專利名稱：一種鑒定結核分支桿菌菌種的多重pcr的引物設計方法
技術領域：
本發明涉及一種一次性擴增多個細菌的基因片段，從而鑒定結核分支桿菌菌種的多重PCR的引物設計方法。
背景技術：
20世紀90年代以來，隨著分子生物學在醫學領域取得的飛速發展，研究者也將分子生物學技術引入了結核病研究范圍。聚合酶鏈反應(PCR)是一種以核酸生物化學為基礎的分子生物學技術，是生物學領域內最有價值的技術之一。自1989年引入結核病的診斷以來，立即成為結核病細菌診斷領域中備受關注的焦點。經過多年的科學研究和臨床檢驗，使這一方法不斷完善，其反應靈敏、快速、特異的特性在多數報告中得到驗證。
該項目以臨床上常見的4種結核分支桿菌菌種(牛型、人型、鳥型、鼠型)為研究對象，選擇各自不同類型結核桿菌的基因序列而設計特異性引物，在同一體系同時檢測多種細菌，建立一種全新的多重PCR檢測結核桿菌菌種，用于結核桿菌的快速診斷、分型。分子生物學技術的發展，PCR技術的應用，開辟了分類鑒定的新途徑。目前基因鑒定技術具有快速、簡便、分辨率高的特點，并可進行多相分類鑒定，能按照種系進化的關系確定精確的位置和定種，使分類鑒定方法更客觀合理。
多重PCR即是在一個PCR反應體系中，設計多對引物進行擴增，這樣產生不同特異性靶區域片段，經凝膠電泳觀察各特異擴增片段，用于鑒定結核分枝桿菌至屬種的水平。Thierry等在《Research inMicrobiology》1995年第146期中發表的《Mycobacteriumtuberculosis strains unidentified using the IS6110 probe canbe detected by oligonucleotides derived from the Mt308sequence》文章中設計了擴增IS6110序列片段(325bp)及65kD蛋白基因片段(383bp)并對擴增產物進行分析，取得了較好的結果。Liebana等在《Journal of Clinical Microbiology》1996年34期中發表的《Assessment of genetic markers for speciesdifferentiation within the Mycobacterium tuberculosiscomplex》文章報道了擴增16srDNA(1030bp)和MAB70的372bp基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳均可快速鑒別結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌復合群。Ikonomopoulos JA等在《Moden Pathology》.1999年12期中發表的《Multiplex polymerase chain reaction for thedetection of mycobacterial DNA in cases of tuberculosis andsarcoidosis》文章則應用mpb64(243bp)，IS6110(916bp)及65kD蛋白(383bp)的基因片段，對300個臨床標本進行分析，可以快速檢測結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、慢生長分枝桿菌復合群。
上述是目前國內外利用多重PCR技術用于結核桿菌檢測的例子。他們只是簡單的將多重不同的檢測的結核桿菌基因進行混合，在同一個反應中進行PCR擴增反應，從而達到多重PCR的目的。這些方法存在的問題是(1)需要嚴格的PCR反應條件，例如各種反應成分的濃度、反應成分之間的比例、PCR擴增的溫度、時間等。(2)由于多種不同的引物存在于同一反應管中，導致引物之間的反應比較明顯，如引物二聚體的形成等，會導致很大量的引物的丟失，很容易導致到這種多重PCR反應的失敗。(3)引物的選擇將非常的嚴格，必須保證它們之間不會形成引物二聚體，這將大大降低多種不同類型結核分支桿菌一起多重PCR的可能性。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于結核桿菌檢測、效率高、靈敏度高的多重PCR的引物設計方法。
本發明方法的基本思路是選取一對非細菌基因組的短DNA片段作為放量擴增引物對YB1和YB2，并在能與細菌基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端分別加上該引物對YB1和YB2，從而得到特異性長引物YB1-P1和YB2-P2。
