培養包括進行懸浮凝集培養、使胚狀體形成的工序。
(3)上述(1)所述的方法，其中，包括用于分化誘導的干細胞的培養與飼養細胞進行共培養的工序。
(4)上述(1)所述的方法，其中，包括用于分化誘導的干細胞的培養在培養容器上進行平面培養的工序。
(5)上述(1)～(4)任一項所述的方法，其中，只在分化誘導期的最初數日內添加抑制BMP信號傳導的物質。
(6)上述(1)～(4)任一項所述的方法，其中，包括預先用抑制BMP信號傳導的物質對分化誘導期前的干細胞進行處理的工序。
(7)上述(1)～(4)任一項所述的方法，其中，包括預先用抑制BMP信號傳導的物質對分化誘導期前的干細胞進行處理的工序，而且只在分化誘導期的最初數日內添加抑制BMP信號傳導的物質。
(8)上述(1)～(7)任一項所述的方法，其中，抑制BMP信號傳導的物質是BMP拮抗劑。
(9)上述(8)所述的方法，其中，BMP拮抗劑是從頭蛋白、索蛋白、胎球蛋白、抑濾泡素、sclerostin、DAN、Cerberus、gremlin、和Dante，以及它們的相關蛋白質中選出的1個或多個。
(10)上述(1)～(9)任一項所述的方法，其中，干細胞是具有在試管內培養下可向心肌細胞分化能力的來自哺乳動物的細胞。
(11)上述(10)所述的方法，其中，具有可向心肌細胞分化能力的來自哺乳動物的細胞是多能性干細胞或來自該細胞的細胞。
(12)上述(11)所述的方法，其中，多能性干細胞是胚胎干細胞、具有類似于胚胎干細胞形態的細胞、胚胎生殖細胞或成人型多能性干細胞。
(13)上述(12)所述的方法，其中，多能性干細胞是胚胎干細胞。
(14)上述(1)～(13)所述的方法，其中，干細胞來自人。
(15)包括上述(1)～(14)任一項所述的方法的心肌細胞制造方法。
(16)通過上述(1)～(14)任一項所述的方法得到的心肌細胞。
(17)心臟病的治療方法，是在起因于心肌細胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療方法中，將上述(16)所述的心肌細胞投給(移植)到心肌細胞衰弱、功能停止或死亡的部位或其周邊。
(18)篩選方法，是在起因于心肌細胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療方法中，使測試物質與上述(16)所述的心肌細胞接觸，對該細胞向心肌細胞的分化效率或其細胞功能的質的或量的變化進行測定。
(19)起因于心肌細胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療用的醫藥組合物或支持體，作為有效成分含有上述(16)所述的心肌細胞。
本發明人等就使用多能性干細胞，特別是最頻繁使用的ES細胞作為制備心肌細胞的干細胞源，向心肌細胞或其前體細胞的分化誘導條件不斷進行了各種研究，結果發現通過在培養時的某一期間，向培養基中添加抑制骨形成因子(Bone Morphogenic Protein；BMP)信號傳導的物質，被證實為具有搏動能力的心肌細胞的細胞比以往方法更有選擇性、而且更有效發育，另外還發現如添加過量的BMP，通過抑制BMP信號傳導的物質處理產生的心肌分化誘導效果明顯降低，結果表明BMP信號的抑制促進誘導多能性干細胞向心肌細胞的分化，直至完成本發明。
在本發明中，所謂抑制BMP信號傳導的物質指的是具有阻礙或阻斷BMP的信號傳導作用的物質，例如，BMP拮抗劑或抗BMP家族分子的特異的中和抗體、可溶化型(細胞膜非結合型)BMP受體分子等。另外的例子，如抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產物的表達、或抑制或停止規定BMP信號傳導途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達的基因表達載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等。
通過本發明的方法由多能性干細胞制備的搏動性細胞是具有“心肌細胞”特征的細胞，可以確認例如GATA-4，TEF-1，Tbx-5，MEF2和MLC-2v等心肌特異的轉錄因子基因表達以及作為心肌特異標志的肌節/肌球蛋白、肌鈣蛋白I、α-輔肌動蛋白、ANP等蛋白表達。
另外，在本發明中，作為多能性干細胞的分化誘導法，不僅一般常用的懸浮凝集培養法，而且懸滴(hanging drop)培養法以及使用飼養細胞的共培養法中的任一種方法也都可得到同樣的效果。
另外，在研究抑制BMP信號傳導的物質的添加時期和期間時，使多能性干細胞分散為由單一細胞或少數細胞構成的細胞塊，通過懸浮凝集培養或與飼養細胞的共培養等方法誘導分化時，如果預先將多能性干細胞用BMP拮抗劑進行預處理、或只是在剛開始進行分化誘導培養后數日間添加、或將兩者組合更有效。而當在與懸浮細胞或飼養細胞共培養等實施期間使BMP拮抗劑恒定存在時，顯示由多能性干細胞向心肌細胞的分化誘導效率非常低下。
即，本發明涉及以在抑制BMP信號傳導的物質的短暫刺激下進行培養為特征的將多能性干細胞分化誘導為心肌細胞的方法和制備心肌細胞的方法。
本發明中所謂具有心肌分化能力的干細胞指的是在試管內培養下具有可向心肌細胞分化能力的細胞，例如，多能性干細胞、間充質干細胞、CMG細胞和SPoC細胞等。而所謂多能性干細胞指的是通過試管內培養仍保持未分化狀態，幾乎可進行持續不斷的或長期間的細胞增殖，呈現正常的核(染色體)型，在適當條件下具有分化為三胚層(外胚層、中胚層和內胚層)所有譜系細胞的能力的細胞，例如，ES細胞、ES類似細胞、EG細胞和MAPC等。
在另外的實施方式中，本發明涉及到通過分化誘導多能性干細胞制備的表現出心肌細胞的形態學、生理學和/或免疫學上特征的細胞。對生理學和/或免疫學的特征雖然沒有特別限定，但利用本發明方法制備的細胞能表達對于被識別為心肌細胞的心肌細胞特異的1個或1個以上的標志即可。
本發明涉及到為了鑒定可促進心肌細胞發育以及分化誘導、再生、存活等的新的因子或可能的化學治療劑，使用通過本發明方法制備的細胞的篩選方法。
本發明還涉及到用于將多能性干細胞分化誘導為具有心肌前體細胞或心肌細胞形態學、生理學和/或免疫學特征的細胞的試劑盒。這樣的試劑盒對于實施本發明的方法有用。
在另外的實施方式中，本發明涉及到以使用本發明方法制備的細胞為特征的治療處于心臟病狀態的心臟的方法以及以用本發明方法制備的細胞作為有效成分的心臟病治療藥。
本發明這些優點以及其它優點和特征在以下適合的實施方式的詳細說明中進行了充分描述。
另外，在本發明的實施中，有關使用多能性干細胞的細胞培養和發育、細胞生物學實驗的一般方法，實施者可參照該領域的標準參考書籍。其中包括Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman等人編，Academic Press，1993)；Embryonic Stem CellDifferentiation in vitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.，225900，1993)；Manipulating the Mouse EmbryoAlaboratory manual(Hogan等人編，Cold Spring Harbor Laborayory Press，1994)；EmbryonicStem Cells(Turksen編，Humana Press，2002)。在本說明書中可參照的用于細胞培養、發育和細胞生物學實驗的試劑和試劑盒類可以從Invitrogen/GIBCO公司或Sigma公司等銷售商買到。
發明的效果通過使用本發明方法，可以由干細胞有效且有選擇性地生產心肌前體細胞和心肌細胞。這樣制備的心肌(前體)細胞可在對心臟病治療有效的藥劑的探索、開發中利用的同時，還有可能適用于對嚴重心臟病的心肌移植治療。


圖1A在使用懸浮培養法的ES細胞(EB3)的心肌分化誘導系中，頭蛋白(500ng/mL)的添加對搏動性EB出現的影響。
圖1B在使用懸滴培養法的ES細胞(EB3)的心肌分化誘導系中，頭蛋白(500ng/mL)的添加對搏動性EB出現的影響。
圖2頭蛋白添加濃度不同對搏動性EB出現率的影響。算出由ES細胞(EB3細胞和R1細胞)形成EB，懸浮培養后第10日的搏動性EB的出現率。
圖3頭蛋白添加對心肌特異標志基因表達的影響。在懸浮培養后第0、5、10、15日后回收EB(來自EB3細胞)，研究各基因的表達。TEF-1轉錄增強因子-1(transcription enhancer factor-1)，MEF-2c肌肉增強因子-2c(muscle enhancement factor-2c)，α-MHCα-肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain)，MLC-2v肌球蛋白輕鏈-2v(myosin light chain-2v)，GAPDH甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceral dehyde-3-phosphate dehydrogenase)圖4對從懸浮培養后第10日的頭蛋白(+)組EB(來自EB3細胞)分離、回收的心肌細胞進行免疫染色的結果。a肌原纖維節和肌球蛋白，b肌鈣蛋白I，cα-輔肌動蛋白，dANP圖5對懸浮培養后第10日的頭蛋白(+)組和頭蛋白(-)組EB(來自EB3細胞)內的心肌細胞進行免疫染色的結果。a、b肌原纖維節和肌球蛋白，c、d肌鈣蛋白I，e、fα-輔肌動蛋白，g、hANP圖6BMP對頭蛋白的心肌分化誘導作用的阻礙效果。
圖7A頭蛋白處理在使用飼養細胞的心肌分化誘導系中的效果。將ES細胞(R1)接種在ST2飼養細胞上，研究其心肌分化。在接種第8日使用抗肌原纖維節和肌球蛋白抗體(MF20)的染色照片。n＞5。
※對頭蛋白(-)組p＜0.0圖7B頭蛋白處理在使用飼養細胞的心肌分化誘導系中的效果。將ES細胞(R1)接種到ST2飼養細胞上，研究其心肌分化。在接種第8日的MF20陽性集落的出現率。n＞5。※對頭蛋白(-)組p＜0.0圖7C頭蛋白處理在使用飼養細胞的心肌分化誘導系中的效果。將ES細胞(R1)接種到ST2飼養細胞上，研究其心肌分化。接種第12日的搏動性集落的出現率。n＞5。※對頭蛋白(-)組p＜0.0圖8在使用懸滴培養法的ES細胞(R1)的心肌分化誘導系中，索蛋白(500ng/mL)的添加對搏動性EB出現的影響與添加頭蛋白(500ng/mL)時比較的結果。培養天數為開始懸滴培養之后的天數。n＝8。※對未添加組(-)，p＜0.0圖9在使用懸浮培養法的ES細胞(R1)的心肌分化誘導系中，索蛋白(500ng/mL)的添加對搏動性EB出現的影響。C添加索蛋白，N添加頭蛋白(150ng/mL)，(-)沒有添加。將EB形成前的處理與EB形成后的處理用“預處理”→“后處理”表示形式表示。
圖10在使用懸浮培養法的ES細胞(R1)的心肌分化誘導系中，各種BMP拮抗蛋白質(各150ng/mL)的添加對搏動性EB出現的影響。
具體實施例方式
本內容中，所謂“心肌細胞”包括將來具有可成為功能性心肌細胞的能力的心肌前體細胞以及胎兒型心肌細胞、發育成熟型心肌細胞的所有分化階段的細胞，定義為通過以下所述的至少1個、最好是多個方法能夠確認至少1個、最好是多個標志或基準的細胞。
心肌細胞中特異的各種標志的表達可通過以往的生物化學或免疫化學的手法進行檢測。該方法雖然沒有特別限定，但最好是使用免疫組織化學的染色法或免疫電泳法那樣的免疫化學的手法。在這些方法中，可以使用與心肌前體細胞或心肌細胞結合的標志特異的多克隆抗體或單克隆抗體。以各個特異的標志作為靶的抗體已經有商品銷售，容易使用。心肌前體細胞或心肌細胞中特異的標志，例如肌球蛋白重鏈/輕鏈或α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c等。
或者，心肌前體細胞或心肌細胞特異的標志的表達通過稱之為利用逆轉錄酶的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)或雜交分析的用于對編碼任意標志蛋白質的mRNA進行擴增、檢測、解析的以往經常使用的分子生物學方法可以確認，但對其手法沒有特別限制。編碼心肌前體細胞或心肌細胞中特異的標志(例如，肌球蛋白重鏈/輕鏈和α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c)蛋白質的核酸序列已知，可利用基因庫(GenBank)那樣的公共數據庫，容易決定作為引物或探針使用的必需的特異標志的序列。
另外，為了確認多能性細胞向心肌細胞的分化，也可進一步使用生理學的基準。即，來自多能性細胞的細胞具有自立的搏動性以及表達各種離子通道，能夠對電生理刺激反應等都成為其有用的指標。
作為本發明使用的多能性干細胞，可舉出已廣泛作為培養細胞使用的來自小鼠、猴、人等哺乳動物的ES細胞、EG細胞、MAPC等。作為來自小鼠ES細胞的具體例子，可舉出EB3細胞、E14細胞、D3細胞、CCE細胞、R1細胞、129SV細胞、J1細胞等。另外有關ES細胞、EG細胞、MAPC的制備、傳代、保存法已經確立了標準的程序，實施者通過參照前面列舉的參考書籍以及很多參考文獻(Matsui等人，Cell，70841，1992；Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9513726，1998；美國專利第6090622號；Jiang等人，Nature，41841，2002；國際專利公開01/11011)，能夠容易使用這些多能性干細胞。
另外，本發明中可以使用的細胞不限于上述3種，包括來自哺乳動物的胚或胎兒、臍帶血、或發育成熟臟器或骨髓等發育成熟組織、血液等的所有多能性干細胞。作為具體例子，可舉出毛根鞘細胞或表皮細胞經5-氮雜胞(嘧啶核)苷等藥劑處理后得到的干細胞(Sharda& Zahner，國際專利公開第02/051980號)或單核球細胞經CR3/43抗體處理后得到的干細胞(Abuljadayel，Curr.Med.Res.Opinion，19355，2003)，以及來自發育成熟內耳細胞的干細胞(Li等人，NatureMed.，Advance online publication)等具有與ES細胞類似形態的干細胞。此時所謂的與ES細胞類似的形態可以根據ES細胞中具有特異的細胞生物學性質來定義，例如ES細胞中特異的表面(抗原)標志的存在、或ES細胞特異基因的表達、或具有畸胎瘤(teratoma)形成能力或具有嵌合小鼠形成能力。