此處，能夠與細菌基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2亦即是可以與待擴增基因座的細菌基因組結合的原始引物。由于多重PCR反應是同時對多個基因座進行的PCR擴增，相對于不同基因座來說，能夠與該基因座的細菌基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2是不同的，與之相對應，各個待擴增基因座的特異性長引物YB1-P1和YB2-P2也因P1、P2的不同而不相同。
在進行多重PCR反應時，同時在PCR反應體系中加入上述放量擴增引物和針對不同待擴增基因座的特異性長引物(當然還需加入常規PCR反應所需的耐熱聚合酶和單核苷酸等)。由于各個待擴增基因座的細菌基因組序列中并不含有放量擴增引物YB1、YB2所對應的序列，所以在該反應體系進行第一輪PCR反應時(經歷變性、退火、延伸的一次循環過程)，引物對YB1和YB2并不會與細菌基因組序列結合，所擴增的DNA片段還是由特異性長引物YB1-P1和YB2-P2中所含的原來的引物對P1、P2所決定。但是，第一輪反應結束后，在待擴增基因座將會產生同時具有目的基因片段和非細菌基因組序列YB1、YB2的擴增產物。在PCR反應體系進行第二輪PCR反應(即經歷變性、退火、延伸的第二次循環過程)時，上述同時具有目的基因片段和非細菌基因組序列YB1、YB2的產物被進一步擴增，擴增所用引物仍然是特異性長引物YB1-P1和YB2-P2，反應完成后，所得到的產物同時具有目的基因片段和與引物對YB1和YB2配對的非細菌基因組序列。在本發明中，我們將上述以特異性長引物作為反應引物的第一輪和第二輪PCR反應稱之為第一階段的反應，即多重PCR過程中第一階段的聚合酶鏈反應。換句話說，復合擴增過程中第一階段的聚合酶鏈反應包括了上述第一輪和第二輪反應。該階段反應所得到的擴增產物同時具有目的基因片段和與引物對YB1和YB2配對的非細菌基因組序列，此處將其稱之為多重PCR第一階段的產物。從第三輪PCR反應開始，由于對于各個基因座已經具有上述第一階段的產物，這樣，放量擴增引物YB1、YB2就可以作為上述各個擴增基因座的引物，PCR反應就能以上述第一階段的產物為模板進行擴增。與此相類似，在第三輪之后的各輪PCR反應中，均能夠以放量擴增引物YB1、YB2充當各個擴增基因座的引物。在經歷多輪(如30輪)PCR循環反應之后，上述第一階段的產物就會被擴增至上百萬倍。在本發明中，我們將上述以放量擴增引物引物作為反應引物的PCR反應稱之為第二階段的反應，即多重PCR過程中第二階段的聚合酶鏈反應。需要說明的是，在本發明的上述設計思路中，第一階段和第二階段的反應是在同一反應體系中進行的，而不是截然地分成兩次反應。實際上，即使是在第三輪及第三輪之后的PCR反應中，仍然存在著上述第一階段的反應，只是其所占比例極低而已。另外，在進行第一階段的PCR擴增反應時有多對引物同時參與反應，即相對于多個待擴增基因座且序列不同的多對特異性長引物同時參與反應(如前所述，各個待擴增基因座的特異性長引物YB1-P1和YB2-P2并不相同)，引物與引物間的反應與競爭在所難免，從而大大降低了PCR擴增的效率，這一弊端在前面討論現有技術時已經提及。但是，就本發明來說，第一階段的PCR擴增的目的并不是希望獲得大量的擴增片段，而僅僅是使同時帶有目的基因片段和與YB1、YB2配對的非細菌基因組序列的產物(第一階段的產物)產生即可，因此上述弊端對整個多重PCR反應過程產生的影響是極其微弱的。而在第一階段的PCR擴增之后，需要擴增的各個目的基因片段的5′端都帶有與YB1、YB2配對的非細菌基因組序列，所以加入一對放量擴增引物(YB1、YB2)之后，就可以對多個基因座同時進行擴增。由于在此后進行的第二階段擴增中，參與反應的引物只有一對，即放量擴增引物對YB1、YB2，不存在引物間的競爭與反應，也無需調整引物間的濃度，從而大大提高了各基因座的擴增效率。因此可以說，第一階段的PCR反應是僅需擴增出少量模板，而第二階段的擴增是高效率擴增所有基因座。就其實質而言，在第二階段的PCR反應中，是把現有復合擴增方法中的多對引物同時擴增多個基因座，轉變為一對引物(YB1、YB2)同時擴增多個基因座；同時，相對于被擴增的各個特異性DNA片段來說，YB1、YB2并非是特異引物，因此，上述過程還由現有復合擴增方法中的由多對特異引物同時擴增多個特異性基因片段，轉變成了由一對非特異引物同時擴增多個特異性基因片段。
在本發明中，上述放量擴增引物YB1、YB2的選擇是極為關鍵的，其設計需要考慮以下三個要素①、它必須是非細菌基因組序列，即它的序列不會與細菌基因組序列相同；②、選取適當的引物長度，18～24個堿基構成的寡核苷酸鏈是比較優化的引物長度；③、選取引物中堿基GC的含量和引物的退火溫度Tm。