另外，即使是不具有與ES細胞類似形態的細胞或不是多能性干細胞的細胞，只要是具有至少在試管內培養下可分化為具有心肌細胞那樣形態的細胞性質的細胞，就可以使用本發明所述的方法。作為這樣細胞的例子，如來自于骨髓細胞的骨髓間充質干細胞(Bruder等人，美國專利第5736396號；Pittenger等人，Science，284143，1999)和CMG細胞(Makino等人，J.Clin.Invest.，103697，1999；國際專利公開第01/048151號)，來自肌肉組織的Spoc細胞(國際專利公開第03/035382號)。
在本發明中，作為由多能性干細胞制備心肌細胞的培養法，只要是適合心肌細胞分化誘導的方法，可以使用任一種方法，例如使用ES細胞時，可舉出懸浮凝集培養法、懸滴(hanging drop)培養法、與支持細胞的共培養法、旋轉培養法、軟瓊脂培養法、微載體培養法等。作為具體方法的例子，例如使用懸浮凝集培養法時，將成為單一細胞狀態(通過實施酶消化等，細胞之間沒有粘連的各個細胞在液相中分散的狀態)的ES細胞優選按照濃度為10細胞/mL～1×107細胞/mL，更優選100細胞/mL～1×106細胞/mL細胞密度那樣懸浮于培養基中，接種到培養板后，4～30日，優選6～15日，于37℃、通5％的二氧化碳的CO2條件下進行培養的方法。
而作為另外的實施方式，當使用與支持細胞的共培養法時，作為支持細胞雖然沒有特別限定，優選具有間充質細胞性質的細胞，更優選ST2細胞、OP9細胞、PA6細胞等具有骨髓基質細胞那樣形態的細胞。通過對這些支持細胞進行高密度培養、絲裂霉素C處理、或放射線照射等方法做成飼養層，然后以懸浮的單一細胞狀態將ES細胞接種于培養基，使ES細胞達到1細胞/mL～1×106細胞/mL、優選100細胞/mL～1×105細胞/mL、更優選1×103細胞/mL～1×104細胞/mL細胞密度后，于37℃、通5％的二氧化碳的CO2條件下培養4～30日、優選6～15日。
在本發明中，所謂抑制BMP信號傳導的物質指的是具有阻礙或阻斷BMP的信號傳導的作用的物質，例如，BMP拮抗劑或抗BMP家族分子的特異的中和抗體、可溶化型(非細胞膜結合型)BMP受體分子等。作為另外的例子，如抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產物的表達、或抑制或停止規定BMP信號傳導途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達的基因表達載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等。
而所謂BMP拮抗劑被定義為與BMP家族分子(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7等)結合、阻礙或抑制BMP分子與細胞表面上的BMP受體結合的物質、或通過結合BMP受體引起BMP信號傳導的抑制或阻斷的物質。作為本發明中優選的BMP拮抗劑，例如，可舉出頭蛋白和索蛋白等，另外，如與該蛋白質在氨基酸序列上具有80％以上、更優選90％以上同源性，而且具有BMP拮抗劑活性的頭蛋白相關蛋白質或索蛋白相關蛋白質，另外通過由與編碼頭蛋白或索蛋白的堿基在嚴格條件(例如，2xSSC)進行雜交的堿基編碼的頭蛋白相關蛋白質或索蛋白相關蛋白質也同樣包括在內。
本發明以在短暫抑制BMP信號的物質刺激下對多能性干細胞進行培養為特征，作為該刺激方法雖然沒有特別限定，但優選如在培養基中添加純化重組蛋白質的方法。此外，只要是表現出與將抑制BMP信號的物質作為純化重組蛋白質添加到培養基中的方法同樣效果的方法，可以使用任一種方法。例如，添加從生體組織提取、純化的頭蛋白等BMP拮抗劑的方法；將頭蛋白等BMP拮抗劑的基因表達載體導入多能性干細胞自身的方法；將頭蛋白等BMP拮抗劑基因表達載體導入支持細胞，該導入細胞作為共培養細胞使用的方法；或使用該導入細胞的培養上清等細胞產生物的方法等，任一種在培養基中添加了BMP拮抗劑的實施方式都包括本發明的方法中。
在本發明的實施中，使用的抑制BMP信號的物質的蛋白質和基因優選是來自與多能性干細胞來自種類同種的動物的蛋白質和基因，例如，用小鼠多能性干細胞實施本發明時，將小鼠的頭蛋白cDNA與免疫球蛋白恒定(Fc)區cDNA連接的融合基因導入小鼠細胞，使其表達制備的純化重組蛋白質(Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera；R&Dsystems公司，Genzyme Technology公司)在市場已有銷售，可以很容易用作為來自小鼠的頭蛋白。另外，也可以使用來自異種動物的頭蛋白，將人的頭蛋白cDNA導入大腸桿菌，使其表達制備的純化重組蛋白質(PeproTech公司銷售)作為代用。另外也可以使用來自豬、羊、馬、或鳥類(例如，雞等)、或兩棲類(例如，非洲爪蟾等)的頭蛋白。對于索蛋白和其它的BMP拮抗劑也同樣可以使用類似的蛋白質。另外，編碼這些因子的基因的堿基序列可利用美國National Centerfor Biotechnology(NCBI)等公共的DNA數據庫，只要是本領域技術人員，就可以獲取、使用該基因的cDNA。例如，頭蛋白和索蛋白基因已經通過人或小鼠鑒定，人的頭蛋白、小鼠的頭蛋白、人的索蛋白、以及小鼠的索蛋白的堿基序列已經分別以access登記號NM#005450、NM#008711、NM#073411、NM#009893記錄在NCBI的數據庫。
作為本發明的BMP拮抗劑，只要是與BMP家族分子(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7等)結合，阻礙或抑制BMP分子與細胞表面上的BMP受體結合的物質、或通過結合BMP受體，引起BMP信號傳導的抑制或阻斷的物質就可以，作為典型例子，如頭蛋白(Re′em-Kalma等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9212141，1995；Zimmerman等人，Cell，86599，1996)、以及索蛋白(Piccolo等人，Cell，86589，1996；De Robertis等人，美國專利第5679783號；LaVallie等人，美國專利第5846770號；Lavallie等人，美國專利第5986056號)。作為其它的BMP拮抗劑的具體例子，已知有抑濾泡素(follistatin)、胎球蛋白(fetuin)、sclerostin、以及屬于DAN/Serberus家族的分子等，作為該分子已知有DAN、cerberus、gremlin、Dante等(Balemans& Hul，Dev.Biol.，250231，2002)。或者，天然存在的BMP拮抗劑的合成或重組類似物也可用在實施本方法上。
另外在發明的實施中，作為處理多能性干細胞的方法，不限于只使用頭蛋白等BMP拮抗劑的方法，只要是產生與BMP拮抗劑同樣的效果，即引起BMP信號傳導抑制的方法都可以使用。作為引起BMP信號傳導抑制的方法的具體例子，可舉出使用抗BMP家族分子的特異的中和抗體的方法、使用可溶化型(非細胞膜結合型)BMP受體分子的方法等。其它的例子，可舉出將抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產物的表達、或抑制或停止規定BMP信號傳導途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達的基因表達載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等導入細胞內的方法。
在本發明的實施中，對多能性干細胞使用抑制BMP信號傳導的物質(例如，頭蛋白、索蛋白等的BMP拮抗劑)時，使這些因子作用的期間可以分為2個時期。即，使多能性干細胞分散為由單一細胞或少數細胞構成的細胞塊，進行懸浮凝集培養或與支持細胞共培養等時刻的前和后，以下，將之前的時期稱為預處理期，后面的時期稱為分化誘導期。
對于預處理期的多能性干細胞，使抑制BMP信號傳導的物質作用的期間優選是分化誘導期開始的前1～2日，優選前3日以上。
另外，在預處理期，為了將ES細胞維持在未分化狀態，最好是根據該ES細胞的動物種類，在通常使用的條件下進行培養。即，對于小鼠ES細胞，最好是在培養基中添加100～10000U/mL，優選500～2000U/mL濃度的白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factorLIF)。
作為使抑制BMP的信號傳導的物質作用的期間，不需要整個培養期間都使該物質存在，例如，作為抑制BMP的信號傳導的物質使用頭蛋白或索蛋白等的BMP拮抗劑時，在BMP拮抗劑以具有活性狀態存在的培養基中的培養優選在分化誘導期最初的5日以內，更優選3日以內。但使抑制BMP的信號傳導的物質作用的期間可以根據使用的細胞來自的動物種類、使用的細胞株、使用的分化誘導以及使用的抑制BMP的信號傳導的物質等條件不同來改變最適合的天數。
在本發明的實施中，作為抑制BMP信號的物質使用BMP拮抗劑(例如，頭蛋白、索蛋白等)時，在將舊的培養基在無菌下除去后，最好用含有1ng/mL～2μg/ml，優選5ng/mL～1000ng/mL，更優選10ng/mL～500ng/mL濃度的頭蛋白、或用索蛋白的培養基取代，再繼續培養數日。使用其它的抑制BMP信號的物質時，可以根據物質種類來變更為最適合的濃度后使用。
接下來，運用上述方法從以ES細胞為首的多能性干細胞分化誘導的心肌細胞通過使用公知方法中的細胞回收、分離、純化法，可以有效、且大量獲得高純度的心肌細胞。以下將這樣得到的心肌細胞稱之為根據本發明制備的心肌細胞。
心肌細胞的純化方法可以使用任一種已公知的細胞分離純化方法，作為具體例子，可舉出流式細胞儀、磁珠、淘篩法等根據抗原-抗體反應的方法(Monoclonal Antibodiesprinciples and practice，Third Edition(Acad.Press，1993)；Antibody EngineeringAPractical Approach(IRL Press at Oxford University Press，1996)以及通過使用蔗糖、Percoll等載體的密度梯度離心的細胞分級法。而作為其它的心肌細胞篩選法，可舉出在起始的ES細胞等多能性干細胞的基因上預先加上人為的修飾，通過賦予耐藥性或異地性蛋白質的表達能力，回收具有作為心肌細胞形態的細胞的方法。例如，Field和共同研究者通過將在α型肌球蛋白重鏈啟動子的調控下可表達新霉素(G418)耐性基因的基因序列組導入小鼠ES細胞，構建了該ES細胞在添加了G418培養基中可存活的體系，在該體系中ES細胞可分化為心肌細胞、同時僅伴隨著分化表達α型肌球蛋白重鏈基因，通過該方法以99％以上概率確認選作G418耐性細胞的細胞是心肌細胞(美國專利第6015671號；J.Clin.Invest.，98216，1996)。
通過本發明制備的心肌細胞可用于各種生理活性物質(例如，藥物)和功能未知的新的基因產物等藥理評價和活性評價。例如，可以用于與由ES細胞等多能性干細胞向心肌細胞的分化調控有關的物質或藥劑的篩選、或與心肌細胞的功能調解有關的物質或藥劑的篩選、以及對心肌細胞有毒性或傷害性的物質或藥劑的篩選。特別是目前現狀幾乎不存在人心肌細胞的篩選法，根據本發明制備的心肌細胞可成為用于實施該篩選法的有用的細胞源。在另外一種方式中，含有根據本發明制備的心肌細胞的評價試劑盒也可用于上述篩選。
作為供篩選的測試物質，只要是可添加到培養系的物質無論什么種類都可以，例如，低分子化合物、高分子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、肽、基因、病毒、細胞、細胞培養液、微生物培養液等。作為將基因有效地導入培養系的方法，可舉出使用逆轉錄病毒、腺病毒等病毒載體添加到培養系的方法、或封入到脂質體等人工的構造物后添加到培養系的方法等。
可以通過測定由ES細胞等多能性干細胞向心肌細胞的分化誘導效率以及心肌細胞功能的質的或量的變化進行測試物質的評價。例如，測試物質的心肌分化誘導效率通過對使用本發明所述方法培養的多能性干細胞，在培養開始后第5～15日，優選第7～12日時候，利用生物化學的或免疫化學的手法對在心肌細胞中特異的各種標志的表達進行檢測而測定。作為生物化學的或免疫化學的手法沒有特別限定，最好是使用象免疫組織化學的染色法或免疫電泳動法那樣的免疫化學的手法。在這些方法中，可以使用結合心肌細胞的標志特異的多克隆抗體或單克隆抗體。以各個特異的標志為靶的抗體有銷售商品，容易使用。心肌細胞中特異的標志，例如肌球蛋白重鏈/輕鏈或α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c等。
另外，作為評價測試物質的指標的心肌細胞功能，可舉出心肌細胞的存活性作為一例。具體來說，將通過本發明所述的方法制備的心肌細胞以合適的細胞密度接種到培養板，用不含有血清的培養基培養時，可以誘導細胞死亡(凋亡)，而此時向培養基中添加適當量的測試物質，可以測定心肌細胞的存活率或死亡率。作為心肌細胞的存活率或死亡率的測定方法，可以使用以臺盼藍等色素摻入作為指標通過肉眼觀察的方法，也可以使用以脫氫酶的活性(還原活性)作為指標的方法，以及以凋亡細胞特異的半胱天冬酶活性或膜聯蛋白V的表達作為指標的方法。利用該機制的試劑盒，作為Sigma公司和Clonetech公司、Promega公司等許多丁家的利用該機制的試劑盒都有銷售，可輕易使用。
通過這樣的篩選方法得到的物質或藥劑由于具有心肌細胞的分化誘導作用和功能調解作用，可作為例如心肌梗塞、局部缺血心臟病、充血性心力衰竭、肥大型心肌病、擴張型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等心臟病予防藥或治療藥使用。這些化合物可以是新的化合物，也可以是眾所周知的化合物。
另外通過本發明制備的心肌細胞可作為心肌再生藥或心臟疾患治療藥使用。心臟病如心肌梗塞、局部缺血心臟病、充血性心力衰竭、肥大型心肌病、擴張型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等。作為心肌再生藥或心臟疾患治療藥，只要是含有根據本發明制備的高純度心肌細胞的藥，加工成使細胞懸浮于培養基等水性載體、將細胞包埋于生體分解性基質等支持體、或單層或多層心肌細胞層(Shimizu等人，Circ.Res.，90e40，2002)的形態等，無論什么樣形狀的藥都可以使用。