本發明在設計引物的Tm值時選擇的溫度是55℃，因為在該溫度下，多重PCR中絕大多數的PCR反應都能進行，同時此溫度將會使首次PCR反應后出現大量的非特異的雜帶，我們就必須通過降低特異性長引物的濃度來減少雜帶。降低長引物濃度后，各引物之間的相互作用降低，非特異性的產物減少，與此同時，我們所需的特異性的產物也降低，但是這并不會影響整個擴增效率。前已述及，前兩輪PCR反應僅僅是上述復合擴增過程的開端，該輪PCR反應的產物并不要求有較大的量，只需產生少量同時具有非細菌基因組序列和目的基因的DNA片段，即生成少量用于第二階段的PCR反應的模板，就能通過其后的PCR反應對該模板進行放量擴增。在第一階段的PCR反應之后，參與反應的引物就不再是特異性長引物對(YB1-P1、YB2-P2)，而是放量擴增引物對(YB1、YB2)。
但是，并不是簡單地滿足上述三個要素的引物對就能夠充當本發明中所說的放量擴增引物對YB1、YB2。雖然從理論上講，該引物對YB1、YB2可以按一定的原理進行設計并得出，但在實踐中可以發現，依據引物設計原理所設計出的引物能夠實際應用且能取得較佳效果的并不多。也就是說，真正能夠實際應用的“引物對”必須經過大量的、艱苦的試驗才能得到，這是一個對引物的優選過程。
例如，基于上述三個要素的限制，我們曾經設計出了如下7對引物(YB3-YB16)
YB3(5′-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3′)YB4(5′-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3′)]]>YB5(5′-GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3′)YB6(5′-CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA-3′)]]>YB7(5′-GGTGTTGATGATGACATGGCG-3′)YB8(5′-GTACCCTCTGCAGCATGAGAGTAG-3′)]]>YB9(5′-TGGAGAAATCTGGCACCAC-3′)YB10(5′-GAGGCGTACAGGGATAGCAC-3′)]]>YB11(5′-TTGTCAACTTCAGATACCACTGGAG-3′)YB12(5′-CAAGGCAGATTTAACCACAGGTG-3′)]]>YB13(5′-AGGGAAGAGGAGAGAGAAAGAGC-3′)YB14(5′-CGGCAGTTAGTAGACTATCCAGG-3′)]]>YB15(5′-GATTGCTCAACAACCATG-3′)YB16(5′-TTTCACTCTAGACCAAGCTTTG-3′)]]>通過檢索細菌基因數據庫，在細菌基因組中并不存在與上述引物YB3～YB16相對應的序列，從而確保了這些引物不與細菌基因組序列發生結合。
但是，在其后的實驗發現，上述7對引物并不能夠成功地進行第二階段的放量擴增。
另外，與上述例子相類似，在形成本發明技術方案的過程中，我們還依據待擴增對象的特性，對滿足上述三個要素的大量引物對進行了篩分、研究和實驗，以期找到能夠實際應用且能取得較佳效果的“引物對”。
正是通過上述大量的篩分、研究和實驗，本發明方法優選出了引物對YB1、YB2YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′通過檢索細菌基因數據庫，在細菌基因組中并不存在與上述引物YB1、YB2相對應的序列，從而確保了上述引物不與細菌基因組序列發生結合。同時，更為重要的是實驗研究表明，引物對(YB1，YB2)能夠成功地進行第二階段的放量擴增，從而構成了本發明所說的放量擴增引物。
將上述放量擴增引物加在能與細菌基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端，就得到特異性長引物YB1-P1和YB2-P2。
綜上所述，本發明的鑒定結核分支桿菌菌種的多重PCR的引物設計方法是a、分別在能夠與細菌基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非細菌的基因組序列YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′，從而得到特異性長引物YB1-P1和YB2-P2，以此作為復合擴增過程中第一階段聚合酶鏈反應的引物對，即特異性長引物對；b、直接以非細菌的基因組序列YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′作為復合擴增第二階段聚合酶鏈反應的引物對，即放量擴增引物對。
與前述現有技術相比，本發明對多重PCR反應的引物進行了設計，從而能夠高效率地大量擴增目的基因片段，實驗結果的可重現性極高，同時，無需在實驗過程中繁瑣地調整各對引物的濃度，簡化了整個實驗過程。另外，采用本發明方法設計出的引物進行多重PCR反應之后，可以采用硝酸銀染色方式檢測結果，對實驗設備的成本要求不高，因此本發明的方法更具優點有中國特色，符合當前中國大多數分子醫院細菌檢驗的需要。