作為將上述治療藥輸送到損傷部位的方法，可舉出開胸，用注射器直接注入心臟的方法、通過外科手術將心臟的一部切開之后進行移植的方法、以及通過使用導管通過血管的方法進行移植的方法等(Murry等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，67519，2002；Menasche，Ann.Thorac.Surg.，75S20，2003；Dowell等人，Cardiovasc.Res.，58336，2003)，沒有特別限定。據報道通過這樣方法，將從胎兒心臟回收的心肌細胞移植到心臟損傷動物的心臟，表現出非常好的治療效果(Menasche，Ann.Thorac.Surg.，75S20，2003；Reffelmann等人，Heart Fali.Rev.，8201，2003)。來自ES細胞的的心肌細胞呈現出與來自胎兒心臟的心肌細胞非常類似的形態(Maltsev等人，Mech.Dev.，4441，1993；Circ.Res.，75233，1994)。另外，還確認實際上在將來自ES細胞的心肌細胞移植到發育成熟心臟的動物實驗例中，與移植胎兒心肌的例子幾乎沒有什么變化，表現出非常高的生長率(Klug等人，J.Clin.Invest.，98216，1996)。因此，在起因于心肌細胞的破壞以及脫落的上述心臟病中，通過將根據本發明所述方法制備的心肌細胞補充性地移植到病的心臟組織，預期可以促進心臟功能的改善。
實施例以下給出實施例對本發明進行更具體的說明，以下的實施例只不過是給出的本發明的示例，對本發明的范圍并沒有任何限定。
(實施例1通過頭蛋白處理的來自ES細胞的心肌細胞的出現增強效果)使ES細胞通過懸浮凝集培養(以下，在本申請實施例中簡單記為懸浮培養)形成EB，使用分化誘導心肌細胞的實驗系，在培養基中添加頭蛋白對心肌細胞的出現率的影響進行研究。
在以下實驗中，作為ES細胞，使用EB3細胞(丹羽仁史博士〔理科學研究所〕惠贈)、R1細胞(Andrew Nagy博士〔Mount Sinai病院；加拿大〕惠贈)、和129SV細胞(從大日本制藥株式會公司購入)，總的說來，沒有看到由于ES細胞種類不同導致的實驗結果的差別。這些ES細胞使用在含有10％胎牛血清、0.1mM MEM非必需氨基酸液、2mML-谷氨酰胺、和0.1mM2-巰基乙醇的Glasgow Minimum EssentialMedium(GMEM；Sigma公司)培養基中添加了2000U/mL白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factorLIF)(ESGRO；Chemicon公司)的培養基，根據Manipulating the Mouse Emb ryoA Laboratory Manual(Hogan等人編，Cold Spring Harbor Laborayory Press，1994)；Embryonic Stem CellsMethods and Protocols(Turksen編，HumanaPress，2002)等所述的方法，在保持未分化形態的同時進行傳代培養后供實驗用。
開始懸浮培養3日前，將用上述條件培養形成集落的ES細胞用PBS清洗2次后，通過用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液進行處理，形成單一細胞狀態，使用在含有10％胎牛血清、0.1mM MEM非必需氨基酸液、2mM L-谷氨酰胺和0.1mM 2-巰基乙醇的α-modifiedMinimum Essential Medium(αMEM；Sigma公司)培養基(以下，稱為“分化培養基”)中添加了2000U/mL LIF的培養基，制備2.5×105細胞/mL的細胞懸濁液。向該懸濁液中添加、或不添加500ng/mL重組·頭蛋白-Fc嵌合蛋白質(Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera；R&D systems公司)(以下，簡單稱為“頭蛋白”)后，對于飼養非依賴性ES細胞株EB3細胞，接種在明膠包被的市售的細胞培養用板(T75 flask；Greiner公司制)上。另一方面，對于飼養依賴性ES細胞株R1細胞和129SV細胞，預先制備在明膠包被的板上接種了絲裂霉素處理過的初代小鼠胚成纖維細胞(大日本制藥公司)的板，將細胞懸濁液接種在飼養細胞層上。
象以下那樣進行由ES細胞形成EB的懸浮培養。將在添加、或沒有添加頭蛋白的分化培養基培養了3日的ES細胞用PBS清洗2次后，通過用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液進行處理，形成單一細胞狀態，然后以1×102細胞/mL、或2×105細胞/mL濃度接種在用分化培養基鋪滿的市售的細胞粘附性弱的細菌用板(直徑100mm；Valmalk公司制)上。此時，向開始懸浮培養的3日前添加了頭蛋白的細胞組的培養基添加500ng/mL頭蛋白。然后，細胞在保持不粘附板的狀態下進行4～14日的懸浮培養。在本實驗條件下從剛懸浮培養后確認ES細胞開始凝集，并形成EB，從懸浮培養后第7～8日，已經在一部分的EB中觀察到自發搏動性。
另外，作為由ES細胞形成EB的其它的方法，懸滴培養如以下那樣進行。將在添加、或沒有添加頭蛋白的分化培養基培養了3日的ES細胞用PBS清洗2次后，通過用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液進行處理，形成單一細胞狀態。然后，制備在分化培養基15μL中含有500個細胞的液滴，將液滴滴在培養板的頂蓋，培養4日。此時，在從開始懸滴培養的3日前添加了頭蛋白的細胞組的培養基中添加500ng/mL頭蛋白。懸滴培養后，將懸滴中形成的EB接種在用分化培養基鋪滿的市售細胞培養用平皿(4孔多孔平皿；Nunc公司制)上，然后進行粘附培養，誘導向心肌細胞分化。粘附培養后，每隔2日，將一半培養基換成新鮮培養基。在本實驗條件下，與懸浮培養法同樣，從剛懸滴培養后確認ES細胞開始凝集，并形成EB，從對回收的EB開始粘附培養的第3～4日(懸滴培養后第7～8日)時間，已經在來自一部分EB的集落觀察到自發搏動性。
作為心肌細胞從ES細胞分化、發育的一個指標，對呈現自發搏動性的EB的出現率進行經時研究。作為ES細胞，使用EB3細胞，以1×102個/mL的細胞濃度進行懸浮培養時，在來自沒有進行頭蛋白處理的(頭蛋白(-)組)ES細胞的EB中，即使在懸浮培養后第14日也幾乎沒有觀察到搏動性(圖1A)。而在來自進行了頭蛋白處理的(頭蛋白(+)組)ES細胞的EB中，從懸浮培養后第7日開始觀察到出現搏動性的EB，在第14日，80％以上的EB可確認搏動性。在以2×105個/mL細胞濃度進行懸浮培養時也看到同樣的傾向，在頭蛋白(-)組EB中，最終只有在不到10％的EB中確認搏動，相反在頭蛋白(+)組EB中，懸浮培養后第10日30％以上，第14日90％以上的EB表現出搏動性。另外，在頭蛋白(-)組EB中，搏動的區域限定于EB的一部分，但在頭蛋白(+)組EB中，令人驚奇的是能夠觀察到幾乎遍布EB表層整個區域的細胞都在搏動。
即使在懸滴培養條件下，在頭蛋白(+)組ES細胞中的心肌分化能力與頭蛋白(-)組ES細胞相比也顯著高，在分化誘導后第7日(粘附培養后第3日)看到40％以上，在第10日看到80％以上，而在第14日幾乎在所有的來自EB的集落中都看到搏動(圖1B)。另外，與在懸浮培養條件下觀察同樣，在頭蛋白(-)組中，只在使EB粘附在培養平皿形成的集落的一部分區域的細胞看到搏動性，相反在頭蛋白(+)組中，確認在來自EB的遍布整個集落的所有細胞都在搏動。
另外，在兩個培養系中，在與頭蛋白處理同樣的條件下，將例如IGF(insulin-like growth factor)-1、FGF(fibroblast growthfactor)-2，BMP-2等各種增殖因子類或細胞因子類的重組蛋白質添加到培養基中，不能確認呈現出與頭蛋白同樣、或超過頭蛋白的心肌誘導活性。
接下來，進行了關于頭蛋白的添加濃度不同對由ES細胞向心肌細胞的分化誘導的影響的研究。圖2示出了除了添加的頭蛋白的濃度為0.5～1500ng/mL以外，其它完全與圖1條件同樣進行懸浮培養的結果。EB3細胞和R1細胞都表現出幾乎同樣的濃度依賴性，通過添加5ng/mL～1500ng/mL濃度的頭蛋白，確認出現了比頭蛋白(-)組有意義高的搏動性EB。特別是通過添加50ng/mL～150ng/mL濃度的頭蛋白看到非常好的搏動性EB的出現。
(實施例2通過頭蛋白處理進行分化誘導的來自ES細胞的心肌細胞的形態)就像實施例1所示那樣，通過進行頭蛋白處理，由ES細胞制備的EB的搏動性有意義增高，為了確認在該搏動性EB中，該搏動性細胞是心肌細胞，對各種心肌特異的標志分子的基因表達以及蛋白質產生進行了研究。
圖3表示各種心肌細胞特異的標志基因在頭蛋白(+)組、或頭蛋白(-)組EB中的表達。對用與圖1同樣的懸浮培養法形成的EB進行定期回收，使用RNeasy(Qiagen公司制)制備總RNA。然后，根據常規方法，使用SUPERSCRIPT II(Invitrogen公司制)對cDNA進行逆轉錄，通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction；PCR)檢測特異的基因在心肌細胞的表達。在GATA-4、TEF-1、Tbx-5、MEF-2c、αMHC、MLC-2v、α-cardiac actin、GAPDH的各轉錄產物的檢測中使用的引物如下。
GATA-4(正向)5′-CTGTCATCTC ACTATGGGCA-3′(SEQ ID NO1)，GATA-4(反向)5′-CCAAGTCCGA GCAGGAATTT-3′(SEQ ID NO2)；TEF-1(正向)5′-AAGACGTCAA GCCCTTTGTG-3′(SEQ ID NO3)，
TEF-1(反向)5′-AAAGGAGCAC ACTTTGGTGG-3′(SEQ ID NO4)；Tbx-5(正向)5′-GGAGCCTGAT TCCAAAGACA-3′(SEQ ID NO5)，Tbx-5(反向)5′-TTCAGCCACA GTTCACGTTC-3′(SEQ ID NO6)；MEF-2c(正向)5′-AGCAAGAATA CGATGCCATC-3′(SEQ ID NO7)，MEF-2c(反向)5′-GAAGGGGTGG TGGTACGGTC-3′(SEQ ID NO8)；αMHC(正向)5′-GGAAGAGTGA GCGGCCATCA AGG-3′(SEQ ID NO9)，αMHC(反向)5′-CTGCTGGAGA GGTTATTCCT CG-3′(SEQ ID NO10)；MLC-2v(正向)5′-GCCAAGAAGC GGATAGAAGG-3′(SEQ ID NO11)，MLC-2v(反向)5′-CTGTGGTTCA GGGCTCAGTC-3′(SEQ ID NO12)；α-cardiac actin(正向)5′-CTGAGATGTC TCTCTCTCTC TTAG-3′(SEQID NO13)，α-cardiac actin(反向)5′-ACAATGACTG ATGAGAGATG-3′(SEQ IDNO14)；GAPDH(正向)5′-TTCAACGGCA CAGTCAAGG-3′(SEQ ID NO15)，GAPDH(反向)5′-CATGGACTGT GGTCATGAG-3′(SEQ ID NO16)。
PCR使用TaKaRa Taq(寶酒造公司制)作為耐熱性DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer公司制)進行。首先將含有cDNA的PCR反應液于94℃下加熱3分鐘后，反復進行94℃1分鐘，-55℃1分鐘，-72℃1分鐘的30次加熱循環，最后于72℃下加熱5分鐘后，在4℃下冷卻。將PCR產物用3％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用SYBR Green I(寶酒造公司制)染色，通過Molecular ImagerFX(Bio-Rad公司制)進行檢測。
結果GATA-4、TEF-1、Tbx-5、MLC-2v等基因在頭蛋白(-)組EB中從懸浮培養開始后第5至第10日開始看到比較弱的表達，相反在頭蛋白(+)組EB，從懸浮培養開始的當日(0日)開始看到表達，之后，在第5～第15日持續強的表達。MEF-2c和心肌特異的α-肌動蛋白都是從懸浮培養后第5日開始看到表達，其表達量，頭蛋白(+)組EB有意義地強。而，αMHC(肌球蛋白重鏈)基因，在頭蛋白(+)組EB，在第10、15日看到強表達，但在頭蛋白(-)組EB不能確認表達。以上結果表明通過頭蛋白處理，迅速、且強烈地促進EB內的心肌細胞的分化以及發育。
另外，用免疫組織化學染色法確認在頭蛋白(+)組EB中發育的搏動性細胞產生心肌細胞特異的標志蛋白質。將用圖1同樣的懸浮培養法形成的蛋白(+)組EB在懸浮培養后第12日回收，用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液處理后使細胞分散。分散的細胞以個個細胞相互不粘連程度的低密度接種在明膠包被的蓋玻片上，在鋪滿分化培養基的市售的細胞培養用板內進行培養。翌日，將蓋玻片上的細胞用4％低聚甲醛溶液固定，依次與作為1次抗體的抗肌原纖維節和肌球蛋白抗體(MF20；American Type Culture Collection)、抗肌鈣蛋白I抗體(#sc-8120；Santa Cruz Biotechnology公司)、抗α-輔肌動蛋白抗體(#sc-15335；Santa Cruz公司)、抗ANP抗體(#AB5490；Chemicon公司)反應，再與Alexa488標記2次抗體(Molecular Probes公司)依次反應后，在熒光顯微鏡下進行觀察。
結果，作為心肌細胞中特異的標志蛋白質的肌原纖維節和肌球蛋白或肌鈣蛋白I、α-輔肌動蛋白、ANP陽性細胞多數被確認(圖4)，證實來自ES細胞的搏動性細胞是心肌細胞。
接下來，使用與上述同樣的免疫組織化學的染色法， 對EB內的心肌細胞的分布和發生頻率進行確認。將懸浮培養后第12日回收的EB用冷凍切片制備用包埋劑(OCT Compound，Sakura Finetek USAInc.)新鮮包埋，將于液氮下冷凍制備的冷凍標本用恒冷切片機(LEICACM3050-S)切成薄片(5μm)后，貼在載玻片上。使冷凍切片與上述抗心肌細胞特異標志抗體反應，用與上述同樣的方法進行標志蛋白質陽性細胞的檢測。
檢測結果如圖5所示。在頭蛋白(-)組EB中，心肌細胞中特異的標志蛋白質的陽性細胞只在EB的極有限的區域觀察到，而相反在頭蛋白(+)組EB中，在遍布幾乎整個EB表層區域都可確認心肌標志陽性細胞。本見識與在頭蛋白(-)組EB中搏動域被限定在EB的一部分，相反在頭蛋白(+)組EB中，搏動遍布幾乎整個EB區域，與在萌發培養基中放置2-4周。將發芽的植物轉移到單元包裝盤(cellpack tray)的土壤中3周，以適應環境。將植物栽到溫室內的10英寸罐中，評價草甘膦抗性。
為了確定表達GAT變體轉基因的轉基因大豆的草甘膦抗性水平，在溫室中，對T0代的植物噴灑草甘膦(Roundup ULTRA MAXTM)。通過植物變色分值和植物高度測量值，評價植物抗性水平。