具體實施例方式
在本實施例中，所設計的引物用于在同一PCR反應體系中同時對四個基因hsp65基因、32-KDa蛋白基因、IS6110基因和mtp40基因進行多重PCR反應。
所設計的放量擴增引物為YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′與上述放量擴增引物相對應，各基因座所設計的特異性長引物YB1-P1、YB2-P2為hsp65基因YB1-P15′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′YB2-P25′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′32-KDa蛋白基因YB1-P15′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT CGGCAACGCGCCGTCGGTGG-3′YB2-P25′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CCCCCCACGGCACCGCCGGG-3′IS6110基因YB1-P15′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT CGGAGACGGTGCGTAAGTGG-3′YB2-P25′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT GATGGACCGCCAGGGCTTGC-3′mtp40基因YB1-P15′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT TTCCTGACCAGCGAGCTGCCG-3′YB2-P25′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CCCCAGTACTCCCAGCTGTGC-3′需要說明的是，細菌基因組序列特異性結合的引物P1、P2分別為hsp65基因P15′-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′P25′-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′32-KDa蛋白基因P15′-CGGCAACGCGCCGTCGGTGG-3′P25′-CCCCCCACGGCACCGCCGGG-3′IS6110基因P15′-CGGAGACGGTGCGTAAGTGG-3′P25′-GATGGACCGCCAGGGCTTGC-3′
mtp40基因P15′-TTCCTGACCAGCGAGCTGCCG-3′P25′-CCCCAGTACTCCCAGCTGTGC-3′為進一步說明本實施例中所設計引物的使用方法和使用效果，下面繼續說明本實施例中所設計引物用于鑒定結核分支桿菌菌種的多重PCR反應時的具體過程。
多重PCR反應在PE-9600擴增儀中進行。PCR反應體系中的成份主要有模板DNA(細菌基因組序列)、特異性長引物對、放量擴增引物對、耐熱DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷三磷酸dNTP、BSA(小牛血清蛋白)、1×Buffer(緩沖液)和雙蒸水DDH2O。其中，DNA耐熱聚合酶、Mgl2和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產廠家為華美公司，中國，品名為耐熱TaqDNA聚合酶)提供。
PCR反應體系中的各成份的濃度如下表
擴增過程如下a、第一輪及第二輪PCR反應，即第一階段擴增(少量擴增)，發生反應的引物是長引物。
①、變性加熱至94℃，使雙鏈DNA解開；②、退火降溫至55℃，在此溫度下，長引物與模板DNA相結合；③、延伸升溫至72℃，此溫度是DNA聚合酶反應的最適合溫度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在長引物的5’端延著模板的5’→3’方向加入dNTP。
經第一輪及第二輪PCR反應之后，得到同時帶有目的基因片段和與YB1、YB2配對的非細菌基因組序列的產物(第一階段的產物)。
b、第三輪及其之后的PCR反應，即第二階段擴增，起反應的引物是放量擴增引物。變性、退火和延伸的PCR反應機理與前幾輪擴增相似，但在退火過程中，是以放量擴增引物與模板相結合，且該模板的5’端帶有與YB1、YB2配對的非細菌基因組序列；同時，在延伸過程中，是在放量擴增引物的5’端延著上述模板的5’→3’方向加入dNTP。整個復合擴增共循環36輪，循環參數如下預變性94℃3分鐘變性94℃ 50秒復性55℃ 50秒延伸72℃ 50秒循環次數 36延伸72℃ 10分鐘另外，鑒于擴增產物的分子量大小、片段長短不同，特別地利用電泳檢測法對其進行分離檢測，以便檢驗擴增結果。進行分離檢測時，先將擴增產物與上樣緩沖液以一定的比例混勻，加入電泳槽中的聚丙烯酰胺凝膠孔中，在其兩端加以電壓進行電泳。由于各擴增產物的分子大小不同，在相同電場力的作用下，其在單位時間內在相同的介質中所運行的距離也不等。因此，在電泳儀中處理一段時間之后，各擴增產物的差距逐漸拉開，此后取出凝膠，對其進行染色(本例采用銀染法)，最后即能直觀地看到擴增結果。
所采用的電泳檢測原料、設備及條件如下聚丙烯酰胺凝膠成份30％聚丙烯酰胺(PAG)溶液9.5ml
5×TBE溶液7mlDDH2O 18.5ml10％過硫酸銨(PA) 300μlTEMED 30μl電泳槽DYY-III電泳槽(北京六一儀器廠)電泳儀pharmacia1000型多功能電泳儀電泳條件1.上樣量樣本3μl 凝膠載樣緩沖液2μl電極緩沖液1×TBE溶液2.采用恒流方式電泳 電流80mA 時間1小時30分染色過程如下采用銀染法1、10％乙醇固定10分鐘2、DD H2O洗2次3、1％硝酸固定3分鐘4、DD H2O洗2次5、1％硝酸銀染色20分鐘6、DD H2O洗3次7、3％Na2CO3，甲醛溶液顯色8、DD H2O洗停止顯色采用本實施例設計的引物進行多基因座擴增所得結果同采用原來的特異性引物(即P1、P2)進行多基因座擴增的片段大小比較如下hsp65基因用原來特異性引物擴增的片段大小為443bp用實施例引物復合擴增后的片段大小為485bp32-KDa蛋白基因用原來特異性引物擴增的片段大小為396bp用實施例引物復合擴增后的片段大小為438bpIS6110基因用原來特異性引物擴增的片段大小為986bp用實施例引物復合擴增后的片段大小為1028bp
Mtp40基因座用原來特異性引物擴增的片段大小為506bp用實施例引物復合擴增后的片段大小為548bp經電泳和染色處理后可以看到，采用本實施例設計的引物進行多基因座擴增后，其擴增效率高，擴增產物生成量大，凝膠經染色后譜帶清晰易辨；同時，所得擴增產物經過測序儀測序后，證實擴增產物的DNA序列與目的DNA片段序列一致。而采用原來的特異性引物(P1、P2)進行多基因座擴增時，由于受到引物與引物間的反應與競爭的影響，其擴增產物的生成量極少，凝膠經染色后譜帶完全無法辨認，擴增效果很差。
利用我們的引物設計方法和全新的結核分支桿菌菌種的多重PCR鑒定方法，我們成功的對100多個不同種類(人型，牛型，鳥型)的臨床樣本進行了檢測，對照正常的樣本和標準的分型樣本，證實利用我們的方法能夠成功的進行分型，實驗結果的可重現性極高。
本發明所涉及的基因組序列表<210>1<211>443<212>DNA<213>細菌(Mycobacterium sapiens)<220>
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權利要求
1.一種鑒定結核分支桿菌菌種的多重PCR的引物設計方法，其特征是按以下方式進行a、分別在能夠與細菌基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5’端加上一段非細菌的基因組序列YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′，從而得到特異性長引物YB1-P1和YB2-P2，以此作為復合擴增過程中第一階段聚合酶鏈反應的引物對，即特異性長引物對；b、直接以非細菌的基因組序列YB1 5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′YB2 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′作為復合擴增第二階段聚合酶鏈反應的引物對，即放量擴增引物對。
全文摘要
一種鑒定結核分支桿菌菌種的多重PCR的引物設計方法，其特征是按以下方式進行a.分別在能夠與細菌基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5’端加上一段非細菌的基因組序列，從而得到特異性長引物YB1－P1和YB2－P2，以此作為復合擴增過程中第一階段聚合酶鏈反應的引物對，即特異性長引物對；b.直接以非細菌的基因組序列作為復合擴增第二階段聚合酶鏈反應的引物對，即放量擴增引物對。
文檔編號C12Q1/68GK1834258SQ200510022138
公開日2006年9月20日 申請日期2005年11月25日 優先權日2005年11月25日
發明者范紅, 應斌武, 王蘭蘭, 文富強 申請人:四川大學華西醫院