噴灑草甘膦后2周時的變色分值9＝無葉子/莖變色7＝較小的葉/莖變色5＝更壞的葉/莖變色3＝嚴重脫色的植物或者變干的植物1＝死亡植物對于各個獨立的轉基因事件，將1-4棵植物送到溫室中。將每個事件的另外的1-2棵植物種植在控制環境的生長腔室中，用于種子生產，被噴灑草甘膦。在轉移到土壤后的3-4周，對溫室植物噴灑1×、2×或者4×草甘膦(1×草甘膦＝26盎司/英畝的RoundUp ULTRAMAXTM)。具有2×和4×噴灑速度的T0代的植物的變色分值分別顯示在表10和表11中。
這些結果表明，如PCR分析所證明，用GAT基因變體有效地轉化了大豆。表達GAT基因變體的轉基因大豆抵抗具有2×和4×噴灑速度的草甘膦。在4×草甘膦噴灑速度中存活的事件的確表現出某種程度的較小的葉子變色，但是，在2周的噴灑檢測中，植物恢復，并且顯示出正常的葉片形態。
表10.用2×草甘膦處理后的第10天的抗性分值

另外，當使頭蛋白(150ng/mL)在第5日以后也存在于培養基中時，搏動性心肌細胞的出現被顯著抑制。懸浮培養后7日以上還恒定存在時，搏動性心肌細胞幾乎都沒有出現，與已報告論文(Gratsch &O′Shea，Dev.Biol.，24583，2002)同樣，觀察到神經細胞樣細胞的分化誘導。
以上結果表明為了有效使ES細胞分化誘導為心肌細胞，懸浮培養前和懸浮培養開始時進行頭蛋白處理是重要的，而懸浮培養后，高濃度頭蛋白還恒定存在，相反具有阻礙心肌細胞發育的作用。
(實施例4BMP對心肌分化誘導作用的抑制效果)由于頭蛋白處理導致的ES細胞的心肌分化誘導促進效果可以通過作為頭蛋白的BMP拮抗劑的活性確認，所以與頭蛋白處理同時向培養基中添加BMP-2，研究添加效果。
在與實施例1，2同樣條件下進行懸浮培養，在添加頭蛋白(150ng/mL)的同時使各種濃度的BMP-2共存，研究其影響的結果如圖6所示。BMP-2阻礙頭蛋白處理導致的ES細胞的心肌分化誘導效果與濃度有關，添加5ng/mL以上的BMP-2幾乎完全看不到搏動性EB的出現。
(實施例5在使用支持細胞的心肌分化誘導系中的頭蛋白處理的效果)據報道通過將ES細胞與以預先接種在培養板上的ST2細胞或OP9細胞等間質(stroma)系細胞作為支持細胞(飼養細胞)進行共培養，不需要進行懸浮培養法或懸滴培養法那樣的三維培養，可以誘導向心肌細胞的分化(Yamane等人，Methods Mol.Biol.，184261，2002；Schroeder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004018，2003)。其中，在將ST2細胞(從理研細胞庫購入)作為飼養細胞使用的分化誘導系中，研究了頭蛋白處理的效果。將ST2細胞接種在市售的細胞培養用6孔板(CORNING公司制)，將在Dulbecco MEM培養基(Invitrogen/GIBCO公司制)中加有10％胎牛血清(Invitrogen/GIBCO公司制)的培養基，培養直至鋪滿狀態的細胞作為飼養細胞使用。使用與上述同樣的方法制備成單一細胞狀態ES細胞的懸濁液，將飼養層用PBS清洗2次后，按照2000細胞/2mL培養基/1孔進行接種。然后，定期對搏動性心肌細胞的出現進行顯微鏡觀察的同時，在培養后第8日，將一部分細胞用70％乙醇溶液固定，與作為1次抗體的抗肌原纖維節和肌球蛋白抗體(MF20；American TypeCulture Collection公司制)，接下來的辣根過氧化物酶標記2次抗體(Histofine Simple Stain PO(M)；Nichirei公司制)依次反應，最后使用ACE(3-amino-9-ethylcarbazole)底物液(Nichirei公司制)進行呈色反應后，在光學顯微鏡下進行觀察。
在本培養條件下，接種在ST2細胞上的ES細胞在培養開始后數日以內形成用肉眼能觀察的大的集落，在培養后第8日，已經可確認對作為心肌細胞標志的1種抗肌原纖維節和肌球蛋白抗體的陽性(以下，MF20陽性)細胞(集落)，然后，從培養第12日前后出現搏動性心肌細胞。其中，從共培養3日前將在含有頭蛋白(150ng/mL)的培養基培養的ES細胞接種在ST2細胞上，再于共培養開始后2日，用含有頭蛋白(150ng/mL)的培養基進行培養。結果如圖7所示。接種了頭蛋白(-)組ES細胞的情況，在飼養層上形成的來自ES細胞的集落的60％多都是MF20陽性，與此相反，在頭蛋白(+)組90％以上的集落是陽性，然而集落中MF20陽性細胞占的比例與頭蛋白(-)組相比，顯著增高。另外，在頭蛋白(+)組，搏動性心肌細胞出現的頻率也高，在頭蛋白(-)組，飼養層上形成的來自ES細胞的30％程度集落搏動，而頭蛋白(+)組中在大致70％集落觀察到搏動。
(實施例6由于索蛋白處理導致的來自ES細胞的心肌細胞出現的增強效果)與頭蛋白同樣，就已知表現出BMP拮抗劑作用的索蛋白的心肌誘導效果，與頭蛋白的效果進行比較研究。作為索蛋白，使用市售的重組·索蛋白-Fc嵌合蛋白質(Recombinant Mouse Chordin/Fc Chimera；R&D systems公司)(以下，簡單稱為“索蛋白(蛋白質)”)。使用在添加了頭蛋白(500ng/mL)\或索蛋白(500ng/mL)的培養基\或任何因子都沒有添加的培養基培養了3日的ES細胞，利用與實施例1同樣的方法進行懸滴培養。在懸滴培養第4日回收EB后，接種到細胞培養用平皿上，接下來通過粘附培養誘導向心肌細胞的分化。結果在索蛋白處理的ES細胞中確認出現了與頭蛋白處理的ES細胞大致相同程度的搏動性心肌細胞(圖8)，可以確認索蛋白對于ES細胞表現出與頭蛋白同樣的心肌分化誘導效果。
另外，使用其它的EB形成法/心肌分化誘導法，研究了索蛋白的效果。將在添加了頭蛋白(150ng/mL)、或索蛋白(150ng/mL)的培養基、或任何因子都沒有添加的培養基培養了3日的ES細胞接種在市售的懸浮培養用板(96-well multiplate；住友Bakelite公司制)后使其形成EB，誘導它向心肌細胞分化。此時，設定添加索蛋白(150ng/mL)的組和沒有添加的組。
結果就像圖9表示的那樣，在索蛋白處理的ES細胞(圖中C→C)中，與頭蛋白處理的ES細胞(圖中N→N)同樣，確認出現顯著的搏動性心肌細胞，可以再次確認索蛋白對ES細胞表現出與頭蛋白同樣的心肌分化誘導效果。而在EB形成前的3日間進行索蛋白處理，EB形成后不添加索蛋白的組(圖中C→(-))\和EB形成前的3日間不進行索蛋白處理，EB形成后添加索蛋白的組(圖中(-)→C)也呈現出比未添加組(圖中(-)→(-))有意義增強的心肌分化促進效果。同樣的效果在取代索蛋白使用頭蛋白的情況也能看到，在該培養條件下，EB形成前的3日間進行頭蛋白處理，EB形成后不添加頭蛋白的組以及相反在EB形成前不進行頭蛋白處理，在EB形成后添加頭蛋白的組也確認比頭蛋白未處理組有明顯強的心肌分化促進效果。
接下來，為了研究頭蛋白和索蛋白處理對人細胞的有效性，使用類似于ES細胞的胚胎癌(性)細胞(Embryonal carcinoma cells；以下，稱為EC細胞)。將人EC細胞株NCCIT細胞(從American TypeCulture Collection公司購入)與上述使用小鼠ES細胞的情況同樣，于添加頭蛋白(15ng/mL)、或索蛋白(15ng/mL)的培養基、或任何因子都不添加的培養基培養3日。然后，接種在市售的懸浮培養用板，使其形成EB，培養14日。然后，運用與實施例2情況同樣的方法，通過PCR法或免疫組織化學的染色法研究心肌細胞特異標志的基因表達或蛋白產生。結果在頭蛋白或索蛋白處理的NCCIT細胞中，證實了作為心肌標志之一的肌球蛋白的表達/產生誘導。
(實施例7通過其它BMP拮抗劑處理導致來自ES細胞的心肌細胞的出現增強效果)接下來，對作為BMP拮抗劑的卵泡抑素、DAN、Caronte(雞的Cerberus樣因子)、gremlin的4種BMP拮抗劑(無論那一個都使用R&D systems公司生產的Fc嵌合型重組蛋白質)的效果進行研究。將在添加了上述各種BMP拮抗劑(150ng/mL)的培養基、以及沒有添加BMP拮抗劑的培養基中培養3日的ES細胞接種在市售的懸浮培養用板(96-well multiplate；住友Bakelite公司制)后，使其形成EB，誘導它向心肌細胞分化。
結果可以確認無論哪一種因子都表現出與頭蛋白和索蛋白同樣、或強于它們的心肌分化誘導活性(圖10)。另外，添加相當于BMP受體1A的細胞外區域，競爭性阻礙BMP家族分子與內因性受體的結合的重組蛋白質(Recombinant Mouse BMPR-1A/Fc Chimera；R&D systems公司)情況下也確認了大致同樣的促進效果。
序列表<110>福田惠一<120>由干細胞分化誘導心肌細胞的方法<130>
<150>JP 2003-346248<151>2003-10-3<150>JP 2004-212255<151>2004-7-20<160>16<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增GATA-4的正向引物<400>1ctgtcatctc actatgggca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增GATA-4的反向引物<400>2ccaagtccga gcaggaattt 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增TEF-1的正向引物<400>3aagacgtcaa gccctttgtg 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增TEF-1的反向引物<400>4aaaggagcac actttggtgg 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增Tbx-5的正向引物<400>5ggagcctgat tccaaagaca 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增Tbx-5的反向引物<400>6ttcagccaca gttcacgttc 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增MEF-2c的正向引物<400>7agcaagaata cgatgccatc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增MEF-2c的反向引物<400>8gaaggggtgg tggtacggtc 20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增αMHC的正向引物<400>9ggaagagtga gcggccatca agg 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增αMHC的反向引物<400>10ctgctggaga ggttattcct cg 22<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增MLC-2v的正向引物<400>11gccaagaagc ggatagaagg 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增MLC-2v的反向引物<400>12ctgtggttca gggctcagtc 20<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增α-心臟肌動蛋白的正向引物<400>13ctgagatgtc tctctctctc ttag 24<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增α-心臟肌動蛋白的反向引物<400>14acaatgactg atgagagatg 20<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增GAPDH的正向引物<400>15ttcaacggca cagtcaagg 19<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴增GAPDH的反向引物<400>16catggactgt ggtcatgag 19權利要求
1.由干細胞分化誘導心肌細胞的方法，其特征是在抑制BMP信號傳導物質的存在下，對干細胞進行用于分化誘導的培養。
2.權利要求1所述的方法，其中，用于分化誘導的干細胞的培養包括進行懸浮凝集培養，使胚狀體形成的工序。
3.權利要求1所述的方法，其中，用于分化誘導的干細胞的培養包括與飼養細胞進行共培養的工序。
4.權利要求1所述的方法，其中，用于分化誘導的干細胞的培養包括在培養容器上進行平面培養的工序。
5.權利要求1～4任一項所述的方法，其中，只在分化誘導期的最初數日內添加抑制BMP信號傳導的物質。
6.權利要求1～4任一項所述的方法，其中，包括預先用抑制BMP信號傳導的物質對分化誘導期前的干細胞進行處理的工序。
7.權利要求1～4任一項所述的方法，其中，包括預先用抑制BMP信號傳導的物質對分化誘導期前的干細胞進行處理的工序，而且只在分化誘導期的最初數日內添加抑制BMP信號傳導的物質。
8.權利要求1～7任一項所述的方法，其中，抑制BMP信號傳導的物質是BMP拮抗劑。
9.權利要求8所述的方法，其中，BMP拮抗劑是從頭蛋白、索蛋白、胎球蛋白、卵泡抑素、sclerostin、DAN、Cerberus、gremlin、和Dante、以及它們的相關蛋白質中選出的1個或多個。
10.權利要求1～9任一項所述的方法，其中，干細胞是在試管內培養下具有可向心肌細胞分化能力的來自哺乳動物的細胞。
11.權利要求10所述的方法，其中，具有可向心肌細胞分化能力的來自哺乳動物的細胞是多能性干細胞或來自該細胞的細胞。
12.權利要求11所述的方法，其中，多能性干細胞是胚胎干細胞、具有類似于胚胎干細胞形態的細胞、胚胎生殖細胞或成人型多能性干細胞。
13.權利要求12所述的方法，其中，多能性干細胞是胚胎干細胞。
14.通過權利要求1～13任一項所述的方法得到的心肌細胞。
全文摘要
本發明在由干細胞分化誘導心肌細胞的方法中，通過特征為將干細胞在抑制BMP信號傳導物質的存在下進行向心肌細胞的分化誘導培養的該方法，提供高效而且有選擇性地對心肌細胞進行分化誘導的方法。
文檔編號C12N5/08GK1863904SQ20048002891
公開日2006年11月15日 申請日期2004年10月4日 優先權日2003年10月3日
發明者福田惠一, 湯淺慎介, 岡野榮之, 島崎琢也, 小清水右一, 田中智文, 杉村惠二郎 申請人:福田惠一